Mikrobiologisk metodik
med genteknik
Kursansvarig/Examinator:
Ann Erlandsson
[email protected]
054-700 24 71
073-4047221
Undervisande lärare, med ansvar för följande delar:
•”kvantifiering av bakterier”
Patrik Holm (lektor BML, BMA, KaU)
•”Diagnostik av Legionella mha PCR”
•Seminarium: Genteknik
Ann Erlandsson (lektor BML, Mikrobiolog, KaU)
•”Identifiering av okänd bakterie” och ”Urin/svalg prov”
•Anna–Sara Ahlquist (BMA, CSK) och Ingegärd Lindgren (BMA,CSK)
Patrik Holm och Ann Erlandsson
Lite av varje!
•Labgrupper antingen så lottar vi eller så delar in er själva i grupp 1 och 2
-ni arbetar 2 och 2 (möjligen kan ni vara 1 eller tre om vi är ett ojämnt antal) v.40, 42 och v.43
-seminariet (se komp.) är ett grupparbete men alla redovisar ca 10-15 minuter
-v.41 arbetar ni individuellt
•Laborationskompendiet etc. bilagor finns på kursens hemsida
•Glöm inte labrock!
•Ät inte på lab!
•Läs skyddsföreskrifterna i kompendiet!
•Läs igenom laborations handledningen innan ni börjar laborera!
Användbara förkunskaper inför denna kurs?
Kemikurser?
Lösnings beredning (g/mol, Molar (mol/liter))
pH-meter
Vågar
Mikropipetter
Mikrocentrifuger (rpm, g)
Biokemi?
Energi och ämnesomsättning
PCR
Restriktionsenzym
Orientering om genkloning och rekombinant DNA teknik
Anatomi och fysiologi?
Eukaryotaceller
Organ
Immunförsvaret
Medicinsk mikrobiologi?
Sjukdomsframkallande mikroorganismer
deras uppbyggnad och funktioner (virulens, spridning, svagheter etc)
Lite kloning
Lite diagnostik
Patofysiologi?
Hur sjukdomsprocesser utvecklar sig
•Laborationer i medicinsk mikrobiologi har gett er kunskap om bla;
1.var bakterier finns (över allt!)
2.hur de kan odlas (olika odlingsplattor och utstryksteknik)
8.5 cm
1.5 cm
Odlingsplatta
• Forts, Laborationen har gett kunskap om bla;
3.Gramfärgning och mikroskopering
4.Recistensbestämning
5.Förståelsen för ett ”rent” arbetssätt
•Ni har gjort följande laboration i Biokemi;
•Biokemi;
•Biokemi;
•Biokemi;
LABORATION
”kvantifiering av bakterier”
Patrik Holm (GENOMGÅNG VID LAB START)
Examination: En muntlig och en kortare individuell skriftlig
Redogörelse samt en praktisk examination.
LABORATION
”Diagnostik av Legionella mha PCR”
Genomgång av bakterien legionella läs nedan
(läs även labkompendium)
Kortare genomgång av PCR metoden
(läs även labkompendium)
Fullständig skriftlig individuell labrapport
FAKTA
Släkten Legionella
-Små g- stavar
-Naturligt förekommande i låga halter i sjöar och vattendrag
-Långsamväxande och specifika krav vid odling
-Smitta sker ej från människa till människa utan via inandning av
Legionellaförorenat vatten (aerosol)
-Möjlighet till intracellulär tillväxt i protozoer (amöbor och flagellater)
-Tillväxer i temperaturer mellan 18-45oC i vanliga vattenledningar, kyltorn,
duschar och bubbelpooler
-Temperatur, flöde och material i ledningarna är faktorer som påverkar tillväxt
(biofilmsbildning)
-Rek. temp. 70oC i varmvattenberedaren och 50-55oC vid tappstället enl.
