Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljörisker vid

Rapport Nr 2007-03
Analys av läkemedelsrester
i fiskblod för att bedöma
miljörisker vid exponering
för avloppsvatten
Joakim Larsson
Jeffrey Brown
Nicklas Paxeus
Lars Förlin
Svenskt Vatten Utveckling
Svenskt Vatten Utveckling
Svenskt Vatten Utveckling (SV-Utveckling) är kommunernas eget FoU-program om kommunal VA-teknik.
Programmet finansieras i sin helhet av kommunerna, vilket är unikt på så sätt att statliga medel tidigare
alltid använts för denna typ av verksamhet.
SV-Utveckling (fd VA-Forsk) initierades gemensamt av Svenska Kommunförbundet och Svenskt Vatten.
Verksamheten påbörjades år 1990. Programmet lägger tonvikten på tillämpad forskning och utveckling
inom det kommunala VA-området. Projekt bedrivs inom hela det VA-tekniska fältet under huvud­
rubrikerna:
Dricksvatten
Ledningsnät
Avloppsvatten
Ekonomi och organisation
Utbildning och information
SV-Utveckling styrs av en kommitté, som utses av styrelsen för Svenskt Vatten AB. För närvarande har
kommittén följande sammansättning:
Anders Lago, ordförande
Olof Bergstedt
Roger Bergström
Daniel Hellström
Stefan Marklund
Mikael Medelberg
Anders Moritz
Peter Stahre
Jan Söderström
Göran Tägtström
Agneta Åkerberg
Södertälje
Göteborgs VA-verk
Svenskt Vatten AB
Stockholm Vatten AB
Luleå
Roslagsvatten AB
Linköping
VA-verket Malmö
Sv Kommunförbundet
Borlänge
Falkenberg
Steinar Nybruket, adjungerad
Thomas Hellström, sekreterare
NORVAR, Norge
Svenskt Vatten AB
Författarna är ensamma ansvariga för rapportens innehåll, varför detta ej kan
åberopas såsom representerande Svenskt Vattens ståndpunkt.
Svenskt Vatten Utveckling
Svenskt Vatten AB
Box 47607
117 94 Stockholm
Tfn 08-506 002 00
Fax 08-506 002 10
[email protected]
www.svensktvatten.se
Svenskt Vatten AB är servicebolag till föreningen Svenskt Vatten.
Svenskt Vatten
Utveckling
Bibliografiska uppgifter för nr
Rapportens titel:
Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljörisker vid exponering
för avloppsvatten
Title of the report:
Analyses of pharmaceuticals in fish blood to assess environmental risks of
exposure to sewage effluents
Rapportens beteckning
Nr i serien:
2007-03
2007-03
Författare:
Joakim Larsson och Jeffrey Brown (Institutionen för Neurovetenskap och
Fysiologi, Sahlgrenska Akademi vid Göteorgs Universitet), Nicklas Paxeus
(GRYYAB), Lars Förlin (Zoologiska Institutionen, Göteborgs Universitet)
Projektnr:
25-108
Projektets namn:
Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljöeffekter av
avloppsvatten
Projektets finansiering:
VA-Forsk, MISTRA, FORMAS, VR
Rapportens omfattning
Sidantal:
Format:
24
A4
Sökord:
Läkemedel, avloppsvatten, fiskblod, modeller, miljörisk
Keywords:
Pharmaceuticals, sewage effluents, fish blood, models, environmental risks
Sammandrag:
En teoretisk modell för biokoncentration av läkemedel i fisk och påföljande
miljöriskbedömning har utvärderats. Studier vid tre reningsverk visar en god
potential för modellen, men också möjligheter för förbättringar.
Abstract:
A model for bioconcentration of pharmaceuticals in fish and subsequent risk
assessment have been evaluated. Studies at three sewage treatment works
show a good potential for the model, but also room for improvement.
Målgrupper:
Branschfolk, myndigheter, forskare, läkemedelsindustri
Omslagsbild:
Provtagning av fiskblod vid Ryaverket. Fotograf: Jeffrey Brown
Rapporten beställs från:
Finns att hämta hem som pdf-fil från Svenskt Vattens hemsida
www.svensktvatten.se
Utgivningsår:
2007
Utgivare:
Svenskt Vatten AB
© Svenskt Vatten AB
Grafisk formgivning: Victoria Björk, Svenskt Vatten
Förord
Det finns en växande oro i samhället kring förekomst av läkemedel i miljön.
Mycket tyder på att den största spridningskällan till miljön är via avloppsvatten
från reningsverk. Det är inte uteslutet att det i framtiden kan komma att ställas
krav på hur effektiva reningsverk skall vara med avseende på att rena bort läkemedelsrester. I Storbritannien pågår redan studier som har syfte att utgöra
underlag för att reglera utsläppen av östrogena ämnen från t.ex. p-piller.
För det flesta läkemedel saknas idag relevanta effekt-studier för att bedöma
sannolikheten för om de nivåer som återfinns har möjlighet att påverka organismer
ute i miljön. Då det finns över 1000 aktiva läkemedelssubstanser enbart på den
svenska marknaden är det en mycket stor uppgift att utföra effekt-studier för
alla dessa. Om vi i steg ett i stället kunde använda oss av teoretiska modeller för
att prioritera vilka läkemedel som har störst risk att ge en miljöpåverkan skulle det
öka våra möjligheter att utföra relevanta effektstudier på de mest högprioriterade
substanserna. Att så tidigt som möjligt få en uppfattning, om än grov, av vilka
läkemedel eller grupper av läkemedel som har störst risk att påverka miljön skulle
vara ett viktigt bidrag för att fokusera diskussioner kring möjliga åtgärder att be­
gränsa spridningen av dessa, inklusive eventuella modifieringar av reningstekniker.
Läkemedelsföretaget Pfizer har föreslagit en enkel modell att beräkna biokoncentration av läkemedel från vatten till fiskblod. Om man jämför koncentrationen
läkemedel i fiskblod med den koncentration som man vet ger farmakologiska
effekter i människa så är tanken att detta skall kunna ge en indikation om det är
sannolikt att läkemedlet ger (farmakologiska) effekter också på vattenlevande djur
vid en given vattenkoncentration.
Vi har testat denna modell praktiskt för fisk exponerad för tre olika avloppsvatten, mätt läkemedelsrester i vattnet och i fiskblod med GC/MS och jämfört
teoretisk framräknade värden med de faktiskt uppmätta för en handfull läkemedel.
Med detta mycket realistiska angreppssätt ville vi göra en första utvärdering av
modellens potential och se om det fanns några uppenbara möjligheter till förbättringar av modellen. Studierna har utförts vid Ryaverket i Göteborg, nedströms
Gråbo reningsverk samt vid Spenshult Reumatikersjukhus. Studierna är sam­
organiserade med ett större MISTRA/FORMAS-finansierat projekt med titeln
”Läkemedel i miljön – utveckling av biologiska fingeravtryck”. Vi vill i denna
delrapport passa på att tacka personal vid Spenshult Reumatikersjukhus (särskilt
Ingemar Petersson och Carl-Gustaf Svensson), GRYYAB, Gråbo reningsverk,
Zoologiska Institutionen (Jari Parkkonen, Eva Albertsson) och Institutionen för
Neurovetenskap och Fysiologi (Lina Gunnarsson, Linda Samuelsson, Linda
Augustsson) vid Göteborgs Universitet för hjälp vid olika delar av projektet. Vi
vill också tacka VA-Forsk, MISTRA, FORMAS och Vetenskapsrådet (Medicin)
för finansiellt stöd.
Göteborg, Februari 2007
Joakim Larsson Jeffrey Brown Nicklas Paxeus Lars Förlin
Innehåll
Förord. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Sammanfattning. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Summary. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1
Introduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2 Material och metod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.1 Fisk. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.2 Studier av upptag av läkemedel i akvarieförsök. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3 Studier vid tre olika reningsverk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3.1 Ryaverket. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3.2 Gråbo reningsverk. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3.3 Spenshult reumatikersjukhus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.4 Kemikalier. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.5 Analys av läkemedel i blodplasma från fisk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.5.1 Extraktion och derivatisering. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.5.2 GM-MS analys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.6 Analys av avloppsvatten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.6.1Fast-fas extraktion, kemisk derivatisering och GC-MS analys. . . . . . . . 15
2.7 Fisk-plasma modellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
3 Resultat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.1 Fältexponeringar – uppmätta läkemedelskoncentrationer. . . . . . . 16
3.2 Fiskblod – uppmätta läkemedelskoncentrationer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3 Jämförelse av beräknade och uppmätta koncentrationer i blodplasma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.4 Riskbedömning/prioritering baserad på fisk-plasma-modellen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4
Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
5
Slutsats. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Referenser. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Sammanfattning
Läkemedel sprids till den akvatiska miljön framför allt via avloppsvatten från
reningsverk. Åtgärdsalternativ för att minska spridningen diskuteras, däribland
möjligheten att anpassa reningsteknologier till läkemedel. För att kunna utvärdera
nyttan med olika möjliga åtgärder är det viktigt att veta vilka läkemedel som utgör
de största miljöriskerna. Tyvärr är kunskapen om miljörisker för de över 1000 olika
läkemedelssubstanser som används i Sverige fortfarande mycket fragmentarisk.
