Ann Thomaeus
Biokemiska studier av ett genetiskt modifierat β-mannanas från
Cellulomonas fimi
I denna studie har en ny, förkortad version, av ett β-mannanas från Cellulomonas fimi
konstruerats, uttryckts och undersökts.
2001 kom Förenade Nationernas klimatpanel fram till att den globala uppvärmningen de
senaste femtio åren beror på en ökad halt av växthusgaser i atmosfären. Den ökade mängden
är en följd av människans förbränning av fossila bränslen. Globalt eftersträvar man att minska
utsläppen varför intresset för förnyelsebara råvaror ökat. Hemicellulosa finns i cellväggarna
hos träd, buskar och växter och är ett av jordens vanligast förekommande organiska polymera
material. Det är en billig förnyelsebar råvara men saknar fortfarande storskaligt
användningsområde. Hemicellulosa är en polysackarid, en kedja av olika sockerarter, vars
kemiska och biologiska egenskaper man hoppas kunna använda inom industrin.
Förhoppningen är att hemicellulosa ska kunna omvandlas till t. ex. etanol eller användas som
grund till nya material. För att naturen sedan inte ska fyllas av denna polymer måste den
brytas ner. Denna nedbrytning kan ske med hjälp av enzymer. Enzymer är proteiner som
påskyndar och underlättar kemiska processer. De enzymer som bryter ner hemicellulosa
kallas hemicellulaser och för att kunna utnyttja hemicellulosan fullt ut måste det forskas även
kring dessa. Hemicellulaser har i sig även de stora potentiella industriella
användningsområden. Idag konkurrerar t. ex. hemicellulaser med miljöfarliga kemikalier vid
blekning av papper.
C. fimi är en bakterie som producerar enzymer som kan bryta ner polysackarider. Ett av
enzymerna som C. fimi utsöndrar är ett β-mannanas. Detta enzym bryter ner huvudkedjan i
den typ av hemicellulosa som till största delen består av sockergruppen mannos. βmannanaset från C. fimi består av fem sammanlänkade delar. Den första delen är en katalytisk
del som bryter den kemiska bindningen mellan mannoserna och är följt av en del som liknar
immunoglobulin vars funktion man inte vet. Den tredje delen fäster enzymet till mannos, den
fjärde delen tros interagera med bakteriens cellvägg och den femte delens funktion är okänd.
För att förstå vilken funktion en del i ett enzym har kan man göra nya enzymer som bara
består av utvalda delar och jämföra dessa med hela enzymet. I denna studie framställdes ett
enzym som enbart består av de tre första delarna i β-mannanaset. Det korta enzymet
jämfördes sedan med fullängdsenzymet bestående av alla fem delar och enzym bestående av
endast de två första delarna. De två sista delarna i β-mannanaset visade sig skydda enzymet
vid höga temperaturer men inte påverka enzymets funktion vid olika pH. I studien
undersöktes även inbindingen till mannos hos enzymet med enbart tre delar. Det visade sig att
stora delar av det nykonstruerade enzymet saknade mannanbindande funktion. Detta kan bero
på proteolys vilket betyder att enzymet då har brytits ner av andra enzymer. Detta hade
kanske kunnat undvikas genom att framställa enzymet under andra förhållanden.
Handledare: Lars Anderson, Henrik Stålbrand
Examensarbete 20 p i biokemi Vt 2005
Institutionen för Kemi, Avdelningen för Biokemi, Lunds universitet
Ann Thomaeus
Construction, Expression and Biochemical Studies of a Truncated βMannanase from Cellulomonas fimi
Hemicellulose polysaccharides, located in the plant cell walls, are after cellulose the most
abundant renewable organic material on Earth. It has great industrial potential and in the last
few decades the market for hemicelluloses, and their degrading enzymes hemicellulases, has
increased tremendously and as a consequence extensive research is needed. To maintain
balance in the ecosystem polysaccharides eventually have to be degraded in nature. Bacteria,
fungi and plants produce polysaccharide-degrading enzymes. Cellulomonas fimi, a
mesophilic, aerobic bacterium capable of degrading polysaccharides are found in
environments rich in decaying plant material. It expresses a full-length β-mannanase (endo- β
-1,4-mannanase, EC 3.2.1.78), Man26A, which randomly cleaves the internal 1,4-β-Dmannosidic linkages within the backbone of mannan. Man26A belongs to glycoside hydrolase
family 26 and consist of a catalytic module, an immunoglobulin-like module, a mannanbinding module, a surface layer homology module, and a module of unknown function. In this
work a truncated version of Man26A consisting of the catalytic module, the immunoblobulinlike module, and the mannan-binding module was constructed. The constructed plasmid also
coded for a His6-tag why purification of the enzyme was done on a His-binding metal
chelating affinity column. The largest part of the expressed and purified enzyme fraction
showed no apparent mannan-binding properties, probably due to misfolding and / or
proteolysis of the enzyme. The truncated β-mannanase, Man26CDmbm showed to be stable in
a pH range between 4.8-8.8 and at temperatures below 30oC. At 40oC around 50% activity of
Man26CDmbm versus control was measured compared with 70% of the activity versus
control detected for Man26A. It seems like the full-length β-mannanase is more stable toward
higher temperatures due to the protecting properties of the modules Man26CDmbm is lacking.
Advisor: Lars Anderson, Henrik Stålbrand
Degree project 20 credits in Biochemistry Spring 2005
Department of Chemistry, Section of Biochemistry, Lund University
