NOVA Lite™ Ovary (Primate) IFA Slides
För in-vitro diagnostik
För endast exportera. Inte till försäljning i USA
Produktkod: 508366, 508366.10
CLIA-komplexitet: Hög
Ansökningar
Vävnadssnitt med ovarium från apa avsedd för användning med indirekt immun-fluorescensteknik används för
undersökning av humanserum på förekomst av cirkulerande antikroppar mot steroidproducerande celler.
Sammanfattning och förklaring
Autoantikroppar mot steroidproducerande celler binder till cytoplasmaantigener i steroidproducerande celler i testikulära
Leydig-celler, ovariala Thekaceller såväl som placenta och binjurebark. Dessa IgG antikroppar förekommer hos patienter
med Addisons sjukdom samt hos en del patienter med äggstocks- eller testikel- svikt och/eller i samband med
hypoparatyroidea.1-3
Princip
Objektglasen används i indirekt immunofluorescensteknik, där patientprover och lämpliga kontroller inkuberas med de
fryssnittade preparaten. De antikroppar som inte reagerat tvättas bort och lämpliga fluoresceinmärkta konjugat tillsätts.
Obundet konjugat tvättas bort och objektglasen avläses i ett fluorescens-mikroskop. Positiva prover ger grön fluorescens
på de områden på preparatet där autoantikroppar har bundit.4
Reagens
Vävnadssnitt med ap-ovarium på ett 4-brunnars objektglas, individuellt förpackade i en foliepåse innehållande
fuktabsorberande medel.
Varningar /Försiktighetsåtgärder
Korrekt handhavande och rutiner för avfallshantering bör fastställas för alla potentiellt smittsamma material och endast
personal med fullgod utbildning i sådana metoder skall tillåtas utföra dessa procedurer.
Förvaring och stabilitet
Oöppnade objektglas ska förvaras vid 2-8°C och kan användas fram till det angivna utgångsdatumet. FÅR EJ FRYSAS.
När objektglasen har tagits ur folieförpackningen ska de användas omedelbart.
Provtagning och förberedelse
Blodprover bör tas i rör utan tillsatser genom venpunktion. Efter koaguleringen bör serum avskiljas snarast möjligt för att
förebygga hemolys. Serumet kan förvaras vid 2-8°C upp till 7 dagar före analys6, eller vid längre förvaring, alikvoteras
och förvaras vid -20°C eller lägre. Upprepad frysning och upptining bör undvikas. Mikrobiellt kontaminerade,
hemolyserade eller lipemiska serumprover bör inte användas, eftersom minskade titrar eller otydliga färgningsmönster
kan uppstå.
Metod
Material som ingår
1.
2.
Ovary (Primate) – 1x4 well slide or Ovary (Primate) – 10x4 well slide (Ap-ovarium – 1 x 4 brunnars objektglas
eller Ap-ovarium – 10 x 4 brunnars objektglas).
1 instruktionsblad
Ytterligare material som krävs men som inte medföljer
1.
2.
3.
4.
5.
6.
PBS för provspädning och tvätt.
Behållare för PBS-buffert
Mikropipetter och pipettspetsar för engångsbruk för att tillsätta patientprover.
Fuktkammare för inkuberingssteg.
Fluorescensmikroskop med 495nm excitationsfilter och 515nm barriärfilter.
Sprutflaska i plast för första tvätt med PBS.
Ytterligare tillbehör kan införskaffas från INOVA Diagnostics: PBS (508002), IFA System negativ kontroll (508186),
anti-humant IgG (H+L) ap-adsorberat konjugat (504011, 504071) IgG ap-adsorberat konjugat (508128)
monteringsmedium (508001, 508005, 508006) och 1% Evans Blue (504049), PVA monteringsmedium (504046,
504047).
Analysförfarande
Kvalitetskontroll
Positiva och negativa kontroller bör användas vid alla analystillfällen.
1.
Monteringsmedium: Ta ut monteringsmediet ur kylskåpet så att det når rumstemperatur (18-28ºC) innan det ska
användas.
2.
Spädning av patientprover
Screening: Späd patientprover 1/5 genom att tillsätta 40μL serum i 160μL PBS buffert.
Titrering: Gör flera spädningar av positiva screenade prover med PBS-buffert (t.ex. 1/10, 1/20, 1/40, 1/80
o.s.v.). Till exempel: Tag 100μL av 1/5-spädningen och blanda med 100μL PBS för att få en 1/10-spädning
(upprepa för ytterligare spädning).
3.
Substratobjektglas. Se till att objektglasen når rumstemperatur (18-28°C) innan de tas ur förpackningen. Märk
objektglasen på lämpligt sätt, placera dem i fuktkammaren och tillsätt positiva och negativa kontroller i lämpliga
brunnar. Tillsätt 50-100μL spädda patientprover till de återstående brunnarna.
1
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Inkubering av objektglas. Inkubera objektglasen i 30 minuter i en fuktkammare vid rumstemperatur (18-28°C).
