CMV/EBV
Molekylär
diagnostik
Annika Allard
Klinisk Mikrobiologi/Virologi
Norrlands Universitetssjukhus
•
De flesta CMV infektioner hos immunkompetenta individer är asymtomatiska
eller ger bara en mkt mild sjukdomsbild.
•
CMV kan dock orsaka allvarliga
sjukdomar hos nyfödda och
immunosupprimerade
•
CMV sprider sig i blodet och kan därför
hamna i alla organ. En reaktivering kan
därför uppträda var som helst i kroppen.
•
Latenta CMV genom finns närvarande i
makrofager, mononukleära celler,
neutrofiler, polymorfonukleära celler,
epitel- och endotelceller, fibroblaster,
neuron celler och parekymceller. Finns
också i olika vävnader som benmärg,
lever, njure, mag- och tarmkanal, lungor
och hjärna.
•
CMV är det vanligaste virus som
infekterar mottagare av solida organ.
Orsakar död och svår sjukdom liksom
organavstötning, ökad risk för
opportunistiska sjukdomar.
CMV
INFECTIONS IN IMMUNOCOMPROMISED HOSTS AND ORGAN TRANSPLANT
RECIPIENTS: ESSENTIALS
Molekylär diagnostik
Jay A Fishman, Liver Transplantation
Volume 17, Issue S3, pages S34-S37, 26 OCT 2011
Virusmängd/viral load
•Kopplad till svårighetsgrad av sjukdom
•Längd av behandling/effektivitet av behandling
•Förebygga onödig behandling/förutspå drogresistens
•Indikera risk för kliniskt återfall
När det gäller NAAT metoder
så är det viktigt att ha metoder som kan
särskilja en
detektion av
aktiv viral infektion från
latent viralt DNA, dvs att
skilja på en sann infektion från
viral latens.
Provmaterial
Olika delar av blod kan användas;
• Leukocyt preppar, helblod,
• Plasma och serum.
CMV i plasma och serum har frisläppts från aktivt
infekterade celler och detektion i dessa vätskor anses
därför vara mer specifika för en aktiv CMV infektion.
CMV fynd i leukocyter eller helblod återspeglar en cellassocierad latent CMV.
Ökning viruskopior per dag
Emery et al. Lancet 355:2032-2036, 2000
Procentuell
risk för CMV
relaterad sjukdom
64%
16%
Mängd virus taget initialt i första provet
En hög initial titer av CMV eller en mkt snabb ökning av virusmängd förutspår
en utveckling av CMV sjukdom. CMV dubbleringstid är 24-48 timmar – därför
kan även låga nivåer bli farliga snabbt hos immunosupprimerade individer.
EBV
90-95%
av alla vuxna är EBV seropositiva.
Eftersom EBV kvarstår i B-celler livet ut så
kan latenta virus hittas i leukocyter (1-2
genomkopior/cellkärna i episomal form).
Hos
immunokompetenta är EBV DNA
detekterbart i serum i ca 7 dagar efter start
av symptom. Serologi används istället för
PCR.
provmaterial
Tittat på 33 patienter med HIV och B-cells lymphom
•
•
•
•
Renade B-celler
Supernatant av odlade B-celler
Plasma
Helblod
100% EBV
82% EBV
57% EBV
42% EBV
• Serum/plasma = cirkulerande celler = cellfritt EBV
• Helblod = cellbundet EBV
Al Tabaa et al.
J Clin Virol,
52:33-37 ,2011
Plasma:
• Bara aktivt replikerande
virus som släppts ut från
celler, vilket korrelerar
bättre med klinisk sjukdom.
Helblod:
• EBV episomalt DNA mäts.
Tidigare detektion än med
plasma. I plasma bara fritt
DNA, vilket blir en sen
markör för EBV. Alltså skall
helblod användas. Får då
med celler med virus,
lymfocyter, cellfria material.
Helblod är en tidigare
markör.
Primär EBV infektion
Efter en transplantation
Gulley and Tang,
Clin Microbiol Rev
23:350-366, 2010
PROBLEM INOM DIAGNOSTIKEN
Många studier har nu visat att olika kvantitativa standarder har
en dramatisk effekt på ”viral load” resultat.
Avvikelser när det gäller kvantitativa analyser inom kemi
brukar ge CV (variationskoefficient) som varierar mellan
1-5%, medan realtids PCR för virologiska analyser har CV
på mellan 30-40% eller mer. Jämförelser mellan olika lab
kan vissa på skillnader i virusmängd mellan 100 - 10 000 x.
När det gäller tex HCV och HIV har
man kommit långt med internationella
kvantitativa standarder, FDA godkända
tester, kalibrerings standarder etc –
vilket gjort att man har en ökad
samstämmighet både inom och mellan
olika laboratorier.
WHO International Standard
1st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus for
Nucleic Acid Amplification Techniques
NIBSC code: 09/162 Instructions for use
(Version 6.0, Dated 09/10/2014)
WHO International Standard
1st WHO International Standard for Epstein-Barr Virus
for Nucleic Acid AmplificationTechniques
NIBSC code: 09/260 Instructions for use
(Version 4.0, Dated 09/10/2014)
5 ^ 106 kopior/ml
• Skillnad på koncentration beroende på vilket material man späder
standarden i.
• Om man späder i helblod så fås en lägre koncentration än spädning
i plasma. Ungefär 0.5 logs skillnad.
• Man bör kolla själv hur det ser ut med sin egen detektions-assay;
skillnader mellan in-house och kommersiella metoder.
• Nya analyser skall publiceras under 2015 med WHO standarden
Förutom positiv standard så borde allt standardiseras,
provtagning, NA extraktion, amplifiering, detektion etc.
Hayden et al JCM 50:337-345, 2011
• Tester gjordes med 165 lab deltagare: 147 lab CMV, 88 lab EBV
• CMV – ingen större variation mellan användning av inhouse och kommersiella test.
• EBV större variabilitet mellan lab som körde med inhouse.
• Extraktionsmetoder; bäst med liquid phase, sedan
silicabaserad prep och sist magnetic beads.
• Val av target gen var inte heller utslagsgivande;
• Taqmanprober ngt sämre än FRET prober.
Anledning till variationer
EBV
CMV
• Kommersiella tester
47.1%
• Kommersiella tester
10.8%
•
10.6%
•
• Målgen för amplifiering
9.6%
• Extraktionsmetod
3.4%
Interaktion mellan provmaterial och målgen för
amplifiering
8.3%
•
• Interaktion mellan reagenser
och val av gen för amplifiering
7.2%
Dålig kalibrering för kvantifiering
Extraktionsmetod
7%
•
Målgen för amplifiering
7.1%
•
Pipetteringsmetod
5%
•
Interaktion mellan extraktionsmetod och
amplifiering av målgen
5.3%
+ lite till
Inga studier har ännu inkluderat pre-extraktionsförfarande (framförallt transportförhållanden) samt hur
proven lagras innan analys.
Tack för er uppmärksamhet!