Boverket
-Spola igenom oanvända kranar och duschar då och då
FAKTA
Arter (species)
-
49 st varav ca hälften är patogena
Legionella pneumophila vanligast vid Legionellos
15 serogrupper baserat på polysackaridantigen, serogrupp 1 vanligast
Subgrupper av serogrupp 1
ex. Philadelphia, Knoxville, Olga, Bellington
Andra arter inom släktet kan också orsaka sjukdom ex;
-Legionella bozemanii
-Legionella micdadei
-Legionella longbeachae
KLINIK, RELEVANS & BEHANDLING
Legionärssjuka (Legionellos)
Inkubationstid: 2-10 dagar, men kan vara upptill 3 veckor.
Symtom: Lunginflammation oftast med hög feber, huvudvärk, muskelvärk och
diarré. Inget enskilt symtom är prediktivt för legionärssjuka. Lunginfiltrat.
Lungröntgen visar typisk multifocal pneumoni.
Hög mortalitet, 15-20%.
Vilka drabbas?
* män >50 år
* rökare
* annan bakomliggande sjukdom
(immunsuppression)
Orsak till sjukdom:
* utbrott = kyltorn
* sporadiska fall= duschar
*Legionella pneumophila orsakar 80-90% av fallen
* serogrupp 1 svarar för 60-70%
KLINIK, RELEVANS & BEHANDLING
Behandling:
•
Stabil känslighet för erytromycin och ciprofloxacin
•
God känslighet för makrolider, azalider, kinoloner och
rifampicin. Nya makrolider och kinoloner (azitromycin och
levofloxacin/moxifloxacin) har visat sig ha bättre effekt än
erythromycin och ciprofloxacin.
•
Legionella har b-laktamas produktion därför saknas känslighet för många
b-laktamantibiotika (penicilliner och cefalosporiner) Antibiotika för
behandling måste kunna penetrera in intracellulärt i makrofager
•
Resistensbestämning utförs ej. Akademiska sjukhuset i Uppsala tar emot
prov för Etest eftersom man anser att det är en fördel att samla erfarenhet
av känslighetsbestämningar även på Legionella.
KLINIK, RELEVANS & BEHANDLING
Legionärssjuka är en anmälningspliktig sjukdom enligt smittskyddslagen
och föranleder utredning.
Vid utredning sker en jämförelse mellan patientisolat och miljöisolat.
KLINIK, RELEVANS & BEHANDLING
Pontiacfeber
Inkubationstid: 24-48h
Symtom: Influensalika symtom
Vilka drabbas? Ingen predisponerad grupp
Orsak till sjukdom:
* utbrott & sporadiska fall = bad i bubbelpool
* orsakas oftare av övriga legionellaspecies än
Legionellos
Behandling: Ingen (självläker)
EWGLI arbetar bland annat med standardisering av typning
Sequenced based typing (SBT)
Har syns länder som deltar i detta samarbete
ÅR;
*Sverige SMI
Anmälda fall
-00 -01 -02 -03 -04 -05
82 84 94 80 116 107
Utbrott vanligast under sommarhalvåret.
Män/kvinnor
Åldersfördelning, Sverige
(SMI 2005)Tot 107 st
1987-2006
ÅLDER och KÖNSFÖRDELNING:
1
3
4
15
31
20
21
12
DIAGNOSTIK vad finns tillgängligt?
1. Odling
2. Antigenpåvisning
* i urin
* i luftvägssekret/lungvävnad (IF)
3. Antikroppspåvisning
* i patientserum
4. Påvisning av specifika DNA-sekvenser
DIAGNOSTIK vad finns tillgängligt?
1. Odling
Referensmetod:
* hög specificitet
* täcker in alla legionellaarter
Medium:
* legionella kan inte metabolisera kolhydrater
* specifikt medium= Buffered charcoal yeast extract, BCYEa
(aktivt kol, järn och cystein)
Hög luftfuktighet (80-90%) vid odling
DIAGNOSTIK vad finns tillgängligt?
