Flöden och drivkrafter
Kontinuitetsekvationen
Tidig metod för affinitetsbestämning:
jämviktsdialys
Koncentrationen av FRI ligand lika i de båda utrymmena!
Ur detta, samt ursprungskoncentrationen av protein och ligand,
kan man beräkna hur mycket ligand som bundits upp av proteinet,
och därmed hur stark bindningskonstanten är (grovt uppskattat).
Men vad händer om vi tar bort membranet
och låter komponenterna flöda fritt?
Följande ekvationer ger oss möjlighet att
skapa analytiska uttryck för diffusion:
Ficks första lag:
Vilket kan formuleras om som:
Och som tillsammans
med Ficks första lag ger
Ficks Andra Lag:
’Drunken Sailor-model’
Hur kan vi använda detta
analytiskt?
• Det är besvärligt att analysera ett spontant
flöde kvantitativt: lättstört (vibrationer mm),
gravitationen påverkar, olika tidsskalor etc
• Vi behöver applicera en yttre kraft på
flödet så att vi kan experimentera
reproducerbart!
Vi kan applicera ett elektriskt fält!
I fältet drivs molekylernas migration av spänningsskillnaden och
molekylerna kommer att migrera beroende på sin laddning:
motkraften är friktionen gånger hastigheten på förflyttningen.
SDS-PAGE, agarosgeler mm är diffusion av
molekyler som drivs av en kraft.
I en SDS-page gel
får alla proteiner en
negativ laddning
proportionell mot
storleken genom
association med
SDS.
I en agarosgel är
alla DNA negativt
laddade.
Isoelektrisk fokussering
•En pH-gradient
används som
drivande kraft.
•Då proteinet är
oladdat upphör
migrationen.
Vi kan använda en stark centrifugalkraft för att
separera olika molekyler preparativt.
Kan vi använda centrifugalkraften som drivkraft
för att analysera molekylers massa?
Vi behöver se hur fort
någonting
sedimenterar för att
bestämma
sedimentationskoefficienten!
Om vi börjar med en kyvett med homogen
koncentration, vad händer när vi centrifugerar?
Analytical
Ultracentrifugation
(AUC) Studies of
Phage ϕ29 Protein p6
Binding to DNA
Två komponenter: 11 kDa
protein samt 170 kDa DNA.
Vilken är vilken? Vad ser vi?
(körningarna gjordes vid 42,000 rpm)
Men vad händer när jämvikt bildas?
Phage ϕ29 Protein p6 Binding to DNA – cont’d
Vad ser vi här, och
varför?
Övre/undre
figuren?
Fortfarande har vi
samma
komponenter i
systemet!
Interaktionsstudier med AUC
Även svaga bindningar kan
studeras om bara
koncentrationer kan uppnås
där komplexet bildas stabilt.
Interaktionsstudier med AUC
Vilka komplex bildas: KID, KIX,
TAX?
Hur sitter KIX-KID-TAX ihop?
Sammanfattning:
• Flödestekniker kräver drivkraft för att vara
analytiskt tillämpliga
• AUC: höga massor, generell metod
• Matematiskt och fysiskt rigorösa
tolkningsmodeller krävs
• Massor och komplexbildning kan
analyseras
Flöden och reaktioner
• Hur kan vi mixa reaktanter för att studera
snabba reaktioner som funktion av tid?
• Vilka tekniska hänsyn måste vi ta?
• Vad kan vi studera?
• Hur kan vi koppla ihop det med tekniker vi
redan kan?
Continuous flow
Vilka nackdelar har metoden?
Stopped-flow
Hur fungerar denna metod i jämförelse m CF?
Vilka fördelar/nackdelar har metoden?
Vilket fel har denna figur som
representant för Stopped Flow?
Quenched-flow
Vissa reaktioner kan inte mätas
spektroskopiskt utan behöver
analyseras batchvis vid olika
tidsdelayer.
Quenched-flow för multireaktant-reaktioner
Hur snabbt veckar sig ett protein?
Vilken roll spelar proliner i folding?
Vilken roll spelar proliner i folding?
Prolin – till - Alanin-mutationer
Stopped/quenced flow:
sammanfattning
• Mängder av tillämpningar, begränsas bara
av detektionssätten!
• Medger mångsidig design av experiment
• Tekniskt och molekylärt pilligt….
• ….men någorlunda enkelt att tolka
• Folding, reaktionskinetik, snabba
processer
