Sanquin Reagents
Plesmanlaan 125
1066 CX Amsterdam
The Netherlands
Phone: +31.20.512.3599
Fax: +31.20.512.3570
E-mail: [email protected]
Website: www.sanquinreagents.com
M1174 / August 2006
AGGL
PeliClass human IgG subclass kit
−
REF M1174
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG1
REF M1099
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG2
REF M1101
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG3
REF M1103
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG4
REF M1105
PeliClass
SHP
CONTROL
-
REF M1397
Kit för determinering av humana IgG-subklasser genom det agglutinationstestet (sv)
Ab
sv Antikroppar mot
AGGL
Agglutination
CONTROL
HUM
Kontroll
Human
1
SHP
Får
Negativ
+
Positiv
sv
I.
INTRODUKTION
Hemolytisk sjukdom hos vuxna och nyfödda kan orsakas av närvaron av anti-erytrocytautoantikroppar. Sådana antikroppar som är
bundna till erytrocytmembran in vivo kan detekteras i DAT (direkt antiglobulintest). Om DAT är positivt på grund av IgG-antikroppar är
det viktigt att fastställa antikropparnas IgG-isotyp, då sekvestration av sensibiliserade erytrocyter är beroende av antikroppens IgGsubklass. Detta orsakas av skillnaderna mellan IgG-subklasser i deras förmåga att aktivera komplement och att binda till Fc-receptorer på
fagocytceller. I allmänhet varierar det hemolytiska inflytandet på IgG-subklasserna från hög till låg i följande ordningsföljd:
IgG3>IgG1>IgG2>IgG4.
Hemolytisk sjukdom hos nyfödda (HDN) och autoimmun hemolytisk anemi (AIHA) är två sjukdomar där positiv DAT ses. HDN är en
sjukdom där erytrocyter hos den nyfödda babyn förstörs av antikroppar från modern som riktas mot antigener i babyns röda celler. AIHA
är en autoimmun sjukdom där autoantikroppar produceras till patientens egna erytrocyter.
II.
TEKNISK PRINCIP
Erytrocyter inkuberas med specifika antihumana IgG-subklassreagenser. Om röda celler sensibiliseras (IgG-antikroppar binds till dess yta),
gör det antihumana IgG-subklassantiserumet att cellerna agglutinerar.
Sanquin har utvecklat en sats monospecifika IgG-subklassantiserum som kan användas i en agglutinationsteknik där en mikrotiterplatta
används. I V-formade brunnar av mikrotiterplattor introduceras seriella förtunningar av anti-IgG-subklass specifika antiserum. Därefter
tillsätts (sensibiliserade) erytrocyter. Efter inkubation över natt i 2-8°C placeras mikrotiterplattorna i 60° vinkel. Agglutinationen avläses
makroskopiskt.
III.
FÖRVARING OCH STABILITET
Satsen bör förvaras i –18 till –32 °C. Får ej frysas och tinas upp mer än tre gånger. Använd inte produkten efter det angivna
utgångsdatumet.
Transportförhållandena kan avvika från förvaringsförhållandena.
IV.
SATSENS INNEHÅLL
Satsen innehåller alla komponenter enligt informationen på första sidan i den här bipacksedeln. Komponenterna kan även beställas
separat.
Alla flaskor innehåller 1 mL.
V.
−
−
−
YTTERLIGARE MATERIAL SOM KRÄVS
Mikrotiterplattor
PBS fosfat-salt-buffert
FCS fetalt kalvserum
VI.
HANTERING AV PROVERNA
Blodprov ska tas aseptiskt med eller utan tillsats av antikoagulanter. Om test av blodprov försenas, skall proverna förvaras vid 2-8°C.
Preparation av prover beskrivs i testproceduren.
VII.
TESTPROCEDUR
Procedur som använder mikrotiterplattor (brunnar försedda med V-formade botten).