Om vi med hjälp av en teoretisk modell kan prioritera fördjupade forsknings­
insatser för att avgöra vilka läkemedel som verkligen utgör en risk, så vore mycket
vunnet.
En strategi har föreslagits som utnyttjar kunskap om läkemedlens potens från
humana studier; Om koncentrationen läkemedel i blodet hos exponerade vatten­
levande organismer, t.ex. fisk, når ungefär samma nivåer som de terapeutiska
nivåerna i människa så är risken för en farmakologisk påverkan på fisken stor.
Om nivåerna i fisken å andra sidan är 1000-tals gånger lägre än koncentrationer
man vet ger effekt på människor är risken för påverkan på akvatiska organismer
liten.
Vi har i denna studie undersökt hur väl en föreslagen teoretisk modell för
biokoncentration kan förutspå verkliga nivåer i blodplasman på fisk för fem olika
läkemedel. Metoder för att mäta läkemedel i blodplasma i fisk har därför utvärderats. Vi har även gjort en bedömning av risken för en farmakologisk effekt
i exponerade fiskar baserat på en jämförelse med humana terapeutiska koncentrat­
ioner och koncentrationer i fiskens blodplasma. Vi har utfört studier vid tre olika
reningsverk med komplexa avloppsvatten för att i ett tidigt skede kunna identifiera
eventuella brister i en modell när denna appliceras i olika komplexa exponerings­
situtationer.
Överlag överensstämde den teoretiska rankningen av risker med läkemedlen
väl med rankningen baserad på praktiska mätningar utom för ibuprofen vid Rya­
verket där biokoncentrationen underskattades kraftigt. Rankingen stämde också
väl överens in med tidigare observation av effekter av de olika läkemedlen på olika
akvatiska organismer. En mycket viktig observation var att biokoncentrationsfaktorerna varierade betydligt mellan olika exponeringssituationer, trots liknande
vattenkoncentrationer. Sammantaget visar studien på en god potential för den
teoretiska modellen samtidigt som vi har visat att det finns ytterligare, hittills
okända faktorer som det vore önskvärt att kunna ta hänsyn till och därmed öka
modellens precision.
Summary
Pharmaceuticals enter the aquatic environment primarily via effluents from
sewage treatment works. Alternatives to reduce the discharges of pharmaceuticals
are currently discussed, including the possibilities to adapt sewage treatment
technologies to pharmaceuticals. To be able to assess the benefit of different
alternatives, it is important to know which pharmaceuticals that poses the largest
risks to the environment. Unfortunately, the knowledge about the environmental
risk of the over 1000 active pharmaceutical ingredients used in Sweden is still
only fragmentary. If we, with the help of a theoretical model, could prioritize
future research efforts to identify which pharmaceuticals we should be concerned
about, much would be gained.
A strategy has been proposed that takes advantage of the known potency of
drugs based on human studies; If the concentration of a drug in the blood of
aquatic organisms, for example fish, reaches approximately the same levels as the
therapeutic blood levels in humans, then the risk for a pharmacological effect in
the fish is large. However, if the concentrations within the fish are for example
thousand fold lower than the concentrations known to have effects in humans,
then the risk for an effect on aquatic organisms is small.
In this study, we have investigated how well a previously suggested model
for bioconcentration can predict actual concentrations in blood plasma of fish for
five different pharmaceuticals. Methods to analyze these drugs in fish blood plasma
have therefore been developed. We have also assessed the risks for a ­pharmacological
effects in fish based on a comparison with human therapeutic concentrations.
We have performed studies at three different sewage treatment works with complex
effluents. We choose this somewhat elaborate approach in order to be able to
identify potential problems with the theoretical model at an early stage – problems
that eventually would become apparent when applying the model in different,
real, complex exposure scenarios.
Overall, the theoretical model correctly ranked the risks of the individual
pharmaceuticals in comparison with our actual measured data on water and blood
concentrations, with the exception for ibuprofen where the bioconcentration was
severely underestimated at one site. The ranking also agreed with earlier reports
on effects of the investigated pharmaceuticals on different aquatic organisms.
A very important observation was that the bioconcentration factors varied con­
siderably between different exposure situations, despite relatively similar exposure
concentrations. Altogether, the study indicates a good potential for the theoretical
model. At the same time we show that there are other, yet unknown factors that
would be desirable to include in the model and thereby improve its precision.
1
speglar till stor del den som använts för traditionella
industrikemikalier (Cleuvers 2004; Cleuvers 2005,
Hutchinsson et al. 2003) där akuta LC50 eller EC50
tas fram och utifrån denna information beräknas
kronisk toxicitet teoretiskt med hjälp av en justerings­
faktor. Detta är en strategi som har visats otillräcklig
för läkemedel med specifik biologisk aktivitet, och
behovet att bedöma kronisk toxicitet har nu nått betydande acceptans bland såväl myndigheter som
industriföreträdare (EMEA 2006; Williams 2005).
För nyregistrering av medicinska produkter krävs
nu inom EU kroniska tester på vattenloppor och
för fisk är den akuta dödlighetstesten ersatt med
en längre studie av tidiga utvecklingsstadier. Dock
saknas fort­farande krav på livscykeltester på fisk som
tillsammans med groddjur utgör den mest relevanta
av de vattenlevande organismerna baserat på konserv­
ering av målmolekyler för läkemedel. Det är dock
oklart hur alla läkemedel som redan är godkända
skall bedömas ur miljösynpunkt. Enbart på den
svenska marknaden uppgår antalet aktiva substanser
till ca 1200 (Carlsson et al. 2006). Det finns därför
ett brinnande behov av att prioritera forsknings­
insatser.
Relevanta, kroniska effekt-data saknas helt för
nästan alla läkemedel men vi måste ändå göra någon
slags bedömning av riskerna baserade på tillgängliga
data. Att använda fasta justeringsfaktorer från akut
till kronisk toxicitet såsom tidigare gjorts (Fent 2006;
Hutchinsson et al. 2003) har visats sig olämpligt då
det finns en stor risk att man underskattar de möjliga
långtidseffekterna (Sumpter & Johnsson 2005; Fent
et al. 2006). Till skillnad mot t.ex. de flesta industri­
kemikalier så känner vi emellertid till en hel del om
läkemedlens biologiska effekter fån de effektivitets och
toxicitet/säkerhets-studier som utförts på människor
och andra däggdjur när läkemedlen en gång togs
fram. Det finns goda möjligheter att dessa data skulle
kunna användas för en första prioritering av miljöriskerna med läkemedel (Hugget et al. 2005). Om
målmolekylerna för ett läkemedel är konserverade
från människa till en vattenlevande organism (t.ex.
fisk) så är det sannolikt att ungefär samma koncentr­
ation av läkemedlet krävs i kroppen (fiskens eller
människans) för att det skall ge upphov till en
­farmakologisk effekt. En så kallad ”Fisk-PlasmaModell” (FPM) har föreslagits för att dra nytta av
denna stora kunskap om läkemedlens kemiska egen­
skaper och biologiska effekter från olika däggdjursstudier. Genom att utgå från koncentrationen av
Introduktion
Rester av läkemedel återfinns i såväl avloppsvatten
som ytvatten och i vissa fall även dricksvatten
(Heberer 2002; Kümmerer 2004). Detta är en utveckling som har skapat en oro kring möjliga effekter
på miljön (Fent et al. 2006). Nivåerna som detekteras
är vanligen mellan 1 ng/L och 1 µg/L. Endast i
undantagsfall kan man se dramatiska akuta effekter
av sådana nivåer på akvatiska organismer. Exponer­
ingen är å andra sidan mer eller mindre kontinuerlig,
och vissa utvecklingsstadier kan vara mycket känsl­
igare än andra. I de flesta fall saknas studier med
endpoints som man vet är känsliga för ett visst läkemedel, och ofta är det okänt om den eller de arter
man studerat på lab ens har målmolekyler (t.ex.
receptorer) för de undersökta läkemedlen. Fisk och
groddjur är evolutionärt ganska lika oss, och har
också många av de målmolekyler som läkemedlen
är avsedda att verka på (Fent et al. 2006; Huggett et
al. 2003). För många arter som används i toxicitets­
testning (t.ex. vattenloppor) är det mer tveksamt hur
väl konserverade målmolekylerna är. Det leder till
att man kan ifrågasätta om det är lämpligt att extrapolera eventuellt negativa resultat (ingen detekterad
effekt) från t.ex. vattenloppor till andra organism­
grupper som kanske har målmolekyler (såsom fisk).
Östrogen har t.ex. mycket begränsade effekter på
kräftdjur, men även de extremt låga nivåer (kring 1
ng etinylöstradiol/L) som man ofta finner i avloppsvatten kan ha dramatiska effekter på fisk (Purdom
et al. 1994; Desbrow et al. 1998; Larsson et al. 1999;
Jobling et al. 2002). I Storbritannien, där också flest
studier har utförts, har man funnit att feminisering
av fisk nedströms reningsverk som en konsekvens av
östrogenexponering är ett utbrett problem. Läsaren
hänvisas till översikter av Kümmerer (2004), Williams
(2005) och Fent m.fl. (2006) för mer data kring
läkemedels förekomst och effekter i miljön.