1. Odling
Svarstid: Prel svar 3-5dgr, slutsvar 10 dagar
Koloniutseende: krackelerade, blåvita, violetta, gröna eller rosa. Välvda med
jämna kanter
Konfirmering:
* renstrykning på platta med och utan cystein (ex blod)
* gramfärgning
* indirekt immunofluorescens (IF)
* (katalas, oxidas)
Sensitivitet (0.7-0.9) beror på
* Provtagning (provtyper; BAL, borst, bronk/trakeal sekret,
sputum, pleuravätska, lungvävnad, blod)
* Odlingsmediet
* Odlingsförfarandet
DIAGNOSTIK vad finns tillgängligt?
2. Antigenpåvisning i urin
-kommersiella kit finns
-endast påvisande av L.pneumophilia serogrupp 1 (sg1)
-hög specificitet men möjlig korsreaktion med serogrupp 4 och 6
-polysackarider från cellväggen utsöndras i urinen
* kan påvisas 3 dagar efter symptom debut
* kan kvarstå 1 år vid defekt cellmedierad immunitet
* urinprov tagna <5 dygn efter symtomdebut kan bli negativa
-Sensitivitet (0.6-0.9)
-Nationella och internationella kalibratorer saknas
DIAGNOSTIK vad finns tillgängligt?
2. Antigenpåvisning
i luftvägssekret/lungvävnad (IF)
-Snabbtest (vid akuta situationer vid svår pneumoni)
-Påvisar L.pneumophilia serogrupp 1-15
-Specificiteten med FITC inmärkta antikroppar är hög
-Sensitivitet (ca 0.5)
-Nationella och internationella kalibratorer saknas
DIAGNOSTIK
Sputum, BAL, trachealsekret och borste från bronkoskopi odlas på CSK
Sputum behandlas med pankreatin och legionella buffert (innehållande: )
BAL centrifugeras 3000rpm 10 min före utodling
Borstprov får tillsats av BHI (innehållande: )
Pleuravätska
Avläsning av plattorna dag 1-7 och dag 10
Leg- (ingen växt av Legionella)????
LegA =BCYEa (växt av Legionella)
GC-platta (ingen växt av Legionella)
Verifiering: Misstänkta kolonier (växt enligt ovan) stryks om på leg- och
GC, samt testas mot samtliga serogrupper med fluorescensinmärkta
monoklonala antikroppar (IF)
Misstänkta kolonier skickas till Akademiska sjukhuset i Uppsala för att bekräfta
serotypsbestämningen alterinativt artbestämning (om det visade sig att
serotypsbestämningen (IF) blev negativ)
Serologi och påvisning av antigen i urin görs av Akademiskasjukhuset,
Uppsala
DIAGNOSTIK
Vad görs på ALcontrol
Provtyp: vatten från duschar, bassänger, kyltorn, reningsanläggningar mm
Metod: membranfiltrering och direktutstryk. Syrabehandlas alltid,
värmebehandlas om det är ”smutsiga” vatten. Odlas i 36oC
Konfirmering: kolonier med typiskt utseende renstryks på BCYE och blodagar.
Vissa positiva kolonier konfirmeras med ett latexagglutinationstest med
avseende på:
1.Legionella pneumophila serogrupp 1
2.Legionella pneumophila serogrupp 2-14
3.Legionella spp
nested PCR
Generellt PCR;
1. DNA preparation (QIAgen eller annnat)
2. PCR reaktion
nested PCR (PCR i 2 steg med yttre och inre primerpar)
-mer specifik
-mer sensitiv
än en enstegs PCR
3. Detektion kan göras på olika sätt
Realtids-PCR metod för detektion
och kvantifiering av Legionella?
*Realtids PCR
är att föredra framför annan PCR!