För att utesluta eventuella falska positiva reaktioner orsakade av konglutinin, rekommenderar vi att normalt fårserum används som
negativ kontroll.
1. Tvätta erytrocyterna 3 gånger med PBS för att utreda och preparera en 0,04% cellsuspension av de tvättade cellerna i PBS.
2. Antiserumet ska alltid användas i trefaldig förtunning, företrädesvis från minst 1:10 till 1:2.430 i PBS som innehåller 5% FCS.
3. Tillsätt 1 droppe av anti-humant serum.
4. Tillsätt 1 droppe av cellsuspensionen.
5. Blanda väl och inkubera över natt i 2-8°C (förslut plattorna).
6. Placera mikrotiterplattorna i en 60° vinkel i 10 minuter.
7. Invertera plattorna i en vinkel på 60° och kör erytrocyterna på nytt i 5-10 minuter.
8. Avläs för agglutination makroskopiskt.
VIII.
RESULTAT OCH TOLKNING AV DATA
Se vidare i tabellen i slutet av denna bipacksedel.
IX.
TEKNISKA SPECIFIKATIONER
a.
Immunogen
IgG-subklasser som isoleras från patologiska serumprover med hjälp av precipitationstekniker, åtföljt av kromatografiska metoder eller
andra avancerade isoleringstekniker.
b.
Rening
Får-anti-humana lgG-subklassreagenser har tillverkats specifikt för den tunga kedjan av lgG-subklassen genom adsorption med isolerade
paraproteiner av de oönskade lgG-subklasserna (1, 2) och, om det behövs, genom absorption med isolerade serumfraktioner. Det erhållna
antiserumet inaktiveras och adsorberas med rhesus positiv A, B och O erytrocyter och buffycoats.
Den negativa kontrollen förenas från serum av flera får och standardiseras för att ge en optimal normal fårserumspool. Den har
absorberats med humana erytrocyter, leukocyter och trombocyter.
c.
Specificitet
−
Hemagglutinationshämningstekniken; Använder som inhibitor en panel av normalt serum, lgG-subklass-deficienta serum och
isolerade lgG-subklassproteiner, alla typbestämda för Ig-allotyper, för att demonstrera närvaron av anti-subklass och antiallotypantikroppar (3, 4).
−
För IgG1 har ingen extra antikropp detekterats.
−
För IgG2, extra antikropp: a-nG4m(b), placering av G4m(b) determinant: IgG4b, nG4m(b) är en isotyp av IgG2 och en allotyp av
IgG4. Därför kan inga slutsatser dras avseende närvaro eller frånvaro av IgG2 om mycket IgG4 detekteras på cellen.
−
För IgG3, extra antikropp: a-nG3m(b). Placering av G3m(b) determinant: IgG3.
2
X.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
RESTRIKTIONER
Användaren ska ha utbildning i och känna till testproceduren.
Använd inget material efter bäst före-datumet på etiketten.
Reagenser från olika batches kan inte bytas ut mot varandra.
Reagensrester ska inte blandas med innehållet i nyöppnade flaskor.
Lock och flaskor får inte bytas ut. Locken ska sättas tillbaka på de rätta flaskorna.
Konserveringsmedel: NaN3 0,1% (w/v).
Avfall ska bortskaffas i enlighet med laboratoriets föreskrifter.
XI.
1.
2.
3.
4.
REFERENSER
Giessen, M. van der, et al., Immunology, 27, 655 (1974).
Goosen, P.C.M., et al., J. Immunol. Methods, 40, 339 (1981).
Engelfriet, C.P., et al., Biotest Bulletin, 1, 2-6 (1986).
Schanfield, M.S., Loghem, E. van, Human Immunoglobulin Allotypes, in Handbook of Experimental Immunology 94, Weir, D.M.
(editor), Blackwell Scientific Publ., 4th edition (1986).
Meulen, F.W. van der, et al., Brit. J. of Haematology, 46, 47 (1980).
5.
-
_
+
3
