Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Ett snabbare sätt att upptäcka bakterien Yersinia enterocolitica i kött
Malin Thomasson
Yersinia enterocolitica är en stavformad bakterie som bl.a. finns i jord, sötvatten och magoch tarmkanalen hos många djur. Griskött och obehandlat dricksvatten är de viktigaste
smittkällorna när det gäller Yersinia-infektion hos människor. Sjukdomsfall orsakade av
Yersinia är vanligast i norra Europa och i Nordamerika. I Danmark, Norge och Sverige är
Yersinia den tredje vanligaste orsaken till bakteriell smitta överförd via livsmedel. Endast
Salmonella och Campylo-bacter orsakar fler sjukdomsfall. De vanligaste symptomen på
infektion av Yersinia är magsmärta, diarré och feber. Ibland kan ledsmärta uppstå. Eftersom
bakterien kan växa vid temperaturer mellan -1oC och +40oC utgör kyllagring inget skydd mot
bakterien. Tvärtom kan detta medföra att bakterien kan etablera sig som en husflora i
kyllokaler och andra lokaler på slakterier eller styckningsanläggningar.
Den analysmetodik som används idag är långsam (drygt tre veckor), osäker och
arbetskrävande. Dessutom kan man inte skilja på virulenta och avirulenta
(sjukdomsframkallande resp. ofarliga) stammar av Yersinia. En snabbare och mer specifik
metod skulle behövas. Analysmetoder baserade på PCR (Polymerase Chain Reaction) har
utvecklats men i sammansatta prover som livsmedel och avföring finns ofta faktorer som
hämmar PCR. Syftet med mitt examensarbete var att utvärdera en multiplex PCR tillsammans
med tre separationsmetoder och se med vilken metod man bäst kunde upptäcka Yersinia i
köttprover. PCR är en analysmetod där en viss sekvens av DNA:t (arvsmassan) uppförökas
och sedan detekteras (upptäcks, görs synlig) på en agarosgel. Vilken sekvens som uppförökas
beror på vilka primrar man har. Primrar är korta DNA-strängar som tillverkats så att de ska
binda in till ett visst ställe på DNA-spiralen och det är sekvensen mellan två primrar som
uppförökas. Har man mer än ett primerpar kallas det multiplex PCR. I min undersökning
använde jag två primerpar, Y1:Y2 och P1:P2, med vilka man kan detektera Yersinia och
skilja virulenta från avirulenta stammar.
De tre separationsmetoderna som jag utvärderade bygger på olika principer. Percoll separerar
partiklarna i provet med avseende på storlek och densitet (täthet). Tvåfassystemet består av
två vätskor som har olika densitet och olika löslighetsegenskaper. Partiklarna i provet
separeras med avseende på storlek, laddning, densitet och löslighetsegenskaper. XTRAX är
en DNA-extraktionsmetod där bakterierna sönderdelas så att DNA:t släpps fritt och kan
isoleras. Jag fann att XTRAX var den metod som bäst skilde bakterierna från de hämmande
faktorerna i kött. Prov med ursprungshalten 10 000 bakterier/ml kunde detekteras med PCR.
Det finns goda chanser att den multiplexa PCR som jag utvärderat ska fungera som en
analysmetod tillsammans med XTRAX, men det är ingen färdig metod än. Ett förodlingssteg
kommer nog att behövas. Då det krävs stor noggrannhet och en hel del utrustning, är PCR
troligtvis inte lämpad som en rutinanalys på t.ex. ett slakteri. Däremot lämpar sig metoden bra
för analys på ett laboratorium.
Swedish official title: Utvärdering av tre separationsmetoder för att med en multiplex PCR
kunna detektera Yersinia enterocolitica i kött
Swedish credits: 20p
Supervisor: Blanka Rutberg and Ylva Blixt, Department of Microbiology and
Köttforskningsinstitutet
Submission date/time: 3/12/1998
Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
An evaluation of three separation methods for detection of Yersinia
enterocolitica in meat with a multiplex PCR
Malin Thomasson
Biology, Microbiology
Autumn 1997
Abstract in English
The aim of this study was to determine which of the three separation methods ATPS
(Aqueous Two Phase System), Percoll and XTRAX, together with a multiplex PCR
(Polymerase Chain Reaction), best could detect Yersinia enterocolitica in meat samples. Y.
enterocolitica is the third most common cause of foodborne illness in the Nordic countries,
only Salmonella and Campylobacter cause more cases. The symptoms of a Yersinia infection
are abdominal pain (stomach-ache), diarrhoea and fever. These symptoms last for about 15
days but sometimes arthritis can set in after about one week and it can last for more than a
year.
Pure cultures of Y. enterocolitica and sterilized, homogenized ham inoculated with different
concentrations of Y. enterocolitica were separated using ATPS, Percoll and XTRAX. The
samples were subsequently analysed with a multiplex PCR, where the 16S rRNA gene on the
chromosome and the yadA gene on the virulence plasmid were detected with two primer
pairs, Y1:Y2 and P1:P2. The PCR products were detected on an agarose gel stained with
ethidium bromide.
Percoll was the separation method that worked best on a pure culture of Y. enterocolitica,
> 102 CFU/ml in the original sample could be detected. On the inoculated meat samples,
XTRAX was the separation method which gave best results, > 104 CFU/ml in the original
sample could be detected. On naturally contaminated samples the concentration probably is
much lower and, therefore, a preenrichment step will be necessary. A validation was made on
six non-sterile meat samples: ham, pork loin and minced meat with low and high background
flora, respectively. The samples were separated with XTRAX. Neither the background flora
nor the type of meat sample seemed to affect the PCR analysis negatively.
The specificity of the primers was tested by analysing different strains of Y. enterocolitica,
different Yersinia-species and some non-Yersinia-species. The specificity was shown to be
good and all pathogenic and non-pathogenic Yersinia spp. were detected with the method,
except four isolates (Y. enterocolitica O:5, two Y. frederiksenii and Y. ruckeri).
