Polymerase Chain Reaction
Biovetenskap och teknik
Ht-10
Annica Nordvall Bodell
[email protected]
Polymerase Chain Reaction
• Kary Mullis f.1944
• Presenterade PCR
i Science 1985
• Nobelpriset i kemi
1993
Vad är PCR?
• Kopieringsmaskin
för DNA?
• Kan påvisa att ett
prov innehåller en
viss gen
Varför var PCR revolutionerande?
• Kan kopiera EN SPECIFIK DNAsekvens bland tusen andra gener
• Snabb
(jämfört med genkloning)
• Känslig
kan detektera DNA från
enstaka celler
• Robust
kan detektera DNA från
fossila prover
Repetition: syntes av ny sträng
• Templat: ssDNA som
fungerar som mall för den
nya strängen
• Primer: för att starta DNAsyntesen
• Nukleotider(dNTP´s):
utgör ”byggstenar” i DNA
• DNA-polymeras: enzym
som bildar
fosfodiesterbindning
mellan 5´P och 3´OH
Vad behöver man i röret?
• Templat (prov med DNA)
• Forward primer
(startsekvens)
• Reverse primer
Primers
Nukleotider
DNA
Salt
Polymeras
Buffer
(startsekvens)
• dNTP´s (byggstenar)
• Taq DNA polymeras
• Buffert, salter
Vad händer i röret?
Tre steg:
• Denaturering
95oC
• Annealing av primers
55-70oC
• Syntes av ny sträng
72oC
www.ib.usp.br/evolucao/QTL/pcr.GIF
Detta upprepas 20-30
ggr
Två primers behövs
DNA templat
3’
5’
Taq
5’ forward Primer
Riktning på extension
Riktning på extension
3’ reverse Primer
Taq
5’
5’
5’
3’
• Forward primer
– Hybridiserar uppströms om genen
• Reverse primer
– Hybridiserar nedströms om genen
• Syntes ”in mot genen”
Taq DNA polymeras
http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.polymerase.jpg
• Värmestabilt
• Optimalt vid 72 °C
• Adderar
nukleotider
komplementära till
templatsträngen
• Dubbelsträngad
DNA bildas
• Syntes från 5´till 3´
http://www.cinnagen.com/images/smar%20taq%20dna%20polymerase.jpg
Amplifiering av
målsekvens!
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.ht
ml
Resultat
• Området mellan
primrarna; målområdet,
”target” amplifieras
exponentiellt
• x2 x2 x2 x2 osv….
• Efter 30 cykler har man
fått ca 1 x 109 kopior av
målområdet
Detektion av PCR-produkt
• Gelelektrofores
– Separation av
DNA
• Färgning av DNA
• Alt: Realtids- PCR
Vad betyder ett band i gelen
• Det har bildats DNAmolekyler vid PCRreaktionen.
• Primrarna måste ha bundit
till DNA i provet
• Det finns sekvenser som
är komplementära till
primrarna
• Slutsats: Vi har påvisat att
vårt mål-DNA fanns i
provet
Tillämpningar
• Diagnos av
bakt/virusinfektion
• Rättskemiska
analyser
• Diagnos av ärftliga
sjukdomar
• Sekvensering
• Kloning
• Kvantifiering av
genuttryck (RT-PCR)
• Med
mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
Begränsningar?
• Man måste känna till sekvensen på
båda sidor om den DNA-sekvens
man vill amplifiera
• Kan ej amplifiera långa gener
Problem vid PCR
• Ospecifika produkter
• Kontamination
• Inhibition
Optimering av PCR-reaktion
• Val av primerpar
• Annealingtemperaturen (beror på
primers)
• Mg2+-koncentration
Ospecifika produkter
• Vad har hänt?
• Hur kan det bildas
flera produkter?
Primerlängd
• 8-mer ger statistiskt
46000 möjliga sekvenser
att hybridisera till i
humana genomet
• 17-mer har 1 chans på
17179869184 bp att
slumpmässigt hitta en
komplementär sekvens
Fig. 11.5 Brown Gene Cloning
Kontamination
• ”Carry-over”
kontamination från
ett amplifierat
positivt prov till ett
nytt prov
Positivt
prov
Negativt
prov
•
En aerosoldroppe kan
innehålla 500 kopior av
målområdet
•
Efter amplifiering har man fått
miljoner kopior; falskt positivt
prov
För att upptäcka ev.
kontaminering körs en negativ
kontroll (utan templat DNA)
kontamination
•
Separata rum
• DNA extraktion
• prePCR rum (renrum)
• PCR rum
Inhibering
• Rester från prov eller DNA-extraktion
kan inhibera PCR-reaktionen
• Risk för falskt negativa prov
• Intern kontroll tillsätts, om den inte
amplifieras tyder det på inhibering
PCR-film
Brister med traditionell PCR
• Separata steg för amplifiering och
detektion; risk för kontaminering
• Långsam, svår att automatisera
• Mäter vid slutpunkt; osäker kvantif.
• Svårt att jämföra effektivitet vid olika
PCR-reaktioner
Realtids-PCR
• Mha fluorescerande molekyler kan
man detektera PCR-produkter varje
cykel
• Mätning av PCR-produkter under den
exponentiella fasen ger ett säkrare
värde än mätning efter att alla cykler
körts (end point)
End point/Real time
• Konventionell PCR
– Analyserar produkten vid
slutpunkt
• Realtidsmätning
– Bildad produkt
detekteras med
fluorimeter
– Mäter PCR-produkt vid
http://www.lightcycler-online.com/
lc_principles/lc_principles_ind.htm
varje cykel
CT = Cykel vid tröskelvärde
• Exponentiell fas. Varje
cykel: 2x DNA Vid ett
visst antal cykler har
signalen nått över
bakgrunden
• CT=den cykel när
signalen passerar
”tröskeln”
• Ju mer mål-DNA
desto lägre CT
(BioRad)
Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering
96 replikat av identisk reaktion
Tröskelvärde (CT)
varierar inte
•(Fig från
BioRad)
Slutlig
mängd
varierar
VARFÖR?
Realtids-PCR
iCycler BioRad,
mikrotiterplattor
LightCycler Roche,
kapillärer
ABI Prism 7000
Applied Biosystem
mikrotiterplattor
Realtids-PCR
Fördelar
– Lättare att undvika kontamination
• Behöver ej öppna röret för detektion
– Säkrare kvantifiering av mål-DNA
Realtids-PCR
Tillämpningar
– Kvantitativ analys (Q-PCR)
• Ex. jmf mRNA i olika celler
– Multiplex PCR (flera primerpar ger flera olika
PCR-produkter)
• Ex. detektera flera virustyper i samma prov
– Detektion av mutationer (med FRETprober
och smältkurvsanalys)
Spel
• http://nobelprize.org/educational_games/
chemistry/pcr/index.html
Länkar
Gör en virtuell PCR: Gå in på nedanstående länk,
http://www.biointeractive.org/vlabs/index.html
Välj The Bacterial Identification Lab,
Öppna dörren till labbet och kör en PCR!