-minskar risken för kontamination
-mer specifik
-möjlighet att kvantifiera totalmängd
bakterier
-möjlighet att titta på flera gener samtidigt
(typning)
-snabb
-enkel simultan avläsning
”Seminarium/Grupparbete i genetik”
Uppgift
Ni kommer att delas in i grupper. Gruppen ska ses som en resurs vid genomförandet av uppgiften.
Huvuduppgiften är att hålla ett föredrag à 10-15 minuter/person kring något som är kopplat till genteknik.
Vad ni väljer för ämne är fritt men den etiska aspekten måste tas med.
Exempel på föredrag skulle t.ex. kunna vara; fosterdiagnostik, kloning, kriminologi, genterapi,
vaccin/läkemedelsproduktion eller dylikt.
Det är tillåtet att medföra litteratur och egna anteckningar vid seminariet.
Obligatorisk närvaro vid seminariet.
Nedanstående frågor ska besvaras av
gruppen innan seminariet startar.
För att det är användbar kunskap.
PCR
1. Hur fungerar PCR reaktionen?
2. Vilka är de ingående komponenter i PCR reaktionen?
3. Nämn några infektions sjukdomar som
diagnostiseras med PCR.
4. När kan det vara bättre och när kan det vara sämre
att använda PCR som en diagnostisk metod?
Restriktionsenzym
5. Vad är ett restriktions enzym?
6. Hur fungerar ett restriktionsenzym in vivo?
7. Hur används restriktions enzym in vitro?
Ligas
8. Vad är ett ligas?
9. Hur fungerar ett ligas in vivo?
10. Hur används ligas in vitro?
Vektorer
11. Beskriv 3 olika vektorer.
12. På vilket sätt kan en bakterie ha nytta av sin
plasmid?
13. På vilket sätt kan plasmider i bakterier ställa till
problem för oss?
kloning
14. Beskriv ett klonings förfarande från isolering av en
gen till att genen börjar uttryckas i en
anan organism exempelvis en bakterie.
LABORATION 3 och 4
”Identifiering av okänd bakterie”
”Svalg och urin”
Läs labkompendium s.5-15 samt s. 23-25 noga!
-Kortare individuella skriftliga redogörelser
(som inte behöver lämnas in)samt
en muntlig redogörelse på ”Identifiering av okänd bakterie”
-Individuell labrapport ”Svalg och urin”
KLASSIFICERING AV BAKTERIER
Efter;
Fenotyp
• Cellvägg
• Form
• Växtsätt
•Metabolism
Med hjälp av;
Metoder som
•Gramfärgning
•Mikroskopi
•Odling och mikroskopi
•Biokemiska test
Fortsättning hur Bakterier kan klassificeras fenotypiskt genom studier av;
•Utseende i mikroskop (mikroskopi)
•Utseende på odlingsplatta (makroskopiskt utseende)
•Bakteriens metabolism (Biotypning)
•Bakteriens antigentyp eller patentens antikroppar (serotypning)
•Bakteriens känslighet för antibiotika (antibiogram)
•Bakteriens känslighet för infektion av bakteriofager/bakterier virus
(fagtypning)
Gram-färgning
Bakterie morfologi/form
Stav formad bakterie
Ex. Salmonella, Legionella,
Bacillus
Kock format bakterie
Ex. Stafylokock, streptokock
Svampar; Ex Candida
Mikrobiologisk metodik
Syfte och mål
Efter genomgången kurs skall studenten:
ha inhämtat grundläggande kunskaper i mikrobiologisk metodik samt genteknik
Kursens innehåll
Odling av humanpatogena bakterier för diagnostik och artbestämning av dessa
med biokemiska test och immunologisk metodik.
Detektion av bakterier med immunologisk metodik och DNA-teknik.
Metoder för kvantifiering av bakterier.
Genteknik och etiska aspekter kring genteknik.
Helicobacter pylori
Infektion i höftled
Borrelia
Lycka till med laborationerna!
Fågelinfluensa????
Dermatofytinfektion
Bensår
