Segmentering av celler med
hjälp av aktiva konturer och
level sets
- Modifiering av befintlig algoritm
Abstrakt
Detta projekt är en modifiering av en redan befintlig
algoritm med en hypotes att kunna segmentera celler bättre.
Detta genom att man modifierar metoden till att beräkna
lokala energier för mindre områden än de globala som
beräknas för hela bilden i den befintliga algoritmen.
Modifieringen visade sig vara bättre i vis mån och sämre i
vis mån.
Text: Andreas Andersson, Ali Hedayati, Fredrik Sikén
Bilder: Fredrik Sikén
Matlab implementation: Fredrik Sikén
2
Innehållsförteckning
1. Inledning ............................................................................................................................4
2. Biomedicinsk bakgrund ......................................................................................................5
3. Befintlig metod...................................................................................................................6
3.1 Level set metoden .........................................................................................................6
3.2 Aktiva konturer.............................................................................................................7
3.3 LoG filter......................................................................................................................8
4. Modifierad metod ...............................................................................................................9
4.1 Lokalisera celler..........................................................................................................10
4.2 Olika trösklingsmetoder..............................................................................................10
4.2.1 Otsus trösklingsmetod ..........................................................................................10
4.2.2 Framprovade värden.............................................................................................11
4.3 Undersöka de lokala energierna ..................................................................................12
5. Resultat ............................................................................................................................14
6. Referenser ........................................................................................................................17
3
1. Inledning
Ända sedan det upptäcktes att hjärnceller kan genomgå celldelning för att producera nya
neuroner i en process kallad neurogenes, har de flesta studier inom detta område baserats på
att försöka förstå denna process. Neurogenesen tros bero på de stamceller som finns i den
vuxna hjärnan. Detta ger hopp till dem som lider av hjärnsjukdomar där bristen på hjärnceller
är orsaken till sjukdomen. Stamceller är celler som kan dela sig i många andra celltyper.
Ända sedan forskare använde en kemisk markör för att upptäcka nyligen bildade neuroner har
målet varit att utveckla automatiska bildsystem för att segmentera och spåra cellerna i
bilderna. Man har då använt mikroskop för att följa cellernas rörelse, med avsikt att kunna
följa stamcellernas delning.
Att använda bildanalys för att spåra stamceller har varit ett projekt som startade på Chalmers
2001 och har finansierats av Vetenskapsrådet. Specialister inom neurologi på Sahlgrenska har
höjt frågor som rör expertis från medicinsk bildanalys. Frågorna har handlat om att ta bilder
med hög pålitlighet och kvalitet, att spåra cellerna i en bildsekvens, vart går gränsen för
manuellt arbete och att kunna få fram statistisk viktig information om bilderna. Man vill få
fram en lösning som resulterar i ett användarvänligt verktyg som kan användas i den fortsatta
forskningen.
Projektet vi skulle göra i kursen bioteknisk fysik blev en liten del av vad institutionen för
bildanalys hjälper specialisterna på Sahlgrenska med. Vi fick undersöka en studie som gjorts
angående segmentering och spårning av stamceller med hjälp av en metod som kallas aktiva
konturer som använder sig av level sets. Vi kommer i denna rapport att gå in djupare på denna
metod och beskriva dem mer i detalj.
4
2. Biomedicinsk bakgrund
Stamceller är ospecialiserade celler som har potential och möjlighet att utvecklas till mer
specialiserade celltyper genom en process som kallas differentiering. De har också förmågan
att föröka sig genom celldelning. Forskning på stamceller kan delas i två områden, forskning
på mogna och omogna stamceller. Omogna stamceller härstammar från embryot och har
potential att bli en rad olika specialiserade celler som t.ex. neuroner eller muskelceller. Mogna
stamceller är ospecialiserade celler som finns i specialiserad vävnad. Dom har möjlighet att
bli specialiserade celler i vävnaden de bildades i. Exempel på detta kan vara neuroner,
oligodendrocyter eller astrocyter om det gäller celltyper i hjärnan. De mogna stamcellerna
brukar oftast utveckla ett förstadium till de tre celltyperna vi berättade om innan, kallade
progenitorceller och de är mer specialiserade än stamceller. En annan distinktion är att när
stamceller delar sig så resulterar det i att minst en av de resulterande cellerna kommer ha
samma egenskaper som den ursprungliga, emedan när en progenitorcell delar sig så kan båda
cellerna bli specialiserade celler.
