UMEÅ UNIVERSITET
KEMISKA INSTITUTIONEN
AL, MH 2011-09-22
Farmaceutisk kemi II
Läkemedelskemi
Läkemedelskemi
Isolering och biologisk testing av en antibakteriell substans
Innehåll:
Riskbedömning
Laborationsinstruktioner:
Del 1, Separation av organiska föreningar
Del 2, Biologisk testning
Riskbedömning
Vid riskbedömningen behandlas normalt nedanstående tio punkter för alla kemikalier
i varje syntes; inte bara för startmaterial utan även för lösningsmedel och produkter.
1. Ämnets toxicitet och klassificering. T.ex. cancer- eller allergiframkallande,
mutagena eller reproduktionstoxiska egenskaper.
2. Kemiska och fysikaliska egenskaper. T ex explosiva, häftiga reaktioner med andra
ämnen, flyktighet, damm. (Ange även kokpunkt/smältpunkt, samt densitet)
3. Hälsorisker, vid t ex inandning och hudkontakt.
4. Första hjälpen, åtgärder vid ögon- och hudkontakt, åtgärder vid inandning eller
sväljning.
5. Risker vid:
normal hantering – det normala arbetssättet
felaktig hantering – eventuella felgrepp
läckage eller spill
fel på utrustning
olyckshändelse
6. Bedömning av risker vid de laborativa momenten. T ex hantering, överföring och
blandning av kemikalier samt upphettning och destillering.
7. Skyddsutrustning och riskbegränsande (förebyggande) åtgärder.
8. Rengöring, sanering, avfallshantering.
9. Sammantagen riskbedömning. Ingående kemikaliers farlighet, laborativa moment
och konsekvenser om något blir fel.
10. Övrigt: märkning, förvaring.
Information om kemikalier kan erhållas från många ställen, t.ex. från olika statliga
organisationer och myndigheter (i Sverige eller i andra länder) och från företag som
saluför kemikalier (Aldrich, Fluka, etc.).
Företag och organisationer som säljer/distribuerar kemikalier är skyldiga att deklarera
kemikaliernas egenskaper m.m. genom varuinformationsblad. Dessa blad är ofta en
bra källa till information. På engelska används ofta förkortningen SDS (safety data
sheet) eller MSDS (materials SDS).
www-servrar:
SDS från www-servrar:
Tre källor med utförlig information om kemiska ämnen ges nedan. Den första
(National Institite for Occupational Safety and Health) har tydlig information, men
endast för 1000-2000 ämnen. Kemikalieföretaget Sigma-Aldrich) uppges täcka över
200,000 ämnen. Var beredd på att länkar ändras då och då.
1.
http://www.ilo.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/in
dex.htm Om länken inte fungerar kan den vara ändrad, och man kan då starta på
websidan
http://www.cdc.gov/niosh och sedan leta efter en rubriker som ’Chemical Safety’,
’Chemical Safety Cards’ och ’MSDS’.
2.
http://www.sigmaaldrich.com
2
Sök direkt från startsidan eller välj en länk för mer avancerad säkning, se nedan.
1) När du har loggat in genom att klicka på Login/eProfile i sidans överkant och gett
lösen, så väljer du lämpligen `Advanced Search´, där det kan vara lämpligt och
enkelt att söka på molekylformel, men det går förstås också att söka på namn
(engelska namn förstås) eller CAS-nummer etc. (CAS = Chemical Abstracts
Service Registry/Number)
Det går även att söka på en ritad molekylformel, men här kan du kanske behöva
viss information från lärare eller assistent.
2) Det första svaret på en sökning är vanligen en sida där du ställs inför valet av olika
renhetsgrad eller kvalitet för föreningen (ASC reagent, puriss, anhydrous/vattenfri
eller annat). Klicka på någon av dem; det spelar vanligen ingen roll vilken. Det är
ändå samma säkerhetsinformation. Nästa svarssida som är
produktinformationssidan har då grå bakgrund och du hittar en liten MSDS-länk
uppe till höger eller till vänster.
3) Web-läsaren måste också tillåta pop-up-fönster. Ifall det skulle vara avstängt så
brukar man få möjlighet att tillåta pop-up tillfälligt. Var också beredd på
datortekniska problem utanför vår kontroll.
3.
http://sis.nlm.nih.gov/chemical.html
Kortfattad kemikalieinformation kan eventuellt även erhållas från:
4.
Kemikalieinspektionen.
Via kemikalieinspektionen kan man få R- och S-koder samt kodernas innebörd för
kemiska ämnen i en av databaserna; se http://www.kemi.se/
3
Farmaceutisk kemi II
Läkemedelskemi
UMEÅ UNIVERSITET
KEMISKA INSITUTIONEN
AL, MH 2011-09-22
Separation av organiska föreningar
Bakgrund:
Syra-bas extraktion är en teknik som används för att stegvis rena fram organiska
föreningar med olika egenskaper från en blandning. Denna typ av exktraktion används
rutinmässigt inom organisk syntes och vid isolering av intressanta föreningar från
växt- och djurriket.
