Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Upprening av Komplex II enzym för inmärkning av kinon bindande
platser och bielektrokemisk analys
Helena Bondesson
Succinate:kinon oxidoreduktas är ett enzym i andnings kedjan som även kallas Komplex II. Hos
eukaryoter finns enzymet i mitokondriens innermembran, som motsvarar cellmembranet hos
prokaryoter. Som namnet antyder oxiderar enzymet succinat från citronsyra cykeln och reducerar
kinon i membranet. Enzymet består av tre eller fyra protein subenheter; En polypetid väger 65 kD och
innehåller en flavin grupp, en polypeptid är 28 kDa och innehåller tre järn svavel kluster och en eller
två polypeptider som fungerar som membranankare och binder de andra två proteinen till membranets
yta.. I bakterien Bacillus subtilis består membranankaret av en polypeptid på 23 kDa som kallas
cytokrom b558 eftersom den innehåller två heme grupper. I detta arbete ville vi undersöka cytokrom b
proteinets egenskaper närmare och ta reda på hur många kinon-bindande platser det finns. Dessutom
ville vi försöka studera elektron överföring mellan det intakta Komplex II enzymet och en elektrod.
Först renade vi fram Komplex II från en stam av B. Subtilis som tillverkar 2-3 gånger så mycket av
detta enzym som normalt. Detta beror på att bakterien innehåller en plasmid med en extra kopia av
generna som kodar för Komplex II. Bakerierna odlas och skördas. Därefter används lysosym så att
cellväggarna går sönder och membranen kan isoleras med hjälp av centrifugering. Membranen
solubiliserades sedan med en detergent så att de membranbundna proteinen fås i lösning. Därefter
separeras de olika proteinen med hjälp av jonbyteskromatografi och gelfiltrering. På de olika
fraktionerna som kommer ut fråm kolonnerna mäter man absorbans vid 280 nm (uppskattar protein
mängd) och 412 nm (uppskattar komplex II innehåll) för att finna de fraktionerna som innehöll mest
Komplex II och minst andra protein. Dessa fraktionerna poolades sedan och koncentrerades.
Man kan identifiera de kinon bindande platserna genom att märka in dem med azido-kinon.
Azidokinonen är stabil i mörker, men när man lyser på den med UV-ljus reagerar den med närliggande
aminosyror och bildar en kovalent bindning. För att azidokinone ska reagera med aminosyror just vid
de kinonbindande platserna, krävs att den liknar den naturliga kinonen så mycket som möjligt. Helst
ska den fungera som ett naturligt substrat för enzymet som skall märkas in. Efter inmärkning
analyserar man enzymets protein med hjälp av mass spektrometri. Om någon peptid blivit tyngre
betyder det att azido kinonen reagerat just här. Vi visade att vår azidikinon fungerade som ett mycket
bra substrat för enzymet. Sedan optimerade vi försöksförhållandena: Vi vill få så mycket specifik
inmärkning som möjligt, utan att enzymet självt förstörs av UV-bestrålningen. Samtidigt vill vi inte
använda så höga halter av azidokinon att den börjar reagera på andra platser än de kinonbindande. Den
mass spektrometriska analysen är fortfarande inte klar när detta skrivs, och därför kan vi ännu inte
berätta hur många kinonbindande platser det fanns.
Det bioelektrokemiska försöken hade också viss framgång och vi lyckades mäta direkt
elektronöverföring mellan det intakta enzymet och en guld elektod täckt av ett thiol-lager. Det behövs
dock fler experiment för att kunna förstå exakt hur enzymet och elektroden interagerar med varandra
Swedish official title: Upprening av Komplex II enzym för inmärkning av kinon bindande platser och
bielektrokemisk analys
Swedish credits: 20p
E-mail address of first author: [email protected]
Supervisor: Cecilia Hägerhäll, biochemistry
Submission date/time: 2002-06-13
Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Purification of Complex II for photoaffinity labeling &
bioelectrochemical analysis
Helena Bondesson
Chemistry, biochemistry
Spring 2002
Abstract in English
Succinat:quinone oxidoreductase, or Complex II of the respiratory chain, consists of three or
four subunits; a 65kDa FAD containing polypeptide, a 28 kDa iron-sulfur cluster containing
polypeptide and a 23 kDa membrane spanning subunit cytochrome b558 that anchors the two
hydrophilic subunits to the membrane. The aim of this work was to identify the quinone
binding sites of the Bacillus subtilis Complex II. First, Complex II was isolated from B.
subtilis membranes to about 95% purity. A newly synthesized azido-quinone worked as a
natural electron acceptor for Complex II, and could thus be used for photoaffinity labeling of
the quinone binding sites. The conditions for such labeling were optimized to prevent both
excess UV damage of the enzyme and unspecific labeling. Samples labeled under different
conditions were prepared and sent to our collaborators at Gothenburg University for mass
spectrometry analysis. We are still awaiting the final results from this analyses. Until then it is
not possible to draw a final conclusion concerning the number and properties of the quinone
binding sites in this Complex II. We also analyzed the cytochrome b558 properties using
bioelectrochemical methods. We could demonstrate direct electron transfer between the intact
Complex II and a thiol coated gold electrode in a specially designed spectroelectrochemical
cell, whereas in previous electrochemical studies of Complex II only the two soluble subunits
have been used.