Genom historien har forskare trott att när hjärnan har blivit skadad så finns det ingen
möjlighet för den att reparera det och att utveckling av nya neuroner i hjärnan på en vuxen
människa var omöjlig. Men under de senaste åren har man upptäckt att hjärnan visst ändrar
sig genom livet och kan reparera skador som uppstått i den. Neurogenes, födelsen av nya
neuroner har gett hopp till individer som lider av hjärnsjukdomar där sjukdomen orsakas av
bristen på hjärnceller, exempel på detta är Parkinson, Huntington och Alzheimers.
1960- och 1970-talets forskare upptäckte att vissa delar av hjärnan kunde reparera sig själv.
Vid ett antal studier under denna tid fann man att axoner till neuronerna i hjärnan och
ryggraden kunde återväxa till viss del efter ett trauma. Nyligen, under 1998 fann en man vid
namn Eriksson och hans kollegor på Sahlgrenska Universitets Sjukhus att neuroner i
hippocampus hade återbildats, man fann detta när man studerade död hjärnvävnad.
Hippocampus har hand om regleringen av minne och inlärningsförmåga. Forskare har också
funnit att neurogenes sker i fullvuxna möss, fåglar och andra primater. Forskare studerar nu
hur neurogenes sker naturligt och hur det kan användas i medicinsk behandling.
5
3. Befintlig metod
Den befintliga metoden som ska modifieras bygger på aktiva konturer som i detta fall
använder sig av en level set metod för att hitta celler i bilder som den nedan i figur 3.
Figur 3 Original bild med celler som ska segmenteras
För att den aktiva konturen ska kunna segmentera cellerna så bra som möjligt låter man också
bilden genomgå ett Laplacian of Gaussin filter. Nedan ska varje del av den befintliga metoden
beskrivas i detalj.
3.1 Level set metoden
Metoden bygger på att man tänker sig en kurva som omsluter ett objekt eller en region. Denna
kurva kommer att kommer att röra på sig och förändra sig med en hastighetsfunktion.
Hastighetsfunktionen kan bero på många faktorer bl.a. lokal geometrisk information. Kurvans
front kommer att röra sig med denna hastighetsfunktion och fronten kommer att kunna
förflytta sig både framåt och bakåt. För att kunna hålla koll på denna förändring så skapas en
level set funktion som är en dimension större och tidsberoende. På så sätt så kan man följa
den tidsberoende level set funktionen och dess propagerande i tiden. I varje ögonblick så
kommer fronten ges av nollte level set:en (zero level set) och för att man skall kunna beräkna
rörelseekvationen funktionen antar värdet noll för fronten.
Frontens position vid tidpunkten t ges av zero level set:
φ ( x (t ), t ) = 0
Fördelen med level set metoden är att den klarar hörn och topologiska förändringar väldigt
bra.
6
Figur 3.1 Ett exempel på hur level set funktionen utvecklar sig, fronten kan återfinnas för
φ=0
3.2 Aktiva konturer
Aktiva konturer eller ”snakes” som dem också kallas baseras på att forma en kurva baserat på
olika villkor kring objekt i en bild. Metoden går ut på att man startar med en yttre kurva runt
objektet som sedan söker sig in och sluter kring objektets gränser. Många av dessa metoder
bygger på att man tar hänsyn till gradientskillnader och att man vill minimera den totala
energin längs konturen, både den interna och externa energin tas alltså hänsyn till.
Det gäller att minimera uttrycket:
E (Γ ) = α
2
→
∫
→
u 0 ( x ) − C1 d x +
Γinnanför
∫
→
2
→
u0 ( x ) − C2 d x
Γu tan för
Där u0 är bilden och Γ utgör kurvan. C1 och C2 är medelenergier innanför och utanför kurvan.
