Avdelningen för kemi och biomedicin
Karlstads universitet
Examination av ”Legionella PCR laborationen” sker genom att
man skriver en enskild labbrapport samt att man går igenom en
kurskamrats labbrapport och kontrollerar vilka delar av
rapporten som är okej med hjälp av en ”rättningsmall”.
Labrapporten ska vara skriven på dator och innehålla;
TITELSIDA. Med laborationstitel, Laborantens namn samt laborationsdatum och handledare.
SAMMANFATTNING. Mycket kort inledning, sammanfattning över vad som gjorts och de
viktigaste resultaten samt de slutsatser man kommit fram till (alltså egentligen en mycket
kortfattad version av inledning, material och metod, resultat och diskussion)
INLEDNING. Skriv allmänt om bakterien, medicinsk bakgrund och syfte med
patientprovtagning respektive vattenprovtagning. Principerna för PCR metoden, DNA
preparations metoden (reagensen i qiagen kitet- beskriv deras betydelse/funktion),
spektrofotometermätning och gelelektroforesmetoden. Problemställning och avsikt med
laborationen ska också finnas med här (helst sist i inledning).
MATERIAL OCH METOD. Beskrivning av vad som gjorts vilket material och vilka metoder
som använts, beskriv i stora drag med egna ord (dvs skriv inte av labhandledningen), volymer är
tex oftast inte intressant att få veta om man inte vet koncentrationen. Ta med avvikelser från
metodbeskrivningen och uträkningar.
RESULTAT. Beskriv resultatet i en löpande text samt figur för gel och tabell för
spektrofotometer resultatet. Börja helst inte resultatet med att ”smacka” dit figur eller tabell, utan
börja med någon/några inledande meningar. Koncentration och renhet på det framrenade DNA´t
ska som sagt finnas med. Gel fotografiet (som är erat absolut viktigaste resultat) beskrivs i detalj,
varje brunn som visas skall vara numrerad och fotot skall ha en figur text. Mha MW-markören
”track it” om det är den ni använt 0.1 µg/µl (storlek på banden: 2652, 800, 700, 600, 500, 450,
400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50) får ni reda på om storleken på PCR produkterna verkar
stämma. Rita en kurva på molekylviktsmarkören, med vandringssträckan från brunn till band i
cm på x-axeln och antal baspar i de olika banden på y-axeln. Mät sedan era PCR produkter hur
långt de vandrat i cm, gå sedan in på kurvan och se hur många baspar det motsvarar. Försök att
uppskatta om koncentrationen bakterier i provet var högt eller lågt beroende på om ni kan se
band i PCRens steg 1. Hur ser gelen ut i övrigt? Är molekylviktsmarkörens band tydliga? Är det
tex klara tydliga band på det positiva provet? Eller kan man tex se ljusa släpspår (sk smear) på
gelen? Är den negativa kontrollen helt ren? Har primerparet bildat primer dimer så kan man se
det ganska långt ner. Ibland om man haft lite för hög koncentration av primers kan man se ljusare
partier ytterligare lite längre ner.
UPPSKATTA KONCERNTRATIONEN framrenat DNA VISUELLT på gelen
(mha MW markören) och jämför med koncentrationsbestämningen i
spektrofotometern. Ex. på hur man kan göra, använd figur X brunn 14 (framrenat DNA)
och brunn 16 (MW-markör, totalt har 2 µl av denna markör à 0.5 µg/ml satts på gelen dvs
totalt 1 µg, i texten på samma gel finns antal band i denna markör samt hur många baspar
varje band är. När man vet detta kan man tex räkna ut hur mycket DNA det finns i det
tjocka 500 bp bandet eftersom jag kan räkna ut hur stor del av den totala mängden DNA i
µg som detta band utgör……….500x2 eftersom det av just detta band finns
2st)/(100+200+300+400+500+500+600+700+800+900+1000+1100+1200+1300+1400))x 1µ
µg =
antal µg i 500bpbandet -> Nu måste jag visuellt avgöra om mitt DNA i ex brunn 14 lyser
lika mycket som 500bp bandet eller 1.5 ggr mer eller ½ så mycket. Lyser det lika starkt så
innehåller mitt DNA lika mycket som 500bp bandet, lyser det hälften så mycket så finns
det hälften så mycket……….
-FIGURTEXT ska finnas under alla figurer!!!!
-TABELLTEXT ovan alla tabeller!!!!
Hänvisa tydligt till figurer och tabeller i texten!!!
OBS! Om ni inte fått ett tillfredställande resultat på er egen gel kan ni utgå från den gelbild som
finns med i labbhandledningen och istället försöka använda och tolka detta resultat!!
DISKUSSION. Redogörelse för hur resultat tolkas. Om resultatet var exakt det väntade, om inte
varför blev det så då, var noga med att få med eventuella felkällor.
Ni kan även diskutera; sensitivitet och specificitet, samt hur viktigt det är att inte få spridning av
amplifierade PCR produkter och hur man undviker detta. Ni kan också ta tex medline till hjälp för att
hitta aktuell forskning kring bakterien L.pne och då framförallt metoder som finns för att
detektera/diagnostisera L.pne. Ett plus är att ta med andra metoder än agarosegel som finns för att
detektera PCR produkter tex. real-tids PCR.
REFERENSER. Ange vilken litteratur alt web adresser som används.
Referenser ska skrivas efter aktuell text och börja med [1] sen [2] osv….
Det är lite olika vad man använder för ”referens- system” (ni kommer att få lära er mer om det
senare). Det jag kan kräva nu är att ni skriver referenserna på ett konsekvent sätt dvs samma stil
rakt igenom.
Tänk på tempus i labbrapporten!
*Inledning: allmänt beskrivet ex. ”Legionella bakterien är en stavformad G- bakterie…..” ”PCR metoden är
baserad på följande steg…….”
*Material och metod: Det är ingen metodbeskrivning utan en beskrivning av vad ni har gjort ex. ” DNA från
legionella bakterien renades fram mha QIAgen tissue kit….” ”PCRéns master mix innehöll följande
komponenter…
*Resultat: ”Resultatet från spektrofotometermätnigen av det framrenade DNA´t gav följande
absorbansvärden…..””Analys av PCR produkter på EtBr inmärkt agarosgel visade att…(se figur…)
*Diskussion: ”Resultaten från den visuella koncentrationsbedömningen och koncentrations mätningen i
spektrofotometern vid 260 nm visar att dessa två metoder…..”” Resultaten från analysen av de nestade PCRprodukterna visar att kontamination har resulterat i falskt positiva resultat i ett flertal fall” ” Det är mest
troligt att kontaminationen har skett……andra troliga ….”
OBS! VIKTIG INFORMATION:
2
Legionella PCR labrabrapporten skickas fredagen den 21/10-11 läggs in på It´s och skickas
via mail till labhandledaren Ann Erlandsson mailadress: [email protected]. I samma
mail ska du ange en egen ”bokstavskod”.
Labhandledaren Ann Erlandsson ”kodar av” labrapporten genom att ta bort namn och
ersätta med en ”bokstavskoden”. Den kodade labrapporten skickas därefter till en eller
flera studenter som kontrollerar labrapporten mha en RÄTTNINGSMALL.
Kontrollen av en annan students labrapport ska vara färdig fredagen den 28/10-11 då
skickas den ifyllda mallen till labbhandledaren Ann Erlandsson via mail.
3
4