PBS-tvätt. Ta ut objektglasen ur fuktkammaren och skölj dem hastigt med PBS-sprutflaskan. Spruta inte direkt
på brunnarna. Placera objektglasen i ett ställ och sänk ned i PBS och skaka eller rör om i 5-10 minuter.
Tillsats av fluorescerande konjugat. Skaka av överflödigt PBS och torka runt brunnarna. Sätt tillbaka
objektglasen i fuktkammaren igen och täck omedelbart varje brunn med en droppe av fluorescerande konjugat.
TÄCK BRUNNARNA INOM 15 SEKUNDER. Om substratet torkar ut påverkas resultatet markant. Genom
användning av ap-adsorberat konjugat förbättras resultaten avsevärt (t.ex. 504011).
Inkubering av objektglas. Inkubera objektglasen i 30 minuter i en fuktkammare vid rumstemperatur (18-28°C) i
mörker.
PBS-tvätt. Tvätta igen enligt beskrivningen i steg .5. Önskas kontrastfärgning tillsätts 2-3 droppar 1% Evans
Blue per 100mL PBS innan glasen sätts ned.
Montering med täckglas. Tag ett objektglas i taget från PBS-tvätten. Torka snabbt runt brunnarna och tillsätt en
droppe monteringsmedium i varje brunn. Sänk försiktigt ned objektglaset på ett täckglas. Undvik luftbubblor,
men försök inte ta bort dem om de uppstår. Torka bort överflödigt medium från täckglasets kanter.
Avläs objektglasen i fluorescensmikroskop. Objektglasen kan förvaras i upp till 3 dagar i mörker vid 2-8°C utan
någonfluorescens-förlust av betydelse.
Resultat
Kvalitetskontroll
Ett serumprov som innehåller autoantikroppar mot steroidproducerande celler ger en klart grön fluoroescent färg hos
flera celltyper i ovariet. Kanten på positiva Theka interna celler som omger folliklar är lätta att identifiera. En negativ
kontroll bör endast uppvisa en diffus grön färgning utan tydlig fluorescens. Om kontrollerna inte ser ut som ovan skall
analysen inte godkännas och bör köras om.
Tolkning av resultat
Se referenserna 5 för färgfotografi med exempel på detta mönster. Resultaten rapporteras som positiva eller negativa.
OBS! Varje laboratorium bör fastställa egna värden för när ett positivt resultat ska anses vara kliniskt signifikant.
Metodens begränsningar
1.
2.
3.
4.
Ljuskälla, filter och optik i olika sorters fluorescensmikroskop påverkar kitets sensitivitet. Mikroskopets prestanda
påverkas markant av korrekt underhåll, särskilt centrering av kvicksilverlampan och byte av lampan med
rekommenderat tidsintervall.
Eftersom vissa celler i ovariet uttrycker blodgruppssubstanser, kommer sera som innehåller anti-A eller anti-B
blodgruppsantikroppar att uppvisa viss färgning.5 Färgningsmönstret skiljer sig från det som uppvisas med
antikroppar mot steroidproducerande celler.
Reagenserna kan vara lämpliga att använda tillsammans med andra tillverkares IFA-reagens men detta har inte
utvärderats.
En diagnos får inte ställas endast utifrån denna analys. Andra faktorer, som patientens anamnes och andra
serologiska resultat eller biopsiresultat, måste också vägas in.
Sammanfattning av metod
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Se till att monteringsmediet uppnår rumstemperatur.
Späd PBS med destillerat vatten.
Späd patientserum 1/5 med PBS.
Se till att substratobjektglasen uppnår rumstemperatur (18-28°C).
Tillsätt 50μL av positiva och negativa kontroller och spätt patientserum i lämpliga brunnar.
Inkubera i fuktkammare i 30 minuter.
Tvätta i 5-10 minuter i PBS.
Torka runt varje brunn och täck omedelbart med en droppe konjugat.
Inkubera som i steg 6.
Tvätta som i steg 7.
Montera.
Avläs objektglasen i fluorescensmikroskop.
Referenser
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Sotsiou F et al. (1980). Immunofluorescence studies on autoantibodies to steroid-producing cells and to
germline cells in endocrine disease and infertility. Clin. Exp. Immunol. 39, 97-111.
Elder M, et al (1981). Gonadal autoantibodies in patients with hypogonadism and/or Addison's disease. J. Clin.
Endocrinol. Metab. 52, 1137-1142.
Ahonen P et al (1987). Adrenal and steroidal cell antibodies in patients with autoimmune polyglandular disease
type I and risk of adrenocortical and ovarian failure. J. Clin. Endocrinol. Metab. 64, 494-500.
Weller T H & Coons A H (1954). Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster
propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
Bradwell A R et al (2008). Atlas of Tissue Antibodies (Third Edition). Publ. The Binding Site Ltd., Birmingham
UK
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU
Publications, Sheffield. 14.
NOVA Liteär ett varumärke som tillhör INOVA Diagnostics, Inc.
2
Tillverkad av:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (Outside the U.S.) :
00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Auktoriserad representant inom EU:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Germany
Tel.: +49-6894-581020
Fax.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628366SWE
December 2010
Revision 0
3