Från mitten av nittiotalet har det funnits krav i
Europa på att en miljöriskbedömning skall göras vid
registrering av nya läkemedelsprodukter. Fram till helt
nyligen har fokus på dessa legat på grova akuta effekter
(dödlighet) snarare än subletala effekter eller effekter
vid långtidsexponering. Riskbedömningsprocessen
läkemedel (beräknad eller uppmätt) i vatten tillsammans med kemisk/fysikaliska egenskaper hos
substansen så beräknar modellen en ”steady-state”
fisk-plasma koncentration (FSSPC). Kvoten eller
”effekt-ratio” (ER) mellan FSSPC och den humana
terapeutiska blodplasma-koncentration man vet ger
en effekt i människa (HTPC) ger ett värde på risken
för att man skall få en farmakologisk påverkan på
fisken (Figur 1-1). Om ER≤1 så är koncentrationen
av läkemedel i fiskplasman större eller lika med
koncentrationen som ger en terapeutisk effekt i
människan. Ju lägre ER desto större sannolikhet för
en biologisk respons i fisken. Hugget m.fl. (2004)
gjorde en teoretisk ER beräkning för 28 substanser
uppmätta i ytvatten eller kommunalt avloppsvatten.
Av dessa beräknades etinylöstradiol (den östrogena
substansen i kombinations-p-piller, p-plåster och
p-ringar) och östradiol utgöra störst risk för akvatiska organismer med en beräknad ER på <1. Detta
stämmer väl överens med att man i en lång rad
studier visat att etinylöstradiol och östradiol femin­
iserar fisk nedströms reningsverk (Desbrow 1998;
Larsson 1999; Fent et al. 2006).
Det skall påpekas att det är sannolikheten för en
farmakologisk interaktion som modellen har möjlig­
het att prediktera, inte skadlig effekt. Vissa farmako­
logiska interaktioner leder till skadliga effekter på
individen, andra inte. En förutsättning för att en
skadlig effekt skall uppstå är dock att den föregåtts
av en biologisk interaktion. Om modellen skulle
fungera idealiskt skulle den därför i bästa fall kunna
peka ut en lång rad läkemedel som inte kommer att
påverka akvatiska organismer negativt. Samtidigt
skulle den kunna peka ut en rad läkemedel som ger
upphov till farmakologiska effekter i t.ex. fisk, men
den kan inte skilja mellan vilka av de senare läkemedlen som är skadliga och vilka som påverkar
receptorer etc utan att vara skadliga. Det måste avgöras på annat sätt, t.ex. genom praktiska studier.
Väldigt mycket är dock vunnet om vi kan prioritera
vilka läkemedel som i första hand bör genomgå mer
extensiv testning. Vi ser främst en möjlighet för
prioritering av läkemedel som redan finns på
marknaden, men det är även möjligt att en validerad
modell skulle kunna fungera som en tidig ”trigger”
i en standardiserad miljöriskbedömning för att avgöra i vilken utsträckning vidare testning är nödvändig. Det bör noteras att modellen kan vara helt
teoretisk eller förfinas genom att man i ett relativt
enkelt biokoncentrationsförsök mäter koncentrat­
ionen av läkemedlet i fiskens blodplasma. Modellen
omfattar inga mätningar av några biologiska responser i fisken över huvud taget. Att veta vilken bio­
logisk respons som är lämplig att studera kan ofta
Human terapeutisk plasma
koncentration (HTPC)
”Steady state” plasma
koncentration i fisk (FssPC)
Läkemedelsstudier
Exponering via vatten
Beräknad/uppmätt
biokoncentration
Teoretisk eller uppmätt FssPC
HTPC som ger mätbara effekter
Effekt Ratio (ER) = HTPC / FssPC
Ju lägre ER desto större risk för farmakologiska effekter på fisk
Figur 1-1. Fisk-Plasma-Modellen (anpassad från Huggett et al. (2003)).
10
vara mycket svårt att veta (Larsson et al. 2006), det
kan vara kostsamt att sätta upp mätmetoder för
effektstudier och processen är tyvärr ofta tidsödande.
Som en första ”tier” är därför plasmamodellen mycket
attraktiv.
För att möjliggöra en vidare användning av
plasma-modellen är det nödvändigt att utvärdera den
på flera plan. Det första steget är att utvärdera hur
väl vi teoretiskt kan bedöma koncentrationen av
läkemedel i fiskblod från en given vattenkoncentrat­
ion. Det är detta steg som vi fokuserat på inom
ramen för denna rapport. Nästa steg innebär att man
bör förankra relationen mellan koncentrationen i
human-plasma och en farmakologisk effekt i männ­
iska också återspeglas i fisken. Detta steg omfattar
således mätningar av farmakologiska effekter i fisk,
vilka t.ex. kan vara rent molekylära. I ett tredje steg
vill man gärna få en uppfattning av relationen mellan
farmakologiska effekter och skadliga effekter på
t.ex. tillväxt, överlevnad och fortplantning. Som
tidigare nämnts har inte modellen för sig självt i sin
nuvarande form, potential att skilja mellan skadliga
farmakologisk effekter och mer eller mindre oskad­
liga farmakologiska effekter. Det är möjligt att man
i framtiden kan bygga ut modellen för att även ge in­
formation om detta. Vi bedömer dock att modellen
även utan en sådan potential skulle vara mycket
värdefull om den med god precision kan bedöma
risken för en farmakologisk effekt då den skulle
möjliggöra en fokusering av biologiska effektstudier
mot ett mycket mer begränsat antal substanser än i
dagsläget.
Steg ett av utvärderingen är således att utvärdera
möjligheterna att beräkna biokoncentration för läke­
medel från vatten till fiskblod. Vi är rädda för att
man med ett alltför simplistiskt angreppssätt riskera
förbise problem som blir aktuella när man försöker
applicera en modell på en mer komplicerad verklighet. Försök med ”rent” vatten med tillsatt läkemedel
är en ganska enkel modell (Mimeault et al. 2005;
Schwaiger et al. 2004; Triebskorn et al. 2004). Vi
ville därför redan från början använda en mer real­
istisk exponeringsmodell. Tidigare studier har visat
att biokoncentrering av diklofenak till olika fiskvävnader mycket beror på hur hög koncentrationen
är i omgivande vatten. Vid låga koncentrationer bio­
koncentrerades läkemedlet mycket effektivt, men
koncentrationerna i fisken ökade sedan endast marg­
inellt när vattenkoncentrationerna ökades kraftigt
(Schwaiger et al. 2004; Triebskorn et al. 2004).
Biotillgängligheten för olika läkemedel i vatten kan
också vara betydligt lägre än 100 % beroende på
adsorption till partiklar och kolloider av organiskt
material i vattnet. Flera av de mer fettlösliga läkemedelsubstanserna (t.ex. gemfibrozil och 17α‑ethinyl­
estradiol) vet man binder till partiklar i avlopps­
vatten, vilket också kan vara en betydande faktor för
att avgöra hur väl reningsverket klarar av att avskilja/
bryta ned substansen i fråga. När väl ett läkemedel
har nått recipienten via avloppsvattnet så kan det för­
delas mellan olika faser. Det är välkänt att fördelningen mellan partiklar, kolloider och fullständigt
löst substans påverkar upptaget av många andra
kemikalier, vilket i sin tur påverkar hur toxiska de
är för akvatiska organismer (Haitzer et al. 1998). Om
en substans binder till kolloider tror man att detta
kommer att begränsa transporten över gälarna hos
fisk, så att det i princip endast är den helt lösliga
fraktionen som kan tas upp (Erickson et al. 1990).
Östrogen binder till kolloider i ytvatten (Liu et al.
2005), men data för icke-hormonella läkemedel i
relation till biotillgänglighet och biokoncentration
saknas.
NSAIDs eller ”icke-steroidala anti-inflammator­
iska medel” används i stor utsträckning i hela världen
som smärtstillande medel och för att minska olika
inflammatoriska responser (Figur 1-2, nedan). De
bryts dessutom enbart delvis ned i reningsverken
(20–95 %) (Fent 2006). Man har funnit nivåer av
NSAIDs i ytvatten i Sverige och andra länder i nivåer
mellan 0,01 och 2 µg/L (Ternes 1998; Bendz et al.
2005; Fent et al. 2006). Biokoncentrering av di­
klofenak (en NSAID) i regnbåge (Onchorynhus mykiss)
har påvisats i ­akvariestudier och kroniska effekter har
dokument­erats vid miljörelevanta koncentrationer,
inklusive histopatologiska och cytopatologiska skador
på lever, njurar och gälar (Schwaiger et al. 2004;
Triebskorn et al. 2004). Liknande effekter har visats
i öring (Salmo trutta) (Hoeger et al. 2005). Vi har
tidigare utvecklat mätmetoder för att NSDAIDs i
avloppsvatten (Bendz et al. 2005). Detta tillsammans
med jämförelsevis goda kunskaper kring deras före­
komst och effekter i miljön skulle kunna göra dem
lämpliga för en initial utvärdering av plasmamodellen.