Genom att utnyttja level set metoden och utöka energin som ska minimeras med faktorer
såsom objektets längd och area så kan C1 och C2 beräknas:
→
C1 (φ ) =
→
→
∫ u 0 ( x ) H (φ ( x ))d x
→
→
∫ H (φ ( x ))d x
7
→
C 2 (φ ) =
→
→
∫ u0 ( x )(1 − H (φ ( x )))d x
→
→
∫ (1 − H (φ ( x )))d x
Där H är heavisidefunktionen.
3.3 Laplacian of Gaussian (LoG) filter
För att ta bort utsmetningar i bilden så används ett Laplacian of Gaussian (LoG) filter. Den
består egentligen av två filter, ett laplace filter som tittar på bildens andraderivator, dvs. tar
fram de snabba förändringarna i bilden. För att reducera det högfrekventa bruset som kan
bildas så används ett Gaussiskt filter innan laplacianen. Eftersom dessa är linjära filter som
använder faltningsoperationer går det att lägga ihop dessa två filter till ett LoG filter.
x 2 + y 2 − 2σ 2 −
LoG ( x, y ) = −
e
2πσ 6
x2 + y 2
2σ 2
Där σ är filtrets bredd.
Figur 3.3 Ett exempel på en LoG funktion
8
4. Modifierad metod
Då vissa celler klassificeras som samma t.ex. i cellkluster i original metoden, se figur 4-1
nedan (t.ex. klustret längst ner till vänster), så undersöks en ny metod som innebär att man
kontrollerar energierna lokalt för varje enskild cell istället för globalt för alla celler.
Figur 4-1 Celler som klassificeras som samma i ett kluster
Hypotesen är att detta ska medföra en bättre segmentering av cellerna och på så vis kunna
urskilja celler som tidigare blev sammansatta med andra celler.
Metoden fungerar som tidigare beskrivet men med skillnaden att den nu letar reda på alla
celler eller cellkluster i bilden först, för att sedan välja ut enbart dessa områden och behandla
dem som enskilda bilder, som kan ses i figur 4-2.
9
Figur 4-2 Ett mindre område som väljs ut och behandlas på samma sätt som tidigare metoden
4.1 Lokalisera celler
En metod för att lokalisera cellerna eller kluster av celler är med hjälp av funktionen bwlabel i
MATLAB. Algoritmen använder sig av en procedur som beskrivs i referens [3] och fungerar
som följande
1.
Run-length kodar original bilden.
2.
Söker igenom längderna, tilldelar preliminära numreringar och sparar likheter i
numreringarna i en lokal tabell för detta.
3.
Tar mot ekvivalenta klasser.
4.
Döper om längderna baserade på de mottagna ekvivalenta klasserna.
4.2 Olika trösklingsmetoder
Först måste bilden trösklas för att få fram en binär bild för att sedan kunna leta reda på kluster
av ettor. Detta kan göras med hjälp av olika metoder men i detta projekt används Otsus
trösklingsmetod [4] och värden som är framprovade för att ge bra resultat.
4.2.1 Otsus trösklingsmetod
Otsus metod försöker minimera variansen mellan ettor och nollor. Trösklingen med hjälp av
denna metod appliceras på bilden som har genomgått en LoG filter, ett sådant resultat kan ses
i figur 4.2.1.
10
Figur 4.2.1 En bildsekvens som LoG filtrerats och sedan trösklats med Otsus metod
4.2.2 Framprovade värden
Ovan i figur 4.2.1 ser man att Otsus metod inte klarar detta speciellt bra då flertalet celler
försvinner vid tröskling. Det är därför av intresse att undersöka hur bra resultat man får om
man provar fram ett värde och håller detta statiskt för en bildsekvens. Nedan i figur 4.2.2 kan
två olika bilder från samma sekvens ses, en i början och en i slutet av sekvensen, först LoG
bilderna innan de trösklats och sedan efter det att de trösklat med ett framprovat tröskelvärde.
11
Figur 4.2.2 T.v. Bildsekvens som genomgått LoG filter, t.h. samma bild trösklat med
framprovat värde.