Vid extraktion utnyttjar man det faktum att jonföreningar (föreningar med positiv eller
negativ laddning) ofta har hög vattenlöslighet medans neutrala organiska föreningar
ofta löser sig bättre i ett organiskt (opolärt) lösningsmedel. Eftersom vatten och
många organiska lösningsmedel inte är blandbara med varandra kan man i många fall
separera laddade föreningar från oladdade föreningar genom att använda sig av en
separertratt innehållande både vatten (vattenfas) och ett organiskt lösningsmedel
(organsfas). Genom att ändra pH-värdet I vattenfasen kan man bilda jonföreningar av
neutral föreningar och därmed få dem att övergå från organfasen till vattenfasen.
I denna laboration skall ni separera bensoesyra och sulfamethaxozole från varandra.
Bensoesyra är en förening som är vanligt förekommande i bl.a olika bär och
sulfamethaxozole är ett antibiotikum. Denna lab kan alltså ses som en förenklad
extraktion av en biologisk intressant förening från växtmaterial (ett riktigt växtextrakt
innehåller naturligtvis betydligt fler än 2 föreningar.
CO2H
H2N
S
O
Bensoesyra
pKa = 4,2
N O
O
Sulfametaxozol
pKa ca. 9
4
N
Utförande:
Varje grupp kommer att få 1g av ett pulver som är en blandning av bensoesyra
och sulfametaxozole. Lös upp pulvret i 100 mL etylacetat och för över lösningen till
en separertratt. Tillsätt 50 mL mättad NaHCO3 lösning. Skaka ordentligt och separera
de 2 faserna (vänd separertratten upp och ned mellan skakningarna och öppna kranen
för att släppa ut eventuellt övertryck). Detta är själva extraktionen! Spara
etylacetatfasen (organsfasen) i en kolv och häll tillbaka vattenfasen till separertratten.
Extrahera en gång till genom att tillsätta ytterligare 100 mL etylacetat och upprepa
extraktionen. Kombinera sedan organfaserna och spara vattenfasen i en annan kolv
eller bägare. Torka organfasen genom att tillsätta MgSO4 som är ett torkmedel (låt stå
i ca 20 min) och filtrera sedan bort torkmedlet. Dunsta bort etylacetaten i en
evaporator. Ni har nu isolerat den del av pulvret som är löslig i etylacetat. Är det
bensoesyra eller sulfametaxozole?
Om ni hinner:
Häll tillbaka vattenfasen till separertratten och surgör den genom att försiktigt
tillsätta 100 mL 1M HCl (saltsyra). Kolla pH med indikatorpapper så att det
verkligen blivit surt.
Den sura vattenlösningen extraheras nu på samma sätt som tidigare genom att
tillsätta 100 mL etylacetat, skaka ordentligt och separera de 2 faserna. Var noga med
att släppa ut övertryck i separertratten genom att vända den upp och ned och öppna
kranen med jämna mellanrum! Tillsätta MgSO4 till organfasen, låt stå i 20 min och
dunsta bort etylacetat genom i en evaporator.Vilken av föreningarna har ni nu
isolerat?
5
Biologisk testning
Bakgrund:
Användandet av “Kirby-Bauer disk diffusion”-metoden är en vanlig metod för att
testa om en kemisk substans har antibakteriell effect. I detta test placeras små bitar
filterpapper (6 mm diameter) som är impregnerade med en lösning av den intressanta
substansen på en agarplatta med E. coli bakterier. Man låter sedan bakterierna växa
över en natt och sedan kan man observera i fall det finns områden runt filterpapperen
där bakterierna inte har växt vilket tyder på att substansen är antibakteriell. Stor ”död
zon” kring filterpapperet tyder på hög aktivitet hos substansen medans lite eller ingen
död zon tyder på att substansen inte har antibakteriell effekt.
Utförande:
Väg upp 2-4 mg av den sulfametaxozole ni isolerade i det föregående steget
samt 2-4 mg av kommersiellt tillgänglig sulfametaxozole i sterila eppendorfrör. Lös
upp substanserna i DMSO så ni får en koncentration på 20 mM. Tillsätt 50 µL av
dessa lösningar till 950 µL PBS buffert i 2 nya eppendorfrör. Förbered även en
”blank”, dvs ett prov med endast 50 µL DMSO i 950 µL PBS buffert. Detta är ert
referensprov som inte skall uppvisa någon antibakteriell effekt.
Stryk ut 1-2 kolonier av E. coli på en Mueller-Hinton platta med en bomullstops.
Börja med att göra ett kryss med bakterier över plattan och stryk sedan ut bakterierna
över hela plattan genom att föra bomullstopsen fram och tillbaka över plattan. Placera
3 bitar av filterpapper jämnt utspridda på plattan.
Droppa försiktigt 20 µL av era 3 lösningar på filterpapperen, en lösning på varje
papper. Sätt på ett lock och låt plattan stå i rumstemperatur 30-40 min innan ni
placerar plattan i en inkubator (37oC) 1-2 dagar. Obs! Skriv era namn på plattan och
markera vilken substans som är på respektiva filterpapper.
Jämför sedan hur bakterierna växt kring varje filterpapper. Om ni lyckats väl med
extraktionen skall den ”döda zonen” kring båda filterpapperen med sulfametaxozole
vara lika stor. Om så inte är fallet kan det tyda på att ni fortfarande har kvar en del
bensoesyra i ert prov.
6