En annan läkemedelssubstans som vi bedömde
som relevant att undersöka var gemfibrozil, en fibrat
som används som blodfett-sänkande medel (figur
1-2, nedan). Man finner ofta att mer än 30 % av detta
läkemedel passerar reningsverken (Fent et al. 2006),
11
visar på såväl potential för modellen som behov av/
möjligheter för förbättringar för att teoretiskt kunna
beräkna biokoncentration för olika läkemedel under
naturliga, komplexa exponeringsförhållanden.
Diklofenak
Log Kow = 4,02
pKa = 4,15
2
Ibuprofen
Material och metod
Log Kow = 3,80
pKa = 4,40
2.1 Fisk
Naproxen
Log Kow = 3,10
pKa = 4,20
Juvenila regnbågar (Oncorhynchus mykiss) av båda
könen införskaffades från en lokal fiskodling i sam­
band med varje försök. Fisken vägde i medel 70 g
och matades inte under försöken dels för att få en
så homogen grupp som möjligt, dels för att tillåta
insamling av galla till parallella studier. Alla studier
var godkända av djurförsöksetisk nämnd (tillstånd
195-2004 till J Larsson). I alla delförsök provtogs
fisken efter att först ha avlivats genom ett slag i
nacken. Blod (0,4–1,5 ml/fisk) togs från kaudalkärlen med en spruta preparerad med heparin för att
undvika koagulation. Efter centrifugering (2 min,
6000 rpm) frystes blodplasman i flytande kväve och
förvarades sedan i –18 °C i väntan på analys.
Ketoprofen
Log Kow = 3,00
pKa = 4,60
Gemfibrozil
Log Kow = 4,80
pKa = 4,80
Figur 1-2. Studerade läkemedelssubstanser i avlopps­
vatten och fiskblod.
vilket resulterar i koncentrationer i miljön mellan 1
ng/L och 1 µg/L (Ternes 1998; Bendz et al. 2005;
Fent et al. 2006). Man har i akvarieförsök visat att
gemfibrozil tas upp över gälarna i guldfisk (Carassius
auratus) och att exponering för miljörelevanta koncentrationer orsakar reducerade nivåer av fiskens
manliga könshormon (testosteron) i blodet (Mimeault
et al. 2005).
Vi rapporterar i denna studie hur en grupp
NSAIDs och gemfibrozil biokoncentreras i fisk.
Uppmätta koncentrationer i fisken jämförs med
beräknade nivåer enligt tidigare föreslagen modell.
Jämförelse med humana terapeutiska koncentrationer
ger en god indikation om vilka av de studerade läke­
medlen som har störst risk att påverka akvatiska
organismer. Resultaten från dessa underökningar
2.2 S
tudier av upptag av
läkemedel i akvarieförsök
Huvudsyftet med den första delstudien var att ut­
värdera om de studerade läkemedlen över huvud
taget tas upp i fisk och se om en fastfas extraktion
(se nedan) fungerar för att extrahera läkemedel som
i blodplasman delvis kan transporteras bundna till
plasmaproteiner (såsom albumin). Därför användes
inte enbart ”spikade” plasmaprover för att testa metod­
iken utan även plasmaprover från fisk som exponerats
via vatten för en blandning av de olika läkemedlen
i ett tvådagars semi-statiskt exponeringsförsök. Fisken
placerades i 35 liters akvarier med luftbubbling där
12
2.3 S
tudier vid tre olika reningsverk
läkemedel tillsattes. Efter 24 h byttes vattnet genom
att ta ut vatten från botten av akvariet med en sifon
(8 l/min) samtidigt som nytt vatten tillsattes i ytan
med samma hastighet. Eter 20 minuter hade 160 liter
flödat genom akvariet vilket betraktades som till­
räckligt. Därefter tillsattes en ny dos med läkemedel
till akvariet och exponeringen fortgick ytterligare
24 h. Nominella exponeringskoncentrationer och
uppmätta nivåer i plasma efter två dygn redovisas i
Tabell 2-1.
Resultaten i Tabell 2-1 visar att de studerade läke­
medlen tas upp i fisk och kan mätas i blodplasma.
Uppmätta värden i detta försök (mycket höga nom­
inella koncentrationer jämfört med realistiska kon­
centrationer i fält) visar att uppmätta plasmakon­
centrationsnvåer var ca 1/10 av beräknade nivåer
enligt plasmamodellen utan hänsyn taget till att en
stor del av läkemedlen sannolikt föreligger i laddad
form (Hugget et al. 2003). För ketoprofen var upp­
mätta koncentrationer knappt en 100-del av be­
räknade nivåer och biokoncentrationsfaktorn var
endast 0,1. Vi vill påpeka att det finns flera skäl att
inte använda dessa biokoncentringsfaktorer för att
beräkna upptag vid mer realistiska exponeringar.
Dels är det ett kort-semistatiskt försök och vi vet
ej om vi har hunnit närma oss jämvikt, dels har vi
inte uppmätt verkliga vattenkoncentrationer (kan
ha påverkats av den ganska höga fisk/vattenvolym
ration), dels är koncentrationerna av läkemedel flera
hundra gånger högre än vad som är uppmätts i
miljön, och det finns skäl att tro, åtminstone för
diklofenak, att biokon­centrationsfaktorn är kon­
centrationsberoende.
De tre studerade reningsverken spänner över väldigt
skilda storlekar och skilda reningsteknologier. Detta
ökar validiteten att extrapolera genererade resultat.
2.3.1 Ryaverket
Ryaverket i Göteborg behandlar avloppsvatten från
ca 570 000 människor och tar också hand om av­
loppsvatten från sjukhus, tvätterier, industrier av olika
storlek, bland annat för produktion av livsmedel,
papper, kemisk industri m.m. Dagvatten behandlas
också i reningsverket. Det inkommande avlopps­
vattnet behandlas via primär sedimentering, kemisk
fosfor-avskiljning, aktiverad slamanläggning och bio­
logisk kvävereduktion. Det renade avloppsvattnet
släpps ut i Göta Älvs mynning via en 1 km lång
tunnel.
Regnbåge exponerades för utgående avloppsvatten
i två rostfria stålburar (30 st 70 g fiskar per bur) i
den utgående bassängen på Ryaverket, precis vid
mynningen till röret som leder ut till Göta Älv. Fisk
(n=10–13 per tillfälle) provtogs vid tidpunkterna
0, 2, 8 och 16 dagar. Vid tidpunkten för försöket
(Februari/Mars 2006) var lufttemperaturen under
0 °C medan vattentemperaturen var i medel 12 °C.
Vid inspektion efter 2 dygn hade en del fisk dött,
sannolikt p.g.a. igentäppning av hål i en av burarna
som lett till begränsad syretillgång. Tätare rengöring
av burarna förhindrade ytterligare dödlighet. Avlopps­
vatten provtogs med hjälp av en tids-proportionerlig
automatisk vattenprovtagare på plats.
Tabell 2-1. Resultat från 48h exponeringsförsök i akvarier med syfte att kvalitativt avgöra om fisk kan ta upp och
koncentrera de studerade läkemedlen i blodplasma
Nominell
exponerings
koncentration
(�����
���
g/l)
Beräknad plasma
koncentration (ng/
ml)
Uppmätt plasma
koncentration
(ng/ml)
Biokoncentreringsfaktor (uppmätt
plasma/nominell)
Ibuprofen
520
41000
4680
9
Naproxen
1000
24200
3640
4
Diklofenak
520
59000
3440
7
Ketoprofen
490
10000
60
0,1
Gemfibrozil
510
215000
32070
63
13
var ca 16 m3/dygn, och det behandlade vattnet släpps
ut i Nissan där det sker en betydande utspädning
(40 m 3/s). Reningsverket har två reningssteg, en
luftad bassäng och en sedimenteringsbassäng om
vardera 60 m3, vilket ger en total retentionstid om
ca 6 dygn vilket är lång tid jämfört med de allra
flesta kommunala reningsverk. Reduktion av BOD,
COD och kväve är i nivå med större reningsverk
medan reningsverkets fosforreduktion inte är lika
bra. Regnbågar exponerades i November 2004 på
Spenshults reningsverk i PVC-kar för avloppsvatten
(50 %) i ett kontinuerligt genomflödessystem där
avloppsvattnet blandades med lika stor mängd vatten
från en närliggande damm (Figur 2-1). Vattentemp­
eraturen under försöket var i genomsnitt 13,6 °C.
Vattenprover togs varannan dag och frystes i väntan
på kemisk analys av läkemedelrester.
2.3.2 Gråbo reningsverk
Gråbo ligger drygt 3 mil NO om Göteborg. Det
lokala reningsverket tar i princip enbart emot av­
loppsvatten från hushåll motsvarande ungefär 4000
personekvivalenter och har konventionell renings­
teknik (inga anaerobiska steg). Regnbåge (två stål­
burar med ca 30 fiskar i varje) placerades ca 20
meter nedströms utloppet. Den genomsnittliga in­
blandningen av avloppsvatten vid denna plats var
ungefär 50 %. Fisk (n=10–13) provtogs efter 1, 2,
8, 16 och 23 dagar. Vattenprover precis i anslutning
till burarna insamlades vid dessa tillfällen i flaskor
och frystes i väntan på analys. Vattentemperaturen
under försöket (Februari/Mars 2006) var ca 2 °C.
