Flödescytometri
Hematologi med mikroskop
•
•
•
•
•
•
•
Bürkerkammare eller blodutstryk, Diff
Cellens storlek
Kärnans storlek
Cytoplasmans färg
Eventuella granula, antal och storlek
Räknar ofta 100- 200 celler
Begränsat till vad man ser
1
Automatiserad hematologi
•
•
•
•
•
t.ex. FACS eller Sysmex
Storlek
Eventuella granula
Ytstrukturer (märkta med fluorescens)
Räknar typiskt 5.000 – 300.000 celler på några få
minuter
2
Uppbyggnad, FACScan
D
DATAANALYS
Side
scatter
Ut i slask
Forward
scatter
Laser
D
Bärarvätska
Celler
sugs in
Hydrodynamisk fokusering
3
Ljusspridning
• Forward scatter (FSC)
Ljusspridning
• Side scatter (SSC):
4
SSC
(Granula)
FSC (Cellstorlek)
SSC
Granulocyter
Mycket granula
Granulering
Side scatter
Monocyter
Lymfocyter
Lite granula
Liten cell
Celldiameter (storlek)
Forward scatter
FSC
Stor cell
5
Mycket granula
Granulocyt
Granulering
Side scatter
Monocyt
Lite granula
Lymfocyt
Liten cell
Celldiameter (storlek)
Forward scatter
Stor cell
Flödescytometri 3-partsdiff
granulocyter
lymfocyter
monocyter
6
• Storlek, forward scatter
• Granulering, side scatter
• Fluorescensinmärkning
Uppbyggnad, FACScan
DATAANALYS
Orange fluorescens
Röd fluorescens
D
D
Side
scatter
Ut i slask
D
Grön fluorescens
D
Forward
scatter
Laser
D
Bärarvätska
Celler
sugs in
7
Fluorescensmärkta antikroppar
DIREKT
INDIREKT
Fluorescensmarkörer
• Cellyteproteiner
– Antikroppar märkta med fluorescens
• CD markörer
• Intracellulära proteiner
– Antikroppar märkta med fluorescens
• DNA / RNA
– Fluorescerande kemikalier
• Intracellulära processer
8
CD-markörer
• CD = cluster of differentiation
• Antigen som uttrycks på cellens yta
Celltyp
CD-markör
Leukocyt
CD 45
Monocyter
CD 14
T- lymfocyter
CD 3
B- lymfocyter
CD 19
T- helper celler
CD 4
T- cytotox celler
CD 8
9
CD-markörer
Fluorescens
Antikroppar
med
fluorokrom
10
Olika fluorokromer
• FITC, fluorescein-iso-thio-cyanat (grön)
• PE, phyco-erytrin (orange)
• PerCp (röd)
• Alla dessa kan exciteras vid 488nm
• Emmission: FITC: 530 nm, PE: 575 nm, PerCp: 670 nm
11
Mycket
fluorescens
PE
Lite
fluorescens
Lite fluorescens
FITC
Mycket
fluorescens
Vad kan man mäta?
2-6 parametrar på varje cell eller partikel
– Ljusspridning
• Liten vinkel, FSC (forward scatter)
• Stor vinkel, SSC (side scatter)
– Fluorescens
•
•
•
•
Grön (FITC)
Orange (PE)
Röd (PerCp)
(Blå)
12
Optik och elektronik
Kvalitetskontroll
Förutsättningar
• att instrumentet har tillräcklig känslighet
• att reagensen är reproducerbara
• att provbehandling kan upprepas
• att analysen är reproducerbar
13
Begränsningar
• Dyr utrustning och dyra reagens
• Kräver tränad personal
• Väldigt känsligt system
• Fluorescensen bleks av lasern- man kan inte köra samma prov flera
gånger
Provbehandling
Provtagningsrör - antikoagulantia, ex:
lymfocyter – EDTA, stamceller - ACD lösning
förvaringstid varierar - analys inom 30h
Karlstad - analys inom 6h, ofta snabbare än så
Temperatur: perifert blod 18-22 °C
14
Laboration FACS/Mikroskop
• 3 och 3 labbar ihop
• 2 blodprov, 1 normal, 1 ”onormal”
• 3 metoder: Bürker, Diff, FACS
• Jämföra resultaten och metoderna
Cellytemarkörer, CD
• Allmän leukocytmarkör
– CD45
• Monocytmarkör
– CD14
• Lymfocytsubpopulationer
– CD3 – T-lymfocyter
• CD4
• CD8
Delar upp lymfocyter i T och
B celler
Delar upp T cellerna i hjälparoch cytotox celler
– CD19 – B-lymfocyter
15
Dataanalys I, ljusspridning
Granulering,
Side scatter
granulocyter
monocyter
lymfocyter
Celldiameter (storlek)
Forward scatter
Fortsatt undersökning av lymfocyter
SSC/
granulering
Ni ”gatar” lymfocyterna
granulocyter
monocyter
lymfocyter
FSC/ Celldiameter (storlek)
16
Dataanalys II, fluorescenssignal
Mycket
Fluorescens
(+)
-, +
+,+
Orange
Fluorescens
PE
Lite
Fluorescens
(-)
-, -
Lite
fluorescens
(-)
+, -
Grön
fluorescens
FITC
Mycket
fluorescens ( + )
Dataanalys II, fluorescenssignal
Mycket
Fluorescens
(+)
Orange
Fluorescens
PE
Lite
Fluorescens
(-)
Lite
fluorescens
(-)
Grön
fluorescens
FITC
Mycket
fluorescens ( + )
17
Kontroll
Mycket fluorescens
Markering som skapar
4-fält
< 2% celler i övre, yttre
rutan
Orange
fluorescens
PE
Lite fluorescens
Lite fluorescens
Grön fluorescens FITC
Mycket fluorescens
Identifiera lymfocyter, CD 45 / CD 14
Orange
Fluorescens
PE
Monocyter
CD 14
Markering kopieras från
kontrollröret
Grön fluorescens FITC
Lymfocyter CD 45
18
Lymfocyter
indelning i B- och T-celler
Orange
fluorescens
PE
B-celler
CD19
Markering kopieras från
kontrollröret
Grön fluorescens FITC T-celler CD3
T- lymfocyter
indelning i hjälpar- och cytotox-celler
Orange
fluorescens
PE
CD4
Markering kopieras från
kontrollröret
Grön fluorescens FITC CD8
19
Analys
• Använder programmet CellQuest (gate- statistics)
• Läser ut %-andelen lymfocyter i provet, %-andelen
B- och T- lymfocyter, %-andelen T- helper och Tcytotox
Bedömning
• Jämför metoderna: Bürker, Diff, FACS, Sysmex
• Stämmer resultaten överens?
• Fördelar, nackdelar med respektiva metoder.
Felkällor?
• Examination: Labrapport
20
