Histokemi och histologiska prov

Histokemi och histologiska prov
Pertti Panula
Institutionen för biomedicin
2013
Alberts 5;
s580
Skala:
makroanatomi,
mikroanatomi
eller histologi,
Öga (glasögon)
Lupp
Ljusmikroskop
EM-skop
EM-skop
cellbiologi,
molekylärbiologi,
Ljusmikroskop
kemi,
(atomfysik)
(partikelfysik)
EM-skop
Biokemi
Kemi
Ljusmikroskopisk histologisk analys: fortfarande
patologens viktigaste verktyg
Levervävnad
immunohistokemi, in situ hybridisering, elektronimikroskopi
kompletterar diagnostik
Typer av prov:
Traditionell
vävnadsbiopsi
Leikataan irti
pala kudosta
Nålbiopsi
Endoskopiska prov
Barretin
ruokatorvi
(metaplasia)
Bestrykningspreparat
Papa-prov
Celler utan färgning
Ingen färgning
Odlad cell i
ljusmikroskop
Samma cell i
faskontrastmikroskop
Samma cell i interferensmikroskop
(Nomarski)
Ingen färgning
Ingen färgning
Organ eller vävnad kan inte
mikroskoperas som sådan;
celllager projiseras på
varandra
Lähde: Alberts
Svårt att se detaljer av cellen
Enbart några korn syns
Cellen och kärnans gränser
syns, mera detaljer
Samma detaljer, men 3D
bild
Lösning: tunna snitt färgas.
Växtrotens tvärsnitt
Jämförelse av ljus- och elektronmikroskop
Ljusmikroskop
silmä
Gartner and Hiat:
Color Textbook of
Histology
Saunders
Fluoresc.
skiva
Okular
Projektionslins
Objektiv
Prov
Kondensor
Ljuskälla
Anod
Katod
Elektroni
mikroskop
(uppochner)
Snitt ”färjas” med
tungmetallsalt:
- Osmiumtetroksid,
silmä
- Uranylacetat
- Blycitrat
Tungmetalllager
strittas elektroner
 Mörk punkt
Framställing av histologiska prov
• Fixering
-oftast med formalin
-fixerar viktiga komponenter, förbereder för behandling
• Förberedning av snittning
-stärckning av vävnaden med paraffin, matrix
-frysning med torris eller flytande kväve
• Snittning
-kryostat, mikrotom, vibratom
Färgning av vävnadsnitt
• Deparaffinering med xylen
• Rehydrering till vattenfas
• Färgning i vatten eller buffertlösning eller
annan lösning som alkohol (tex. hematoxylineosin)
• Täckning av snitt (med plast, glycerol)
Vävnadsbehandlingsapparat
Kuva: Karppinen
Mikrotom för paraffinprov
Kuva: Karppinen
Prov i paraffin
Kuva: Karppinen
Snittning
Kuva: Karppinen
Snitt, ännu skrynkligt
Kuva: Karppinen
Paraffin- eller fryssnitt?
• Paraffinsnitt är bäst för rutinbruk och stora mängder
-prov i rumstemperatur
-passar oftast men inte alltid för immunfärgning
• Fryssnitt snabba och lämpliga för prov under
operationen
-fryssnitt kräver mera teknik och torris eller flytande kväve
-fryssnitt riktigt lämpliga för immunfärgning
• Paraffinsnitt har ofta bättre struktur än ofixerade
fryssnitt
Färgning
Manuell (sidan) eller
automatisk (under).
Paraffin tas bort med
xylen först
Kuva: http://www.ucl.ac.uk/~rmkdhjh/autostnr.htm
Hematoxylin-eosin
Enbart hematoxylin
Enbart eosin
HE
Ross et Pawlina:
Histology. A Text
and Atlas. 5 p 2006
LWW
Histologisk färgning (HE)
1) Hematoxylin är ett blått färgämne. I
lösning inoiseras det till en positiv ion
(kation)
2) I vävnaden är DNA och RNA negativt
laddade efter att ha donerat H+
Väri
+
Väri
+
Väri
+
Väri
Väri
+
+
Väri Väri Väri
Väri
Väri
VäriVäri
Väri
Väri
Väri Väri
Väri
DNA
VäriVäriRNA
VäriVäri
Väri
Väri
Väri Väri
Väri Väri
+ Väri
Väri
Väri
Väri Väri Väri
3) Positivt laddade hematoxylin-ioner binder
till vävnadens negativt laddade element
4) I vävnaden färgas DNA och RNA med
hematoxylin, alkalisk färgämne
 basofilt
Kärnorna är färgade
basofilt
Kerr: Atlas of
Functional Histology.