Inga döda fiskar påträffades.
2.3.3 Spenshult reumatikersjukhus
2.4 Kemikalier
Spenshult reumatikersjukhus nära Halmstad är ett
sjukhus med knappt 200 behandlingsplatser som er­
bjuder specialiserad vård till patienter med reumat­
iska sjukdomar. Då sjukhuset har ett eget renings­
verk erbjuder det tämligen unika möjligheter att
studera ett reningsverk som belastas med, åtminstone
för vissa läkemedel, relativt höga inkommande kon­
centrationer jämfört med ett vanligt kommunalt
reningsverk. Flödet genom reningsverket under 2004
Referenssubstanser (renhet >97 %) köptes från
Sigma-Aldrich och Promochem Standard Supplies.
Lösningsmedel och vatten var av HPCL-kvalitet
(Rathburn, Scotland). Myrsyra, pentafluorobenzyl
bromide (PFBBr) och triethylamin var of purriskvalitet (Fluka).
Figur 2-1. Exponeringsanläggning på reningsverket vid Spenshult reumatikersjukhus.
14
2.5 A
nalys av läkemedel i
blodplasma från fisk
karakteristiska joners relativa intensitet jämfört med
derviatiserade autentiska standarder. De jonfragment
som användes för detektion och kvantifiering (under­
strukna) var: ibuprofen (161; 386), gemfibrozil (309;
430), naproxen (185; 410), diclofenac (214; 475; 477)
och ketoprofen (209; 434) samt för interna stand­
arder – klofibrat (128; 394) och flurbiprofen (199;
424). Kalibrering utfördes genom att tillsätta (spika)
standarder i fiskplasma (från oexponerad fisk) och
behandling av spikade prover på samma sätt som
övriga prover. Prover kvantifierades m ha av en 5–6
punkters kalibrering per substans. Detektionsgränsen
för metoden definierades som en area under kurvan
som var tre gånger större än bakgrundsbruset. Blank­
prover av bland annat plasma från oexponerade
fiskar och olika reagenser som processats på samma
sätt som proverna uppvisade inga spår av läkemedel
vid något tillfälle.
2.5.1 Extraktion och derivatisering
Utspädd blodplasma (300 µl spätt i 900 µl 1 % myr­
syra samt internstandarder) extraherades med hjälp
av Evolute™ ABN 25 mg fast-fas extraktions kolonner
(Argonaut Technologies, Tokyo) som pre‑kondition­
erats with 1 ml metanol och 1 ml 0,1 % myrsyra
(löst i vatten). Interfererande substanser eluerades
med 5 % metanol i vatten och läkemedlen eluerades
med 1 ml metanol. Efter vakuumtorkning löstes
extrakten i 1 ml aceton och överfördes till 1,5 ml GC
rör varefter de intorkades under kvävgas. Toluen
(200 µl) med 2 % PFBBr plus 8 µl triethylamin som
katalysator tillsattes för att derivatisera läkemedlen
vid 100 oC i 1 h (Reddersen et al. 2003). Derivat­
iserade extrakt indunstades under kvävgas, varefter
1 ml toluen tillsattes och partiklar avlägsnades med
hjälp av filtrering (0,45 µm ”PTFE syringe filters”).
Efter ytterligare en omgång industning under kväv­
gas tillsattes återigen 100 µl toluen och proverna
överfördes till 250 µl glasbehållare inför analys.
2.6 Analys av avloppsvatten
2.6.1Fast-fas extraktion, kemisk
derivatisering och GC-MS analys
Metoder för extration och analys av avloppsvatten
och ytvatten har beskrivits tidigare (Paxeus 2004).
Korfattat så extraherades proverna med hjälp av
RP‑C18 (6 ml, 1 g sorbent) fast-fas extraktions
kolonner (IST Inc, UK) och eluerades med 10 ml
aceton. Efter industning över kväve derivatiserades
provet (metylerades) med metylkloroformat. Analys
med GC-MS utfördes enligt ovan men med ett
temperaturprogram och karakteristiska joner som
beskrivits tidigare av Paxeus (2004).
2.5.2 GM-MS analys
PFBBr derivativaten analyserades på en GCQ Plus
(ThermoFinnigan, USA), utrustad med en A200S
autoinjektor (CTC Analytics, Switzerland) och en
VF-200ms kolonn (factor FOUR, 30 m x 0.25 mm,
0.25 µm bonded phase) från Varian Inc. (USA).
Injectorn kördes in splitless mode vid 275 oC. Tryck
och temperatur hos gaskromatografen var enligt
följande: konstant hastighet om 40 cm/s He; initial
temperatur 80 o C konstant i 2 min; 30 o C/min
höjning till 180 oC följt av konstant temperatur i
2 min; 3 °C/min höjning till 205 °C och konstant
temperatur i 1 min; 10 °C/min höjning till 260 °C
och konstant temperatur i 5 min; 20 °C/min höjning
till 300 °C och konstant temperatur i 10 min.
Jonkällan och transfer line temperaturer var 175 °C
respektive 250 °C. Mass-data med elektron jonisering
vid 70 eV insamlades i full-scan mode. Identifiering
gjordes genom att jämföra retentionstider och
2.7 Fisk-plasma modellen
Teoretiska plasmakoncentrationer (steady-state) i fisk
har beräknats enligt Hugget m.fl. 2003. I modellen
så beräknas biokoncentrationen av läkemedel till
blodplasman. Fördelningen mellan vattenfasen och
15
3
blodet är baserat på en ekvations som är framtagen
av Fitzimmons m.fl. (2001):
Resultat
log Pblood:water = 0,73 x log Kow – 0,88
3.1 F
ältexponeringar – uppmätta
läkemedelskoncentrationer
I ekvationen är Pblood:water ekvivalent med biokon­
centrationsfaktorn (BCF), och Kow är läkemedels
oktanol:vatten-fördelningskoefficient, som i sin tur
är ett mått på läkemedlets hydrofobicitet. En
“steady‑state” plasma-koncentration för en expon­
erad fisk (FssPC) räknas sedan enkelt ut som pro­
dukten av Pblood:water och exponeringskoncentrat­
ionen enligt:
Medelkoncentrationen för varje läkemedel i det
vatten som fiskarena exponerades för under försöks­
tiden (14–23 dygn) vid de tre olika reningsverken
anges i Tabell 3-1.
De uppmätta exponeringskoncentrationerna för de
olika läkemedelssubstanserna varierade på lite olika
sätt mellan de olika reningsverken. Notera att fisken
vid Ryaverket exponerades för 100 % avloppsvatten
medan fisken i Spenshult och Gråbo exponerades för
ca 50 % avloppsvatten. Angivna värden i tabellen
syftar på det utspädda avloppsvattnet. Om man
räknar tillbaka till 100 % avloppsvatten så var
nivåerna av gemfibrozil och ketoprofen mest lika
mellan reningsverken, följt av diklofenak (överrepre­
senterat vid Ryaverket) och naproxen (underrepre­
senterat vid Ryaverket). För ibuprofen, som är ett
läkemedel som används i stora mängder men bryts
ned ganska lätt, var skillnaderna störst, med de
högsta nivåerna i Spenshult och lägsta i Ryaverket.
FssPC = exponeringskoncentration (µg/l) x Pblood:water
Som en första tier är det ofta bättre att ha en kon­
servativ modell än en icke-konservativ. Vi har därför
i denna studie valt att inte korrigera det teoretiskt
beräknade upptaget i fisk för substansernas pKa
värden utan har utgått från ett ”worst-case” d.v.s. att
substanserna föreligger till 100 % i oladdad form. Vi
har använts oss av de lägsta humana Cmax värdena
(maximal uppmätt koncentration efter en normal
dosering) som vi kunnat finna i litteraturen.
Tabell 3-1. Uppmätta exponeringskoncentrationer (µg/l) för de olika läkemedelssubstanserna vid de tre renings­
verken (medel ± standardavvikelse).
Aktiv substans
Reningsverk
Ryaverket
a
nedströms Gråbo
Spenshult (50 %)
Ibuprofen
0,0045 (0,0027)
0,014 (0,013)
0,048 (0,029)
Naproxen
0,25 (0,17)
0,68 (0,33)
0,043 (0,016)
Diklofenak
2,32 (0,48)
0,64 (0,28)
0,28 (0,08)
Ketoprofen
0,28 (0,18)
0,10 (0,04)
0,23 (0,08)
Gemfibrozil
1,05 (0,25)
0,54 (0,23)
Approx. 1–5a
Interferens med en fettsyra med lång kolkedja förhindrade en säker kvantifiering.
