Föreläsningens innehåll
• översikt eukaryota värdar och
expressionsvektorer (='budbärare')
Eukaryot proteinexpression
• Saccharomyces cerevisiae
• Pichia pastoris
9:e november 2009
• Baculovirus/insektsceller
Patrik Samuelson
• däggdjursceller = mammalieceller
Prokaryot vs Eukaryot
Prokaryot vs Eukaryot
• Prokaryot
– plasmidexpression
vanligast
– inducerbara
promotorsystem
– billigt
– sekretionssystem underlättar rening
– höga expressionsnivåer
(upp till 5g/l)
• Eukaryot
– inga bakteriella
cellkomponenter
– posttranslationella
förändringar
AcMNPV
Vad avgör val av värd-vektorsystem?
• struktur hos proteinet
- posttranslationella modifieringar
• användningsområde
- in vivo
- in vitro
- struktur/funktionsstudie
• mängdbehov
• tidsperspektiv
• kostnad
Posttranslationella modifieringar
•
•
•
•
disulfidbindningar
proteolytisk processning
glykosyleringar
fosforyleringar, sulfatering, acetylering,
acylering, γ-karboxylering
• fettsyraaddering (C14, C16)
1
Glycosylation
Linkage of carbohydrate side chains to
glycoproteins
• Glycosylation adds carbohydrate chains to proteins
to form glycoproteins.
• The carbohydrate moieties play important roles in
protein folding in the ER, in targeting proteins for
transport, and as recognition sites in cell-cell
interactions.
• N-linked glycoproteins: the carbohydrate is
attached to the N atom in the side chain of
asparagine.
• O-linked glycoproteins: the carbohydrate is
attached to the O atom in the side chain of serine or
threonine.
Synthesis of N-linked glycoproteins
Processing of N-linked oligosaccharides
N-länkad glykosylering
Examples of O-linked oligosaccharides
2
O-länkad glykosylering
Structure of a GPI anchor
Eukaryota värdar för proteinproduktion
Generell eukaryot expressionsvektor
• jäst
• insektsceller
• däggdjursceller
• växtceller
• Transformationsmetoder
- protoplaster
- litiumacetat
- elektroporering
• Transfektionsmetoder
- DNA fällt med Ca-fosfat
eller DEAE-dextran
- elektroporering
- lipofektion
- gene gun
Expressionsvektor för mammalieceller
• eukaryot promotor, polyadenyleringssignal och termineringssekvens
(transkription)
• selekterbar markör funktionell i eukaryot
cell
• selekterbar markör funktionell i
prokaryot
• ori funktionellt i eukaryot cell
• ori funktionellt i prokaryot
Jästarter
• Saccharomyces cerevisiae
• Pichia pastoris
• Hansenula polymorpha
• Schizosaccharomyces pombe
• Candida utilis
Invitrogen
3
Saccharomyces cerevisiae
Advantages of yeast expression systems
•
•
•
•
High yield
High productivity
Chemically defined media
Product processing similar to mammalian
cells
• Stable production strains
• Durability
• Low protein production cost
•
•
•
•
•
•
•
Enkel och billig att odla i stor skala
Väl karaktäriserad genetiskt och fysiologiskt
Sekreterar få proteiner naturligt
Naturligt förkommande plasmid
Fungerande sekretionsmaskineri
Etablerade selektionssystem finns
GRAS-organism (generally recognized
as safe)
Jästvektorer
Episomal jästvektor (2µm)
• Plasmidvektorer = episomal vektor
- ofta instabil vid större odling
• Integrerande vektorer
- endast en genkopia
- ”tandem arrays” tenderar till att vara instabila
• Yeast artificial chromosome (YAC)
- kan härbärgera stora fragment
- bevaras som separat kromosom
- analys och sekvenerig av stora genfragment
- ej primärt för proteinproduktion
Integrerande vektor (jäst)
YAC system
4
Ökning av gendosen
• Multipla kopior efter
varandra
• Genamplifiering
- His4/Tn903KanR
(G418)
50-100 kopior
- Sh ble/zeocin
Sekretion
•
•
•
•
•
Glykosylering vid sekretion
Pre-pro-α-faktor = signalpeptid
Lys-Arg-linker
signalpeptid klyvs av endoproteas
Sekretionsmaskineriets proteiner kan
modifieras
Pichia pastoris
Promotorer och signalsekvenser
Promotorer:
Signalsekvenser:
• Starka
- AOX1 (inducerbar)
- GAPD (konst.)
- FLD1 (ind.)
• Medel
- PEX8 (ind.)
• Svag
- YPT1 (konst.)