1st edition, 1999
Mosby
Nucleolus
Är mörk
Kärnans strukturer
H = Heterokromatin är
mörkt
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
E = Eukromatin
är ljust
TEMbild
Nissl korn
Ribosomala
ansamlingar syns i
ljusmikroskop som
basofiliska Nissl
korn
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Neuronen har ett väl
utvecklat RER, med
mycket ribosomer
Lähde: J.F.Kerr, Atlas of
Functional Histology
Hematoxylin
färgar kärnans
DNA och
cytoplasmiskt
RNA
HE
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Ross et Pawlina:
Histology. A Text
and Atlas. 5 p 2006
LWW
Histologisk färgning (HE)
1) Eosin är ett rött färgämne.
Det är syrligt och ioniseras till en
Negativt laddad ion (anion)
Eosiini
-
Eosiini Eosiini
Eosiini
-
-
-
Eosiini
Eosiini
-
-
-
Eosiini-
Eosiini
Eosiini
-
-
- EosiiniEosiini- Eosiini Eosiini -Eosiini
EosiiniEosiini - EosiiniEosiiniEosiiniEosiini-
Eosiini
-
Eosiini
-
Eosiini Eosiini
2) Vävnadsproteinernas aminogrupper laddas
++++++ ++ ++ +
+
+
+
+
+
+
++ +p+++r+o+ +t+++e+i++
+ + ++ +
i+n +i + +
positivt i vattenlösnig
+ +++
+
+
+
+
+
+ +++
+
+
+ ++ ++ ++ ++
+ +++++ ++++ +
+
Eosiini
Histologisk färgning (HE)
1) Eosin är ett rött färgämne.
Det är syrligt och ioniserad till
anioni
2) Proteinernas aminogrupper är
Positivt laddade i vattenlösning
-
Eosiini
Eosiini
-
-
Eosiini
Eosiini
-
-
+
Eosiini
Eosiini
Eosiini Eosiini Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini
Eosiini Eosiini
+ p r o t e i i +n i
+
+
+
3) Negativt laddadt eosin binder till positivt laddade strukturer
(särskilt proteiner)
- Kollagen och cellens stödproteiner, mm
4) I snitten färgas proteinerna
eosinofilt (=acidofilt)
Muslekcellernas proteiner
färgas röda med eosin,
Kärnorna blåa med hematoxylin
Kerr: Atlas
of Functional
Heikki
Hervonen
HistologyHY,
1999,
Mosby
BLL,
2004
Proteinhaltig cytoplasma färgas i
allmänhet eosinofilt
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Svettkörtelcellens cytoplasma
färgas starkt eosinofilt
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Magepitelcellernas och körtelcellernas
cytoplasma färgas starkt eosinofilt
HE-färgade glattmuskelceller
Proteinirik cytoplasma färgas rött, kärnorna i periferin blått
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Också extracellulära proteiner, här
kollagen, färgas med eosin
Föreg. bild
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
fibroblasternas kärnor mellan kollagenfibrer
är basofilt färgade
Slät endoplasmatiskt retikel och
mitokondrier (EM)
Viktiga särskilt för lipidernas och steroidernas metaboli
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Heikki Hervonen
HY, BLL, 2004
Slät endoplasmatisk retikel och
mitokondrier i steroidproducerande celler
M = Mitokondrier innehåller mycket proteiner
eosino/acidofila färgningsegenskaper
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
SER innehåller mindre proteiner
på kanterna
och färgas inte lika starkt
En exokrin cell i bukspottkörteln
Hur färgas cellen med HE?
Kornen innehåller proteiner –
dvs färgas …………….?
Omkring kärnan rikligt med RER
Basdelen färgas………….?