16
3.2 F
iskblod – uppmätta
läkemedelskoncentrationer
3.3 J ämförelse av beräknade och
uppmätta koncentrationer i
blodplasma
Trots med lätthet uppmätta mängder av ketoprofen
i vattnet vid alla reningsverken kunde inte denna
substans detekteras i blodplasman på någon plats
vid någon tidpunkt (5–6 fiskar analyserade per tid­
punkt och plats). Detta stämmer med resultaten från
akvariestudien som visade på en förhållandevis låg
biokoncentrationsfaktor om 0,1. Alla andra NSAIDs
samt gemfibrozil kunde detekteras i blodplasma från
fisk exponerad vid Ryaverket (Tabell 3-2). Förutom
gemfibrozil som återfanns i blodplasman hos fisk i
Spenshult kunde inget annat läkemedel detekteras i
fisk exponerad nedströms Gråbo reningsverk eller vid
Spenshult (Tabell 3-2). Vid Ryaverket var uppmätta
halter av alla läkemedlen i blodplasman ungefär lika
höga vid det första mättillfället (2 dygns exponering)
som efter 8 respektive 16 dygn, vilket tyder på att
steady state uppnåddes inom 2 dygn. Medelvärden
för Ryaverket i Tabell 3-2 är ett medelvärde av alla
tre provtagningarna.
Vid en jämförelse av beräknade biokoncentrations­
faktorer från plasmamodellen (baserat på fettlöslighet
enbart) så stämmer uppmätta biokoncentrations­
faktorer för naproxen och gemfibrozil beräknade via
uppmätta nivåer från försöket vid Ryaverket ganska
bra överens (Tabell 3-3). Då vi inte kunde detektera
ketoprofen har vi inget jämförelsevärde för denna
substans, men om plasmakoncentrationerna skulle
ligga strax under detektionsgränsen är detta inte
långt under beräknade nivåer för modellen. För di­
klofenak var den uppmätta biokoncentrationsfaktorn
vid Ryaverket drygt 20 ggr lägre än den modellerade,
och för ibuprofen drygt 200 ggr högre än modellerade
värden. I fisk från Gråbo och Spenshult kunde inte
ibuprofen detekteras alls. Det tyder på en mycket lägre
biokoncentrationsfaktor än vid Rayverksförsöket.
Gemfibrozil uppvisade en låg biokoncentrations­
faktor vid Spenshult jämfört med såväl modellerade
data som uppmätt biokoncentration vid Ryaverket.
Tabell 3-2. Uppmätta koncentrationer av läkemedelssubstanser i blodplasma (ng/ml) hos fisk exponerad för
avloppsvatten (medel ± standardavvikelse).
Aktiv substans
Exponeringsplats
Ryaverket
nedströms Gråbo
Spenshult (50 %)
Ibuprofen
84 (62)
<mdl
<mdl
Naproxen
14 (9)
<mdl
<mdl
Diklofenak
12 (14)
<mdl
<mdl
Ketoprofen
<mdl
<mdl
<mdl
Gemfibrozil
210 (400)
<mdl
8,0 (5,5)
<mdl = mindre än metodens detektionsgräns, det vill säga ca <3 ng/ml.
Tabell 3-3. Beräknade biokoncentrationsfaktorer från plasmamodellen samt uppmätta biokoncentrationsfaktorer
vid de olika reningsverken.
Ryaverket
Gråbo
Spenshult
Biokonc.faktor
modell
Biokonc.faktor
uppmätt
Biokonc.faktor
uppmätt
Biokonc.faktor
uppmätt
Ibuprofen
78
18 667
<214
<63
Naproxen
24
48
<4
<70
Diklofenak
113
5
<5
<11
Ketoprofen
20
<11
<29
<13
Gemfibrozil
421
199
<6
2–8a
a Osäker
beräkning – se tabell 3-1.
17
Biokoncentrationsfaktorerna för ibiprofen, naproxen
och gemfibrozil var mycket lägre vid Gråbo än vid
Ryaverket, men p.g.a. detektionsgränsen går det inte
att dra någon slutsats om detsamma gällde för
Diklofenak och ketoprofen (Tabell 3-3).
(”effect ratios”) beräknats (Tabell 3-4). Diklofenak
har lägst ER (=högst risk) följt av gemfibrozil. Man
kan notera att ibuprofen har ett mycket lägre upp­
mätt ER vid Ryaverket jämfört med det teoretiska
värdet. Vid Gråbo och Spenshult kunde inte
ibuprofen detekteras i blodplasma, vilket ger en
mycket högre minsta möjliga ER givet en detekt­
ionsgräns på 3 ng/ml i blodplasman. För de flesta
läkemedel/avloppsvatten är kvoten mellan uppmätta
ER och teoretiska ER (d.v.s. ett mått på hur bra
modellen är) ganska nära 1. För diklofenak (alla
platser) överskattas risken minst en tiopotens med den
teoretiska modellen, och detsamma gäller gemfibrozil
i Gråbo och Spenshult (understrukna värden). Mod­
ellen underskattar kraftigt risken med ibuprofen vid
Ryaverket (mörkt skuggat).
3.4 R
iskbedömning/prioritering
baserad på fisk-plasmamodellen
För att bedöma hur stor risken är för en farmako­
logisk effekt på vattenlevande organismer för de olika
läkemedlen/avloppsvattnen så har effekt kvoter
Tabell 3-4. Miljöriskbedömning/prioritering av läkemedel i avloppsvatten baserat på kvoten (”effect ratio”,
ER) mellan terapeutisk blodplasmakoncentration i människa och uppmätt eller beräknad koncentration i fisk
exponerad för olika avloppsvatten. Ju lägre ER, desto större är risken för en farmakologisk effekt på akvatiska
organismer. För närmare beskrivning se introduktionen samt figur 1-1. ER anges såväl för uppmätta plasmanivåer
i fisk som för teoretisk beräknade plasmanivåer. En kvot som indikerar hur väl den teoretiska modellen stämde
med uppmätta nivåer anges för varje läkemedel och reningsverk.
Human terapeutisk
plasmakoncentration
(ng/ml)
Ryaverket
15 000
Ibuprofen
20 000
Naproxen
Diklofenak
1 000
179
>5����
���
000
>5 0��
00
Teoretisk ER
42 548
13 676
3 989
Uppmätt/teoretisk
0,004
>0,4
>1,3
Uppmätt ER
1 667
>6 667
>6 667
Teoretisk ER
3 308
1 223
19 256
0,5
>5,5
>0,4
Uppmätt ER
21
>83
>83
Teoretisk ER
1,0
3
8
Uppmätt/teoretisk
22
>24
>11
>333
>333
>333
172
474
213
>1,9
>0,7
>1,6
Uppmätt ER
71
>5 000
1 875
Teoretisk ER
34
66
36
Uppmätt/teoretisk
2,1
>76
>53
Uppmätt ER
Teoretisk ER
Ketoprofen
Uppmätt/teoretisk
15 000
Gemfibrozil
Spenshult
Uppmätt ER
Uppmätt/teoretisk
250
Gråbo
18
4
Diskussion
neutralt pH och innehåller ofta två eller flera sura/
basiska funktionella grupper. Alla läkemedelsub­
stans­erna i denna studie har pK a värden under 5,
d.v.s. de förekom sannolikt i laddad form vid det pH
som exponeringstudierna utfördes vid (ca 7). Jon­
iserade substanser uppvisar vanligen mycket lägre
biokoncentration än oladdade, vilket sannolikt är en
delförklaring till en överskattning av modellen för
några läkemedel. Det skall dock påpekas att om vi
hade justerat modellen för substansernas pKa värden
hade underskattningen av ibuprofens biokoncentrat­
ion vid Ryaverket blivit ännu större.
För det andra tar modellen inte hänsyn till några
aktiva exkretionsmekanismer i fisken. En snabb,
aktiv exkretion kan göra att steady-state-nivåerna
blir lägre än vad som predikteras via modellen. Vi
känner dock inte till hur snabbt fisk metaboliserar
och utsöndrar de undersökta substanserna.
För det tredje så kan biotillgängligheten vara
betydligt lägre i verkligheten än vad modellen (som
baseras på substanser lösta i rent vatten) förutspår.
Ett mycket slående resultat var att biokoncentrationen
skiljde sig markan åt för ibuprofen och gemfibrozil
mellan de olika anläggningarna. Inga läkemedel
detekterades i fisken exponerad i Gråbo, och endast
gemfibrozil kunde mätas i blodplasman från fisk i
Spenshult, och då i mycket lägre koncentrationer
än vid Ryaverket. En skillnad mellan Spenshult och
Gråbo å ena sidan och Ryaverket å andra sidan är att
avloppsvattnet var utspätt med ytvatten (ca 50 %) i
Gråbo och Spenshult. Vi kan inte utesluta att sub­
stanser i ytvattnet kan ha begränsat upptaget. Man
vet t.ex. att många läkemedel kan binda till naturliga
kolloider och suspenderade sediment i ytvatten
(Ternes et al. 2004). Alternativt kanske det finns
ämnen i Ryaverkets avloppsvatten som ökar upptaget.