• S. cerevisiae α-MF
• P. pastoris acid
phosphatase (PHO1)
• C. rugosa Lip1
• Phaseolus vulgaris
agglutinin (PHA-E)
Nackdelar med S. cerevisiae
• Plasmider förloras ofta vid odling i stor
skala
• Hyperglykosylerar proteiner
• Vanligt med ’periplasmatiska’ proteiner
istället för sekreterade
• Fermenterar socker till etanol (Crabtreeeffekt)
Pichia pastoris
Ungefär samma karaktäristika som S. cerevisiae,
i övrigt gäller dessutom:
• Stark och strikt reglerad promotor (AOX1)
• Ingen etanolproduktion
• Sekreterar färre proteiner än S. cerevisiae
• Ofta hög produktion
• Förhöjd proteolys
5
Aspergillus
•
•
•
•
Stor sekretionskapacitet (naturligt)
Snabbväxande
Hög celltäthet
Rel. hög proteasaktivitet
Baculovirus
• en av de största virusfamiljerna
• infekterar ryggradslösa djur
- insekter (ca. 600)
- skaldjur
• cirkulärt ds-DNA, 80-220 kb
• Stavformig, membranomsluten viruspartikel
• tre subgrupper
- Nuclear polyhedrosis viruses
- Granulosis viruses
- Non-occluded viruses
AcMNPV
Baculovirus infekterar insektsceller
polyhedrin-kapsel
ut i omgivningen
’äts’ av ny insekt
polyhedrin-kapseln löses upp
i mag-tarmkanalen och virioner
kan infektera nya celler
AcMNPV
Budding virus particles
Polyhedron embedded viruses
• Autographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus
• infekterar ett 30-tal insekter (främst
nattfjärilar).
• proteinösa nukleära ocklusionskroppar
• genexpression tidigt och sent
(polyhedrin, p10) i replikationscykeln
• starka promotorer
Advantages of baculovirus-assisted insect cell expression
•
•
•
•
Eukaryotic post-translational modification
Proper protein folding and function
High expression levels
Easy scale up with high-density suspension
culture
• Safety
6
Insektscell-linjer
Spodoptera frugiperda
(Cabbage looper)
Sf21 (from ovarian cells)
Sf9 (from ovarian cells)
Sf9
Trichoplusia ni
High-Five (BTI-TN-5B1-4)
(from egg cells)
doubling time: 18-24 h
Baculovirus transfer vector
Bacmid: E. coli -insektscells-skyttelvektor
Proteinproduktion i däggdjursceller
Introduction of DNA into animal cells
• Fördelar:
autentiska
posttranslationella
modifieringar
väl stabila är cellinjer
pålitliga
• Nackdelar
dyrt
7
Retroviral vectors
Expression approaches
Mammalie-cellinjer
African green monkey
• Transient=övergående expression
- African green monkey kidney cells (COS)
- Baby hamster kidney cells (BHK)
- Human embryonic kidney cells (HEK-293)
• Stabil expression
- Chinese hamster ovary cells (CHO)
- Myeloma cells (Sp2/0, J558L)
- Murine erythroleukemia cells (MEL)
COS-1 (kidney fibroblast)
Viral based vectors for gene expression in
mammalian cells
Amplifiering av genomregioner
•
•
•
•
•
•
Hydroxy urea
Aphidicolin
UV- eller gammastrålning
Carcinogener
DHFR (Dihydrofolat reduktas)-MTX (methotrexate)
GS (Glutamin syntas)-MSX (methionine sulfoximine)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Adenovirus
Adeno-associated virus
Baculovirus
Coronavirus
Epstein-Barr virus
Herpes simplex virus
Lentiviruses
Poliovirus
Retroviruses
Semliki Forest virus
Simian virus 40
Sindbis virus
Vaccinia virus
8
Transgene sequence optimization
Coexpression
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Codon optimization and G/C content adaptation
Inhibition of internal splicing and premature polyadenylation
Prevention of creation of stable RNA secondary
Introduction/avoidance of immunomodulatory CpG motifs
Avoidance of direct DNA repeats and thereby recombination events
Domain shuffling, epitope scrambling and protein chimarization
Obstruction of formation of stable dsRNAs with host transcriptom
Avoidance of possible RNAi viable genes
Optimization of tissue specific promoter/enhancer sequences
Addition of RNA stabilizing and nuclear translocation supporting
sequence elements
• Development of the most efficient cell line/vector combination
• Quantification of gene expression by state-of-the-art analysis
Comparison of expression systems
Characteristics
E. coli
Yeast
Insect cells
Mammalian cells
Cell growth
30 min
90 min
18-24 h
24 h
Growth medium
complexity
Minimum
Minimum
Complex
Complex
Growth medium cost
Low
Low
High
High
Expression level
High
Low-High
Low-High
Low-moderate
Yield (mg/L cult.)
50-500
10-200
10-200
0.1-100
Extracell. expr.
Periplasm
Medium
Medium
Medium
Protein folding
Refold. usually
required
Refold. may be
required
Proper folding
Proper folding
N-linked glycosyl.
None
High mannose
Simple, no sialic acid
Complex
O-linked glycosyl.
No
Yes
Yes
Yes
Phosforylation
No
Yes
Yes
Yes
Acetylation
No
Yes
Yes
Yes
g-carboxylation
No
No
No
Yes
Success rate
40-60
50-70
50-70
80-95
9
