BULLETIN #101 2011 Sep
Direkt 16S analys – Bakteriell identifikation
med 16S rRNA genen direkt från kliniska prover
Direkt 16S analys innebär en ”broad-range” amplifiering av den bakteriella 16S rRNA genen följt av
DNA-sekvensering. Detta är en snabb, säker och odlingsfri metod för bakteriell identifiering direkt från
kliniska prover. Genom att använda en speciell programvara för sekvensanalys, RipSeq®, möjliggörs
också identifiering av multipla bakterier från patienter med blandinfektioner.
VARFÖR DIREKT 16S ANALYS?
NÄR ÄR DIREKT 16S ANALYS BRA?
Diagnostiska metoder för att upptäcka och identifiera bakterier
i ett prov är normalt beroende av förekomsten av livskraftiga
bakterier, som kan odlas på medier i laboratoriet. Metoder, som
är beroende av odling kan ofta vara mindre tillförlitliga än metoder där odling inte behövs, särskilt när en patient har fått en
eller flera doser av antibiotika före provtagning, när transporten
är suboptimal eller när den misstänkta bakterien inte växer på
standardmedier.
Bakteriellt DNA är stabilt och kan finnas kvar i kliniskt material även efter celldöd orsakad av antibakteriell behandling
eller olämplig transport. Viktiga patogener som S. pneumoniae,
bakterier från HACEK-gruppen, anaerober och Haemophilus
influensa, kan vara döda vid ankomsten till laboratoriet. Patogener
som Chlamydia, Mycoplasma, Tropheryma och Erlichia växer
inte eller växer mycket långsamt på standardmedier. Vid blandinfektioner, där upprepad isolering och odling kan ta upp till en
vecka eller mer, tar det också lång tid innan analysresultatet
blir tillgängligt.
16S genen finns i alla bakterier, och kodar för en liten subenhet på ribosomerna. Genen kan användas för att identifiera
samtliga bakterietyper. Till skillnad från artspecifika molekylära tester, behöver läkaren inte känna till den förmodade
patogenen innan provet skickas för sekvensering. Genom att
använda en odlingsfri metod som Direkt 16S, ökar möjligheten
för att hitta den sjukdomsframkallande bakterien, trots osäker
provintegritet, tidigare antibiotikabehandling eller blandinfektion.
De senaste framstegen inom PCR och sekvenseringsteknik
erbjuder en exakt och tidsbesparande metod för detektion och
identifiering. Direkt 16S analys kan upptäcka och identifiera
patogener direkt från kliniskt material (t.ex. hjärtklaffar, abscesser
och pleuralvätska) inom loppet av en dag.
Fördelen med Direkt 16S analys är att metoden är fri från
odlingssteg och därför ger svar på kortare tid jämfört med
konventionella metoder. Direkt 16S är optimal att använda vid
kliniska situationer när:
»» En patient har fått antibiotika före provtagning
»» Man misstänker infektion med atypiska eller anaeroba bakterier
»» Infektionen är orsakad av flera bakterier (blandinfektioner uppstår ofta i t.ex. abcesser)
Direkt 16S analys ger inte information om antibiotikakänslighet
men ger snabb identifiering av förmodad patogen(er) och
därmed vägledning för snabb och riktad antibakteriell behandling.
PROVMATERIAL
Exempel på relevant provmaterial
»» Abscesser i inre organ (hjärna, lunga, mjälte, lever, buk-
spottskörtel, njure, äggstockar, aorta)
»» Retroperitoneala abscesser
»» Djup mjukvävnad eller muskulära abscesser
»» Aspirat / biopsier från spondylodiscitis och andra beninfektioner
»» Sterila kroppsvätskor (pleura-, synovial-, perikardiell- eller spinalvätska, galla)
»» Hjärtklaffar
Exempel på ej relevant provmaterial
RipSeq® Analys av blandinfektioner
»» Prover från områden i direkt kontakt med slemhinnor eller hud (BAL, var från perianala abscesser, vaginala kom-
presser, ytliga sår mm)
»» Mycket små biopsier eller kraftigt utspätt material
Det finns idag analysmjukvara som kan användas direkt efter
sekvensering även om provet innehåller mer än en bakterie.
Analysen tar bara några sekunder och ökar nyttan med sekvensering direkt från primärt kliniskt material. Analysmjukvaran,
RipSeq®, används idag av många laboratorier världen runt.
»» Abscesser / prover från platser i direkt anslutning till tarmen
FÖRSÄNDELSE AV PROVMATERIAL
Prover bör transporteras i sterila behållare utan tillsatser. Sterilt
vatten kan vara kontaminerat med DNA från Pseudomonas arter
och liknande bakterier. I allmänhet rekommenderas ≥200 µl av
flytande material och en “nagels” storlek av fasta prover för att
uppnå optimal känslighet.
Lab-formuläret bör innehålla information om varför du önskar
Direkt 16S analys (t.ex. antibiotika, anaerob infektion, långsamtväxande bakterier, atypiska bakterier eller en potentiell
multibakteriell infektion). Denna information kommer att hjälpa
laboratoriet avgöra vilken analysmetod som är mest lämplig.
FÖR MER INFORMATION
Optimerade protokoll för labanalys av provet (DNA extraktion, val av primer, enzymer) och en web-baserad programvara för
sekvensanalys av single- och multibakteriella infektioner är tillgänglig från Isentio AS (www.isentio.com). Kontakta oss eller ditt
laboratorium så får du mer information om Direkt 16S analys eller RipSeq mjukvaran. Vi kan även berätta om det finns ett laboratorium nära dig som använder RipSeq.
Isentio AS
Dr. Øyvind Kommedal
Medicinsk Chef
[email protected] eller [email protected]
Tel: +47-48192619
www.isentio.com
NYTTIGA REFERENSER
Nedan finns några artiklar med hänvisning till Direkt 16S analys, som ger bakgrundsinformation och visar den kliniska
relevansen av sekvensering.
Comprehensive Diagnostic Strategy for Blood Culture–Negative Endocarditis: A Prospective Study of 819 New Cases
Fournier P-E, Thuny F, Richet H, Lepidi H, Casalta J-P, Arzouni J-P, Maurin M, Célard M, Mainardi J-L, Caus T, Collart F, Habib G, Didier R
Clinical Infectious Diseases 2010; 51(2): 131–140
Comparison of broad-range bacterial PCR and culture of cerebrospinal fluid for diagnosis of community-acquired bacterial meningitis
Welinder-Olsson C, Dotevall L, Hogevik H, Jungnelius R, Trollfors B, Wahl M, Larsson P
Clinical Microbiology and Infection 2007; 13: 879–886
Isentio AS • Thormøhlensgate 51 •
N-5006 Bergen • NORGE • www.isentio.com
Art. nr: P3001
Direct 16S rRNA Gene Sequencing from Clinical Specimens, with Special Focus on Polybacterial Samples and Interpretation of Mixed DNA Chromatograms
Kommedal Ø, Kvello K, Skjåstad R, Langeland N, Wiker H G
Journal of Clinical Microbiology 2009; 47(11): 3562-3568