Man kan notera att Ryaverket är det enda undersökta
reningsverket som också blandar in industriellt av­
loppsvatten. Försöket i Gråbo utfördes vid mycket
lägre vattentemperatur (2 °C) än försöken vid Rya­
verket (12 °C) och Spenshult (13,6 °C). Hade vi
inte sett att biokoncentrationen av ibuprofen och
gemfibrozil också var mycket lägre i Spenshult så
hade vi sannolikt dragit slutsatsen att den låga temp­
eraturen i Gråbo hade varit den primära orsaken till
en mycket låg biokoncentration. Vid så låga temp­
eraturer filtreras mycket mindre mängder vatten
effektivt via gälarna i kombination med ett lägre
blodflöde genom gälfilamenten. Den låga temperat­
uren och därmed en begränsning av upptaget kan
Alla fyra NSAIDs (ibuprofen, naproxen diklofenak
och naproxen) samt en fibrat (gemfibrozil) återfanns
i avloppsvattnet från alla reningsverken. Skillnad­
erna i koncentrationer mellan reningsverken kan
sannolikt förklaras av en kombination av variation i
inkommande koncentrationer och varierande ren­
ingseffektivitet. Vi visar vidare att alla de undersökta
substanserna kan tas upp av fisk. Ketoprofen bio­
koncentreras dåligt i akvarieförsök jämfört med de
andra läkemedelssubstanserna. I studier med mer
realistisk exponering via avloppsvatten visar vi att
alla studerade substanser utom ketoprofen biokon­
centreras i fisk och kan mätas i fiskens blodplasma.
Detta gör det möjligt att utvärdera en modell för
biokoncentration som ligger till grund för en initial
riskbedömning baserat på jämförelse mellan kon­
centrationen i fiskens blod och den terapeutiska
plasmakoncentrationen hos människa.
Alla substanser utom ibuprofen uppvisade ungefär
lika hög, lägre eller betydligt lägre biokoncentrering
än vad den teoretiska modellen förutspådde. För ett
prioriteringsverktyg är det ofta bättre att överskatta
risker med några substanser än att underskatta
risker. Om man underskattar risken med en substans
brukar det leda till att man inte följer upp denna
närmare. För att minska denna risk är det ofta
oundvikligt att ett initialt selektionssystem även
fångar upp en del ”falska postiver” d.v.s. pekar ut
en möjlig risk med substanser som egentligen inte
utgör någon större risk. Vid mer fördjupade studier
blir det viktigare att kunna peka ut vilka de falska
positiverna var.
Anledningen till att det fanns en del falska pos­
itiver (överskattningar av plasmakoncentrationen i
fisk med modellen) tror vi kan förklaras framför allt
av följande skäl:
För det första så baseras den QSPR (quantitative
structure property relationship) som utgör basen
för modellen inte på läkemedel. Modellen beräknar
biokoncentrationen över gälarna med hjälp av sub­
stansernas oktanol-vatten-fördelning, ett mått på sub­
stansernas fettlöslighet. Grunden för denna modell
är endast två studier av ett begränsat antal sub­
stanser med oladdade, hydrofoba industrikemikalier
(Bertelsen et al. 1998; Fitzsimmons et al. 2001). I
motsats till dessa är läkemedel ofta laddade vid
19
naturligtvis vara en delförklaring. Den påfallande
korta tiden till steady-state (<2 dygn) för alla detekt­
erade läkemedel vid Ryaverket talar möjligen emot
att tiden för att närma sig steady-state skulle vara
mycket längre än exponeringstiden (23 dagar) p.g.a.
den lägre temperaturen. Resultaten från Spenshult
antyder att det finns ytterligare, okända men viktiga
faktorer som påverkar biokoncentrationen att ta
hänsyn till. Att ta reda på vilka dessa är mycket
angeläget för att kunna etablera en så allmängiltig
modell för biokoncentration av läkemedel som
möjligt.
Biokoncentrationen för ibuprofen vid Ryaverket
och därmed risken för en farmakologisk effekt under­
skattades kraftigt av den teoretiska modellen, trots
att vi (antagligen felaktigt) antog att allt ibuprofen
förelåg i sin oladdade och därmed sannolikt mer
bioackumulerbara form. Den kraftiga biokoncentrat­
ionen vid Ryaverket predikterades heller inte av kort­
tidsförsöket med höga läkemedelsnivåer utspädda i
rent vatten (vars huvudsyfte visserligen inte var att
kvantifiera biokoncentration). Även Hugget m.fl.
(2004) undersökte hur väl ibuprofen biokoncentreras
i fiskplasma, och de fann att plasmamodellen under­
skattade upptaget 23 gånger. Vi fann ytterligare 10
gånger högre biokoncentration vid Ryaverket. Dock
var biokoncentrationen för ibuprofen mycket lägre
vid Gråbo och Spenshult (se även diskussion ovan).
Detta visar på vikten av att även i ett tidigt skede
angripa frågeställningar ”från två håll”, d.v.s. både
det enkla och det komplexa. I detta fall fick vi viktig
information om brister i modellen genom att inte
bara undersöka hur ibuprofen beter sig när läke­
medlet verkar ensamt utan även i olika komplexa
exponeringssituationer.
För att bedöma risken för en (farmakologisk)
effekt på vattenlevande organismer med konserverade
målmolekyler så divideras den terapeutiska plasma­
koncentrationen i människa med plasmakoncentrat­
ionen i fisk för att ge en effektkvot (ER). För alla
läkemedel vid alla reningsverken är kvoten över ett,
och med hänsyn taget till utspädningen i Göta Älv
och Nissan skulle dessa effektkvoter bli ännu mycket
lägre. I Gråbo är dock den initiala utspädningen i
recipienten liten. En säkerhetsfaktor för ER på 1000
har föreslagits (Hugget et al. 2003, 2004, 2005), dels
för att vissa läkemedel kan ha viss effekt även långt
under Cmax för normal dosering, dels för att det är
möjligt att vissa organismer är betydligt känsligare än
människa vid samma interna exponering. Diklofenak
är det läkemedel som pekas ut att ha störst risk
för att påverka akvatiska organismer, både av den
teoretiska modellen (ER=1 vid Ryaverket) och av
uppmätta koncentrationer i blodplasma (ER=21).
Detta rimmar väl med de studier som rapporterar
olika histopatologiska effekter av diklofenak vid
koncentrationer i nivå med dem som återfinns i
kommunalt avloppsvatten (Schwaiger et al. 2004;
Triebskorn et al. 2004). En ER på 21 för diklofenak
vid Ryaverket skulle ungefär motsvara en ER på
1000 i Göta älv med en utspädning på 50 gånger
och en bibehållen biokoncentrationsfaktor efter ut­
spädningen. På andra plats återfinns gemfibrozil
med en teroetisk ER på 34 och en uppmätt på 71
vid Ryaverket. Gemfibrozil har i samstämmighet
med en relativt låg ER i denna studie visats påverka
kroppsegna nivåer av manligt könhormon hos
guldfisk vid ungefär samma vattenkoncentrationer
(Mimeault et al. 2005). Den teoretiska modellen in­
dikerar ingen risk för ibuprofen vid något renings­
verk, men vid Ryaverket var den uppmätta ER endast
179 vilket kan tyda på en möjlig effekt. Nyligen
publicerades en rapport om farmakologiska effekter
av ibuprofen på vattenlevande kräftdjur (Gammarus
pulex) vid så låga koncentrationer som 10ng/L (De
Lange et al. 2006). Om det, som vår studie vid
Ryaverket antyder, kan finnas mekanismer som
möjliggör biokoncentration långt över vad som
normalt förväntas av en substans med samma fett­
löslighet som ibuprofen så kan det kanske vara en
delförklaring till den höga potens som rapporterats
för ibuprofen på Gammarus. För naproxen är alla
data entydiga med att risken för att en exponering
skall ge farmakologiska effekter är mycket liten (ER
genomgående <1000). Ketoprofen uppvisade låg
potential att biokoncentreras i korttidsförsöket med
höga koncentrationer. Även om övriga resultat också
antyder att det är låg sannolikhet att en exponering
ger upphov till farmakologiska effekter, kan det inte
helt uteslutas då den terapeutiska plasmakoncentrat­
ionen är förhållandevis låg i människa (1 µg/mL)
vilket med en detektionsgräns på 3 ng/ml plasma i
fisk ger en ER på >333.
En förutsättning för att kunna utvärdera modellen
med ”naturligt” avloppsvatten är att läkemedlen i
fråga återfinns i avloppsvattnet. Om substanserna
dessutom biokoncentreras så mycket att vi kan
kvantifiera dem i blodplasman så har vi möjlighet
att uttala oss om såväl eventuella under- som över­
skattningar av biokoncentrationsförmågan från
20
modellen. Därför har vi i denna initiala studie valt
moderat fettlösliga substanser med ett log Kow
mellan 3 och 5 som dels inte bör fastna helt i
slammet i reningsverken, men ändå vara tillräckligt
fettlösliga för att kunna biokoncentreras. För att
kunna uttala sig om hur väl modellen fungerar för
substanser som är antingen mer vattenlösliga eller
mer fettlösliga bör detta utvärderas praktiskt först.