Det är en klar förbättring i figur 4.2.2 jämfört med figur 4.2.1 och trösklingen ger även bra
resultat både för bilderna i början och slutet av sekvensen.
4.3 Undersöka de lokala energierna
När trösklingen är klar kan cellernas eller klustrernas placering lokaliseras med metoden
bwlabel beskriven ovan i 4.1 och det rektangulära område som omsluter dessa kan klippas ut.
Detta görs genom att man låter detta område elementvis multipliceras med originalbilden och
LoG bilden och man får då ett resultat som ger den urklippta bilden i figur 4-2. Sedan så
genomförs original metoden med aktiva konturer för att finna konturen på detta nu mindre
område.
För att tydligare visualisera detta så färgkodar vi detta på originalbilden så resultatet syns
tydligare. I figur 4.3 nedan kan en sådan färgkodad bild betraktas.
12
Figur 4.3 Segmenterad och färgkodad bild
13
5. Resultat
Den första mycket avgörande delen av metoden visade sig vara att trösklingen gav bra
resultat. Detta beroende på att placeringen av tröskelvärdet spelar roll då vissa celler kan
komma att förloras, samtidigt som en annan nivå kan medföra att för mycket axon och
dendriter från cellerna kommer med och gör det svårt att urskilja vad som är celler. Nedan i
figur 5-1 kan ses tre bilder, den första innan tröskling, nästa med Otsus metod och den sista
med framprovat värde.
Figur 5-1 ö.t.v LoG av originalbild innan tröskling, ö.t.h Otsus trösklingsmetod, u.t.v.
framprovat tröskelvärde
Det är nu av stort intresse att se ifall denna modifierade metoden gav bättre eller sämre
resultat än original metoden. I figur 5-2 kan resultatet av en bild ses och jämföras mellan den
nya och den gamla metoden.
14
Figur 5-2 Över: segmentering och färgkodning med original metoden, Under: segmentering
och färgkodning med den modifierade metoden.
Man ser i figur 5-2 ovan att vissa celler segmenterats bättre i den modifierade metoden, t.ex.
klustret nere till vänster som nu delats upp i ett kluster om två celler och en ensam cell. I
original metoden var detta ett kluster om tre celler. Andra liknande segmenteringar har skett i
den modifierade metoden. Det finns dock ett fåtal celler som har uteblivit i den modifierade
varianten som är med i original varianten. Detta är givetvis inte alls bra och ofta är det
troligtvis viktigare att identifiera alla celler på något vis, även om de hittas som en och
samma, än att missa någon cell.
15
En annan sak som skiljer de två metoderna ifrån är att den modifierade metoden har visat sig
vara snabbare än original metoden. Detta p.g.a. att då bilden delas upp runt cellerna så medför
det att allt område där det inte är celler inte behöver beräknas. Det sker alltså bara beräkningar
på delar av bilden istället för hela bilden. Samtidigt så blir det lättare för metoden att hitta
cellerna när man valt ut enbart de områden som de finns i.
Sammanfattningsvis kan man säga att den modifierade metoden ibland är bättre och ibland
sämre. Troligtvis kan man modifiera denna så att man kommer att kunna hitta cellerna bättre.
Att man bara plockar ut de delar där cellerna finns och behandlar de styckvis bör medföra att
bättre resultat kan uppnås då man för ett lokalt problem med mer specifika värden kring den
cellen, än en generell för alla celler.
16
6. Referenser
[1] Tony F. Chan, Luminita A. Vese, “Active contours without edges”, IEEE Transactions on
image processing, Vol 10, No.2, Februari 2001
[2] Javier Herrera Rodrigues, “Segmentation and tracking of neural stem cells using level
sets”, Göteborg, Mars 2006
[3] Haralick, Robert M., and Linda G. Shapiro, “Computer and Robot Vision, Volume I”,
Addison-Wesley, 1992, pp. 28-48.
[4] Otsu, N., "A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms", IEEE
Transactions on Systems, Man, and Cybernetics, Vol. 9, No. 1, 1979, pp. 62-66
17
