LINKÖPINGS UNIVERSITET
IFM-Kemi
Tentamen i Biokemi 2
TFKE36
2009-05-29, Kl: 14.00-18.00
Skriv namn på alla blad
Skriv endast en uppgift per blad
Redovisa beräkningar och motiveringar
Hjälpmedel: Miniräknare som inte får vara programmerad
Ansvarig lärare:
Magdalena Svensson, 5686 el. 0704-09 09 99
1.a) Du har en proteinextrakt innehållande 4 olika enzymer. Det är enzym B du önskar
rena fram och för vilket du dessutom har en enkel metod att bestämma aktiviteten.
Enzym A
Enzym B
Enzym C
Enzym D
pI
pI
pI
pI
5,5
5,8
7,9
8,0
Mw 22 000
Mw 43 000
Mw 19 000
Mw 44 000
Hur går du till väga för att separera dessa proteiner. Motivera val av
kromatografimetod/er, buffert/ar och elueringsbetingelser. Rita hur ett kromatogram kan
komma att se ut efter varje kromatografisteg. Indikera var i kromatogrammet respektive
protein återfinns. Ange enhet på axlarna i kromatogrammen.
6p
b) Enzym B är ett serinproteas och du studerar dess aktivitets pH-beroende. Hur förväntar
du dig att detta beroende ser ut? Motivera!
3p
c) Du tillverkar en glycinbuffert – vid vilket/vilka pH områden kommer den att fungera
som en buffert.
1p
2.a) Hur påverkas Hb´s syrebindningsförmåga i närvaro av 2,3-BPG (bifosforglycerat)?
Förklara utifrån vad du känner till om Hb struktur och egenskaper.
3p
b) Du vill studera ett enzyms aktiva yta. Du väljer att använda dig av ett gruppspecifikt
reagens. Vad kan fördelen/nackdelan med denna typ av reagens vara jämfört med ett
affinitetsreagens.
2p
c) Förklara uttrycket substratkatalys.
2p
d) Rita mekanismen för ett cysteinproteas klvyning av en peptidbindning.
3p
3.a) ATCas är ett allostert enzym. Vad kännetecknar denna typ av enzymer? Ge en
allmän förklaring och en ATCas-specifik.
3p
b) ATCas aktivitet regleras av närvaro av allosteriska effektorer. Vilka effektorer känner
du till för ATCas och hur påverkar de enzymets aktivitet? Motivera!
4p
c) Proteiner med gemensamt ursprung är homologa. Vilka kriterier använder man sig av
för att bestämma om 2 proteiner är homologa eller inte?
2p
d) Hur kan man tänka sig att olika isoenzymer uppstått under evolutionen?
1p
4. Enzymet laktatdehydrogenas katalyserar följande reaktion:
NAD+ + Laktat NADH + Pyruvat
Det har visat sig att produkten pyruvat kan verka som inhibitor mot substratet laktat. Av
den anledningen utfördes ett kinetikexperiment för att utreda inhiberingsmekanismen.
Härvid kördes 3 försöksserier med och utan inhibitorn pyruvat. (NAD+ hölls konstant på
mättnadsnivå i samtliga fall).
Hastighet (μmol/s)
Vid 0 μM pyruvat
1,88
2,36
3,10
5,81
Laktat (mM)
1,5
2,0
3,0
10,0
Hastighet (μmol/s)
Vid 40 μM pyruvat
1,05
1,34
1,88
4,19
Hastighet (μmol/s)
Vid 80 μM pyruvat
0,73
0,94
1,34
3,27
a) Beräkna Vmax.
(2p)
b) Beräkna KM.
(2p)
c) Beräkna KI.
(3p)
d) Vilken inhiberingstyp ger pyruvat upphov till enligt kinetiken och ange även ett skäl
för detta.
(3p)
5. Kinetiken undersöktes för ett enzym, varvid följande mätdata erhölls:
[S] (mM)
v mmol/min)
2
22
4
60
6
110
10
165
20
200
a) Karakterisera enzymet kinetiskt och beräkna lämpliga kinetiska parametrar.
40
215
7p
b) Enzymkoncentrationen i försöksserien var 0,10 mg/ml och enzymets molvikt var
50 000. Provvolymen var 15 ml. Vad är enzymets kcat.?
3p
Svarsförslag:
1.a) Först gelfiltreringskromatografi – enzym Boch D eluerar först troligen ej
baslinjeseparerade. Tris-buffert med pH runt 7.
Poola fraktioner med enzym B och D. Separera med jonbyteskromatografi. Vid pH 7 är B
–laddat och D + laddat. För att binda in B väljer vi en anjonbytare ekvilibrerad med exvis
Tris-buffert pH med låg jonstyrka. D kommer att rinna rakt igenom kolonnen. B elueras
genom att höja jonstyrkan på bufferten.
b) Asp bör vara deprotoniserad för att kunna dra i H från His. His drar i H från Ser – så
His bör vara deprotoniserad. His pKa normalt 6 så aktiviteten bör vara högst vid basiska
pH.
c) Glycin pKa ~^2 och ~^ 10 buffrar alltså mellan 1-3 och 9-11.
2.a) 2.a) HB allostert protein. Inbindning av syre påverkar inbindning av nästa syre osv.
Hb finns in 2 former R och T, utan syre dominerar T. Ju fler syre som binder desto mer
förskjuts jmv mot R. 2,3-BPG binder till T formen och stabiliserar denna – det krävs
alltså högre halt av syre för att driva jmv. Mot R.
b) Gruppspecifikt bra om inte så mycket kunskap om aktiva ytan. Binder spec sidokedjor
men kan binda även denna typ av kedjor på andra ställen än i aktiva ytan. Aff.märk –
substratanalog binder verkligen till aktiva ytan.
c) Någon för katalysen viktig del (sidokedja) tillhandahålls av substratet.
d) se styer
3,a) Inbindning av substrat 1 påverkar inbindning av substrat 2 till nästa aktiva yta osv.
ATCas katalyserar karbamoylfosfat + aspartat till N-karbamoylaspartat. ATCas binder
karbamoylfosfat först. Mätta enzymet med karbamoylfosfat. Mät produktbildning vid
olika konc av aspartat. Sigmoidkurva. Alltså inbinding av substat till en aktiva yta
påverkar inbindning av substrat till nästa osv. ATCas består av 6 katalytiska subenheter
och 6 regulatoriska.
b) ATP positiv och CTP (UTP) negativ (feedback inhibering). De binder till reulatorisk
subhenhet (finns 6 st). ATCas finns i 2 former R aktiv och T inaktiv. ATP stab R och
CTP stab T.
c) sekvens och struktur.
d) gendupplicering
4.a) Vmax=11,1 μmol/s
b) KM= 7,1 mM
c) KI= 40 μM
d) Eftersom linjerna med och utan I skär på y-axeln är det kompetitiv inhibering. Laktat
och pyruvat är strukturanaloger.
5. a) Vmax 230 mmol/min, positiv kooperativitet.
b) kcat=1,25 x105 s-1