5
Slutsats
Överlag överensstämde den teoretiska rankningen av
risker med läkemedlen väl med rankningen baserad
på praktiska mätningar utom för ibuprofen vid
Ryaverket där biokoncentrationen underskattades
kraftigt. Rankingen stämde också väl överens in med
tidigare observation av effekter av de olika läke­
medlen på olika akvatiska organismer. En mycket
viktig observation var att biokoncentrationsfaktor­
erna varierade betydligt mellan olika exponerings­
situationer, trots liknande vattenkoncentrationer.
Sammantaget visar studien på en god potential för
den teoretiska modellen samtidigt som vi har visat
att det finns ytterligare, hittills okända faktorer
som det vore önskvärt att kunna ta hänsyn till och
därmed öka modellens precision.
21
Referenser
Bendz D., Paxéus N.A., Ginn T.R. & Loge F.J. (2005). �����������������������
Occurrence and fate of
pharmaceutically active compounds in the environment, a case study: Höje River
in Sweden. J. Hazardous Materials., 122, s. 195–204.
Bertelsen S.L., Hoffman A.D., Gallinat C.A., Elonen C.M. & Nichols J.W.
(1998). Evaluation of log KOW and tissue lipid content as predictors of chemical
partitioning to fish tissues. Environ.Toxicol. Chem.,17, s. 1447–1455.
Carlsson C., Johansson A.-K., Alvan G., Bergman K. & Kühler T. (2006). Are
pharmaceuticals potent environmental pollutants?: Part I: Environmental risk
assessments of selected active pharmaceutical ingredients. Sci. Total Environ.
364, s. 67–87.
Cleuvers M. (2004). Mixture toxicity of the anti-inflammatory drugs diclofenac,
ibuprofen, naproxen and acetylsalisylic acid. Ecotoxicol. Environ. Saf., 59, s. 309–
315.
Cleuvers M. (2005). Initial risk assessment for three β-blockers found in the
aquatic environment. Chemosphere, 59, s. 199–205.
De Lange H.J., Noordoven W., Murk A.J., Lürling M. & Peeters E.T.H.M.
(2006). Behavioural responses of Gammarus pulex (Crustacea, Amphipoda) to
low concentrations of pharmaceuticals. Aquatic Toxicol. 78, s. 209–216.
Desbrow C., Routledge E.J., Brighty G.C., Sumpter J.P. & Waldock M. (1998).
Identification of estrogenic chemicals in STW effluents. 1. Chemical fractionation
and in vitro biological screening. Environ. Sci. Technol. 32, s. 1549–1558.
EMEA.(2006). Guideline on the environmental risk assessment of medicinal
products for human use. CHMP/SWP/4447/00. European Medicines Agency.
London, June 1st.
Erickson R.J. & McKim J.M. (1990). A model for exchange of organic chemicals
at fish gills: flow and diffusion limitations. Aquatic Toxicol., 18, s. 175–197.
Fent K., Weston A.A., & Caminada D. (2006). Ectoxicology of human
pharmaceuticals. Aquatic Toxicol., 76, s. 122–159.
Fitzsimmons P.N., Fernandez J.D., Hoffman A.D., Butterworth B.C. & Nichols,
J.W. (2001). Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicol., 55, s. 23–34.
22
Haitzer M., Hoss S., Traunspurger W. & Steinburg, C. (1998). Effects
���������������������
of dissolved
organic matter (DOM) on the bioconcentration of organic chemicals in aquatic
organisms – a review. Chemosphere, 37, s. 1335–1362.
Heberer T. (2002) Occurrence, fate, and removal of pharmaceutical residues in
the aquatic environment: A review of recent research data. Toxicol Letters, 131, s.
5–17�.
Hoeger, B., Köllner, B., Dietrich, D.R. & Hitzfeld, B. (2005). ������������
Water-borne
diclofenac affects kidney and gill integrity and selected immune parameters in
brown trout (Salmo trutta f. fario). Aquatic Toxicol., 75, 53–64.
Huggett D.B., Cook J.C., Ericson J.F. & Williams R.T. (2003). A theoretical
model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritise
potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human Ecol. Risk Assess., 9,
s. 1789–1799.
Huggett D.B., Ericson J.F., Cook J.C. & Williams R.T. (2004). Plasma concentrat­
ions of human pharmaceuticals as predictors of pharmacological responses in fish.
In: Pharmaceuticals in the Environment, K. Kümmerer, Editor. 2004, SpringerVerlag: Berlin. p. 373–386.
Huggett D.B., Benson W.H., Chipman K., Cook J.C., Gray L.E., Kinter L.B.,
Meyerhoff R.D. & Trudeau V.L. (2005). Role of mammalian data in determining
pharmaceutical responses in aquatic species. In: Human pharmaceuticals: Assessing
the impacts on aquatic ecosystems. R.T. Williams (Ed). Society of Environmental
Toxicology and Chemistry (SETAC): United States of America.
Hutchinson T.H., Barrett S., Buzby M., Constable D., Hartmann A., Hayes
E., Huggett D., Laenge R., Lillicrap A.D., Straub J.O. & Thompson R.S (2003).
A strategy to reduce the numbers of fish used in acute ecotoxicity testing of
pharmaceuticals. Environ. Toxicol. Chem., 22, s. 3031–3036.
Jobling S., Beresford N., Nolan M., Rodgers-Gray T., Brighty G.C., Sumpter J.
P. & Tyler C.R. (2002). Altered sexual maturation and gamete production in wild
roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol.
Reprod. 66, s. 272–281.
Kümmerer K. (2004) Pharmaceuticals in the Environment – Sources, Fate, Effects
and Risks. Springer.
����������
Larsson D.G.J., Parkkonen J., Pettersson M., Berg H., Olsson P.E. & Förlin L.
(1999). Ethinyloestradiol – an undesired fish contraceptive? Aquatic Toxicol., 45,
s. 91–97.
Larsson D.G.J., Fredriksson S., Sandblom E., Paxeus N. & Axelsson M. (2006).
Is heart rate in fish a sensitive indicator to evaluate acute effects of β-blockers in
surface water? Environ. Toxicol. Pharmacol. 22, s. 338–340.
23
Liu R., Wilding A., Hibberd A., & Zhou J.L. (2005). Partition of endocrinedisrupting chemicals between colloids and dissolved phase as determined by
cross-flow ultrafiltration. Environ. Sci. Technol., 39, s. 2753–2761.
Mimeault C., Woodhouse A.J., Miao X.S., Metcalfe C.D., Moon T.W. & Trudeau
V.L. (2005). The human lipid regulator, gemfibrozil bioconcentrates and reduces
testosterone in the goldfish, Carassius auratus. Aquatic Toxicol., 73, s. 44–54.
Paxeus N. (2004). Removal of selected non-steroidal anti-inflammatory drugs
(NSAIDs), gemfibrozil, carbamazepine, beta-blockers, trimethoprim and triclosan
in conventional wastewater treatment plants in five EU countries and their
discharge to the aquatic environment. Water Sci. Technol., 50, s. 253–260.
Purdom C.E., Hardiman P.A., Bye V.J., Eno N.C., Tyler C.R, & Sumpter J.
(1994). Estrogenic effects from sewage treatment works. Chem. Ecol., 8, s. 275–
285.
Reddersen K & Heberer T. (2003). Multi-compound
�����������������������������������������
methods for the detection
of pharmaceutical residues in various waters applying solid phase extraction
(SPE) and gas chromatography with mass spectrometric (GC-MS) detection J.
Separation Sci., 26, s. 1443–1450.
Schwaiger J., Ferling H., Mallow U., Wintermayr H. & Negele R.D. (2004).
Toxic effects of the non-steroidal anti-inflammatory drug diclofenac Part I:
Histopathological alterations and bioaccumulation in rainbow trout. Aquatic
Toxicol., 68. s. 141–150.
Sumpter J.P. & Johnsson A.C. (2005). ��������������������������������������
Lessons from Endocrine Disruption and
Their Application to Other Issues Concerning Trace Organics in the Aquatic
Environment. Environ. Sci. Technol. 39, s. 4321–4332.
Ternes T.A. (1998). Occurrence
������������������������������������������������������
of drugs in German sewage treatment plants
and rivers. Water Res., 32, s. 3245–3260.
Ternes T.A., Herrmann N., Bonerz M., Knacker T., Siegrist H. & Joss A. (2004).
A rapid method to measure the solid-water distribution coefficient (Kd) for
pharmaceuticals and musk fragrances in sewage sludge. Water Res., 38, s. 4075–
4084.
Triebskorn R., Casper H., Heyd A., Eikemper R., Köhler H.-R. & Schweiger J.
(2004). ���������������������������������������������������������������������
Toxic effects of the non-steroidal anti-inflammatory drug diclofenac
Part II. Cytological effects in liver, kidney, gills and intestine of rainbow trout
(Oncorhyncus mykiss). Aquatic Toxicol., 68. s. 151–166.
Williams R.T. (2005). Human pharmaceuticals – assessing the impacts on aquatic
ecosystems; Society of Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC):
United States of America.
24
Analys av läkemedelsrester i fiskblod för att bedöma miljörisker vid exponering för avloppsvatten
Box 47607 117 94 Stockholm
Tfn 08 506 002 00
Fax 08 506 002 10
E-post [email protected]
www.svensktvatten.se