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
En exokrin cell i bokspottkörteln
Kornen har mycket protein och
Färgas eosinofilt
Omkring kärnan mycket
RER:a, bsdelen färgas
basofilt
Körtelstruktur in exokrin pancreas
Basofilt grovt endoplasmatiskt retikel (RER, ribosomer!)
och eosinofila korn (proteiner)
Fettdropparna har lösts från ett
vanligt prov
Fettcellens cytoplasma syns som en
tunn ram
Fett kan färgas med specifika
metoder
= triglyserider
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
N = fettcellens
kärna
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Specialfärgning för elastin
Skiljer elastin från kollagen och intracellulära proteiner
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Elastinet är mörkt
S = glattmuskelcell C = kollagen
Histokemi och enzymhistokemi
• Histokemiska färgningar:
– PAS-färgning för kolhydrerad,
– Alcian-Blue för sura mukopolysakkarider,
– Silversaltbaserade färgningar för retikulinfibrer
och nerver
• Enzymhistokemi utnyttjar cellernas egna
enzym som kan åskådligsgöras
– som substrat används metallsalt, som enzymet
reagerar på och produkten är precipitat som kan
visualiseras i mikroskop
Silverfärgning visar tunna
retikulinfibrer
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
I levern på sinusoiodväggarna
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Lynfnodernas stödvävnad
Kolhydraterna syns inte med
hematoxylin-eosin
Bägarcellernas sekret
(kolhydrater)
syns som det ofärgade
området i epitelet
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
PAS-färgning för kolhydrater
PAS-färgning färgar bägarecellernas
Kålhydrater grannrött
PAS-färgning färgar
Också glycocalyx
Och basalmembranglycoproteiner
PAS =
PeriodicAcidSchiff dvs
perjodsyra-Schiff
Kerr: Atlas of Functional
Histology 1999, Mosby
Immunohistokemi
Bild: Minna Takkunen: Epithelialmesenchymal transition in oral
squamous carcinoma cells.
Avhandling
Immunohistokemi
• Immunohistokemi utnyttjar kroppens egna antikroppar, dvs.
humoral immunrespons
• Djuret immuniseras (vaccineras) med (makro)molekylen
(antigen/immunogen). Denna stimulerar lymfocyter till
produktion av specifika antikroppar och ja minnesceller.
• Upprepade immuniceringar leder till förstärkt respons
• Efter 2-4 immuniseringarkan man dra serum med
antikroppar, som på ett specifikt sätt binder till antigenen
• Monoklonala antikroppar produceras i cellkultur
Antikroppens
struktur
antigeenia sitova alue
Antigen
bindande del
aminotermin
al
Varierande
del
• Två identiska tunga
kädjor och två identiska
lätta kädjor, Y-form
•Y-formade delens
varierande område binder
immunogen
Fab-fragment
kevyt
ketju
raskas
ketju
Fc-fragment
karboxyter
minal
Ross & Pawlina: Histology.
A Text and Atlas,
LWW 2011
Indirekt immunohistokemi
Antigenens
struktur A
Primära
antikroppar:
producerade in
kaninen mot
antigen A
I får producerade
sekundära antikroppar,
som har markör
Alberts et al.:
Molecular Biology
of The Cell
5.ed, 2008
Garland Science
1. Sk. polyklonal kaninantikropp mot antigen A
2. I fåren producerad antikropp mot kaninens antikroppens Fcdel,som är markerad
Markören kan vara
•fluorokrom, tex fluoreskein
•enzymmolekyl
•guldpartikel (EM)
Vimentinfibrer (intermediära filament)
Fibroblast
Immunfärgning i diagnostik: i Lupus-nefrit (njursjukdom)
samlas protein i glomerulus
Virtanen 2009
in situ hybridisering
• Enkel RNA tai DNA kädja (probe, sond) binder
specifikt till motsvarande sekvens (DNA,
mRNA)
• Reaktionen kan ske i lösning, gel eller vävnad
(in situ)
• Reaktionen identifierar kända sekvenser och kan
lokalisera dem i kromosomer/celler/vävnader
• Med hjälp av olika fluorokromer kan man
identifiera flera sekvenser
In situ hybridisering
a. grundelement: DNA-sonden
och målsekvensen
b. Sonden kan märkas direkt med
fluorokromen
c. Sonden och mål-DNA denatureras
för att åstadkomma enkelsträngad
(single stranded) DNA
d. Enkelsträngade DNA-kedjor
binder på varandra
e. Fluorokrom
-markerad sond
syns under mikroskop