Specialfärgningar

Specialfärgningar
Cecilia Ottosson
Laboratoriemetodik, grundläggande vt14
Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin
Litteratur
• Cellular pathology
- kap 7, 8, 9 och 14
- repetition kap 6
Specialfärgningar
• Komplement till H&E
- påvisa närvaro/frånvaro av en viss typ av molekyler
- var på vävnaden är de lokaliserade?
- färgningar/histokemiska färgningar
• Histokemi (vävnadskemi) - lokalisering av olika ämnen i
cellerna
- synligt i mikroskopet
- olöslig produkt
- känsliga metoder
- detektion på plats
Kontroller
• Positiv kontroll
- test av metoden
- bakgrund
- så likt det som ska studeras
- simultant med provet
• Negativ kontroll
Färgning av bindväv
• Kollagen och muskel
-Trikromfärgning
regel: en mindre molekyl kommer att penetrera och färga in vävnaden, men när en
större molekyl kan penetrera samma vävnad kommer den att ersätta den mindre
molekylen
• Retikelfibrer
- Silverimpregnering
- Argyrofil reaktion
Masson trikrom
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Järnhematoxylin
3. PonceauSyrefuchsinlösning
4. Phosphomolybdic/
phosphotungstic syra
5. Anilinblå/Light green
6. Dehydrering och
montering
Kärnor
Muskel, röda blodkroppar
Kollagen
svarta
röda
blå/grön
Van Gieson
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Weigerts hematoxylin
3. Van Gieson (pikrinsyra och
syrefuchsin)
4. Dehydrering och
montering
Kärnor
Muskel, röda blodkroppar
Kollagen
svarta
gula
röd
Gordon and Sweets
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Syrahaltig
kaliumpermanganat
3. Oxalsyra
4. Järnalun
5. Silverlösning
6. Formaldehyd
7. Guldklorid
8. Natriumtiosulfat
9. Dehydrering och
montering
Retikelfibrer
svart
Färgning av kolhydrater
• Påvisandet av polysackarider
- ex glykogen
Färgning av kolhydrater
• PAS (Periodic Acid Schiff)
- perjodsyra – klyvning av kol-kol bindningen  aldehyder
- Schiffs reagens
PAS
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Perjodsyra
3. Schiffs reagens
4. Harris hematoxylin
5. Dehydrering och
montering
PAS-positiv material
Kärnor
magenta
blålila
Färgning av kolhydrater
• AB (Alcian Blue)
- sura mukoplysackarider
- katjon färg → binder till negativt laddade grupper
- differentiering: pH 1 el pH 2,5
• AB-PAS (PAS-AB)
- differentiering mellan neutrala och sura mukopolysackarider
- sura mukopolysackarider – AB- färgning
- neutrala mukopolysackarider – PAS-färgning
- AB före PAS
• PAS-Diastas
- differentiering mellan glykogen och andra mukosubstanser
- diastas (α-amylas) bryter ner glykogenet till glukos
AB
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Alcian blå-lösning med
önskat pH
3. Neutral rött
4. Dehydrering och
montering
Sura muciner
Kärnor
blåa
röda
AB-PAS
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Alcian blå
3. Perjodsyra
4. Schiffs reagens
5. Harris hematoxylin
6. Dehydrering och
montering
Sura muciner
Neutrala muciner
Blandning
Kärnor
blåa
röda
lila
blålila
PAS-Diastas
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Ett snitt i diastaslösning,
ett snitt i avjoniserat
vatten
3. Perjodsyra
4. Schiffs reagens
5. Harris hematoxylin
6. Dehydrering och
montering
Glykogen
Kärnor
magenta i det
obehandlade snittet,
saknas i det behandlade
snittet
blålila
Färgning av fettceller
• Fryssnittning
• Lysokrom-metod
- hydrofoba färger – löslig i fettcellerna
• Neutrala lipider – flytande/halvfast form vid RT
• Kolesterol – kristalliserad vid RT  färgning vid smältpunkten
(150° C)
• Fosfolipider – fosfatgrupp, görs mer hydrofila, ej med
lysokrommetoder
Oil Red O
•
•
Neutrala lipider
Hydrofobisk färg
1. Oil Red O
2. Harris Hematoxylin
3. Montering med
vattenbaserad
monteringsmedel
Fettceller
Kärnor
röda
blålila
Sudan Black
• Kolesterol och fosfolipider
• basisk färg
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Bromlösning
Natrium metabisulfit
70 % Etanol
Sudan Black
70 % Etanol
Carmalum
Montering med
vattenbaserad
monteringsmedel
Neutrala lipider,
fosfolipider och
kolesterol
Kärnor
blå-svarta
röda
Färgning av enzymer
• Fryssnitt/utstryk
• Enzymer
- hydrolaser
- oxireduktaser
• Substrat  primär reaktionsprodukt (PRP)
• PRP + kemiskt ämne  slutlig reaktionsprodukt (SRP)
• SRP – olöslig (precipitat)
Färgning av enzymer
• Hydrolaser – fosfataser
- Gomoris sura fosfataser
- Metallprecipitering
- substrat: natrium -glycerolfosfat
- PRP: natriumfosfat
- SRP: natriumfosfat + bly eller kalcium
visualisering med vätesulfid – svart fällning
• Oxireduktaser - peroxidaser
- substrat: H2O2
- PRP: O2
- SRP: O2 + kromogen (ex DAB)
färgomslag (brun om DAB)
Färgning av pigmenter
• Artefaktspigmenter
• Exogena pigmenter
• Endogena pigmenter
Perls reaktion
• Hemosiderrin (järn)
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. HCl/Kaliumferrocyanid
3. Neutral Red
4. Dehydrering och
montering
Hemosiderrin
Kärnor
blå
röda
Masson-Fontana
• Melanin, argentaffina
granula
• Argentaffin reaktion
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Silverlösning
3. Natriumtiosulfat
4. Neutral Red
5. Dehydrering och
montering
Melanin
Kärnor
svart
röda
Färgning av mikroorganismer
• Formaldehydfixerad material
• Bakterier
• Svamp
• Virus
• Parasiter
Gramfärgning
• Bakterier
• Cellväggens tjocklek
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Kristallviolett
3. Jodlösning
4. Aceton
5. Neutral Red
6. Dehydrering och
montering
Grampositiva
Gramnegativa
blåa
röda
Ziehl-Neelsen
• Syra-fasta organismer
(tuberkulosbakterien)
• Fettrik cellvägg
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Karbolfuchsin
3. HCl-alkohol
4. Metylenblått
5. Dehydrering och
montering
Syra-fasta organismer
Bakgrund
röda
blå
Grocott
• Svamp
• Argentaffin reaktion
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Kromsyra
3. Natriumbisulfit
4. Metenamin silverlösning
5. Guldklorid
6. Natriumtiosulfat
7. Light green
8. Dehydrering och
montering
Svamp
Bakgrund
svart
grön
S-Giemsa
•
•
Helicobacter pylori
Romanowsky
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. S-Giemsa
3. Dehydrering och
montering
Helicobacter pylori
blåa
Färgning av Amyloid
• Onormal protein
• Många former - olika metoder
- jod/svavelsyra
- metylviolett
- Kongo rött
Kongo rött
1. Avparaffinering och
rehydrering
2. Harris hematoxylin
3. Kongo rött
4. Dehydrering och
montering
Amyloid
i polarisationsmikroskop
Kärnor
rosa-rött
äppel grön
blålila