Uttryck av Ano1 möjliggör
identifiering av ICC i rötsimpa
Linn Bengtén
Uppsats för avläggande av naturvetenskaplig kandidatexamen i
Biologi
BIO602 Biologi: Examensarbete 15 hp
HT 2013
Institutionen för Biologi och Miljövetenskap
Göteborgs universitet
Examinator: Thrandur Björnsson
Institutionen för Biologi och Miljövetenskap
Göteborgs universitet
Handledare: Catharina Olsson
Institutionen för Biologi och Miljövetenskap
Göteborgs universitet
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
SAMMANFATTNING ...................................................................................................... 2
NYCKELORD ................................................................................................................... 2
INLEDNING....................................................................................................................... 3
METOD .............................................................................................................................. 4
RESULTAT ....................................................................................................................... 6
DISKUSSION.................................................................................................................... 8
TACKORD......................................................................................................................... 9
REFERENSER ............................................................................................................... 10
1
Sammanfattning
Interstitiella Cajal-celler, ICC, är involverade i kontrollen av mag-tarmkanalens motilitet, där de bland annat
fungerar som pacemaker-celler genom att de genererar så kallade slow-waves, cykliskt återkommande
depolariseringar av membranpotentialen. Slow-waves underlättar uppkomsten av aktionspotential, vilket i
sin tur leder till att närliggande glatt muskulatur kontraherar. ICC förekommer både i det myenteriska plexat
och i muskellagren i hela mag-tarmkanalen hos ett flertal däggdjursarter och kan visualiseras med hjälp av
exempelvis immunohistokemi. Metoden går ut på att antikroppar binder in till antigener inuti eller på ytan av
cellen. Antikroppen är kopplad till en fluorescerande markör, som möjliggör att cellens utseende kan
bestämmas genom mikroskopi. Hos mammalier har man ofta använt en antikropp mot antigenen c-kjit för
att lokalisera ICC. I försök på fisk har anti-c-kit däremot fungerat sämre. En ny studie har visat att
antikroppar mot en annan ICC-markör, nämligen anoctamin 1 (ano1), har gett lyckat resultat på zebrafisk,
Danio rerio. Syftet med studien var att ta reda på om anti-ano1 fungerar bra även i rötsimpa,
Myoxocephalus scorpius. Både utbredningspreparat och kryosnitt användes och ICC-liknande celler kunde
detekteras med ano1-antiserum i mag-tarmkanalens samtliga delar. Analys av utbredningspreparaten
lokaliserade ICC till det myenteriska plexat och samtidig immunoinfärgning av nervfibrer visade att ICC ofta
ligger i nära anslutning till nervplexat. De ano1-positiva cellerna har cellkroppar med en trekantig form och
från cellkroppen sträcker sig utskott mot närliggande ICC och glatta muskelceller. Utskotten från alla celler
bildar tillsammans ett nätverk vars utseende verkar variera i mag-tarmkanalens olika delar. I magsäcken är
nätverket glesare och cellerna större, medan de i tarmen uppskattningsvis är fler till antalet och bildar ett
tätare nätverk. Kryosnitten kunde avslöja närvaro av ICC, förutom i det myenteriska plexat, även i de
cirkulära och longitudinella muskellagren. Den lyckade infärgningen av ano1-positiva celler tyder på att
ano1 fungerar som markör för ICC i rötsimpa.
Abstract
Interstitial cells of Cajal, ICC, are involved in the control of gut motility by spontaneously generating slow
waves, cyclic depolarizations of the membrane potential. Slow-waves ease the formation of action
potentials, which will lead to contraction of smooth muscle cells. ICC are located to the myenteric plexus
and muscle layers throughout the GI tract in many mammalians and it is possible to visualize them with
immunohistochemistry. In this method, antibodies attach to antigens located inside or on the surface of the
cell. A fluorescent marker is connected to the antibody, which enables microscopic analysis of the cells. To
localize ICC in mammals, the antigen c-kit is used, but using anti-c-kit in fish is less successful. Another
antigen, anoctamin 1 (ano1), that was discovered later on, was targeted successfully in zebra fish, Danio
rerio. The aim of this study was to find out whether anti-ano1 is a good marker of ICC also in the shorthorn
sculpin, Myoxocephalus scorpius. Both cryosections and whole mounts were used and ICC were identified
in the GI tract. ICC could be localized to the myenteric plexus and simultaneous double staining of nerve
fibers and ICC showed that ICC are located close to the nerve plexus. The cell bodies of the ano1-positve
cells are triangular and have processes that extend towards other ICC and smooth muscle cells, forming a
network with a variable appearance throughout the GI tract. In the stomach, this network is sparser and the
cells are bigger in size, while in the intestine ICC are forming a denser network. The cryosections revealed
presence of ICC in both the myenteric plexa and in the circular and longitudinal muscle layers. The
successful immunolabeling of ano-1-positive cells indicate that ano1 is a selective marker of ICC in the GI
tract of shorthorn sculpin.
Nyckelord
Cajal-celler; ICC; Anoctamin 1; Rötsimpa; Immunohistokemi
2
Inledning
Mag-tarmkanalens motilitet
Tarmens förmåga att kontrahera möjliggör att föda kan transporteras genom tarmen, samt att födan
exponeras bättre för enzymer när den blandas p.g.a. tarmens rörelser (Olsson och Holmgren, 2001).
Interstitiella Cajal-celler, ICC, kontrollerar tillsammans med enteriska neuroner och glatta muskelceller
motiliteten i mag-tarmkanalen. ICC fungerar där som pacemaker-celler genom att de spontant generar s.k.
slow-waves, som sedan sprids till närliggande glatta muskelceller (Burns et al., 2009). Slow-waves är
cykliska depolariseringar och repolariseringar som ger upphov till ett vågliknande utseende hos
membranpotentialen. De glatta muskelcellerna reagerar på aktionspotential, som underlättas av slowwaves, genom att kontrahera. Glatta muskelceller kan alltså inte på egen hand generera slow-waves, utan
är beroende av initieringen som sker i ICC och det krävs oftast stimuli från nerver eller hormoner utöver
slow-wave aktiviteten för att aktionspotentialen ska bildas. Slow-waves styr kontraktionsfrekvensen på ett
sådant sätt att frekvensen är optimal för bearbetning av födan i tamren (Horowitz et al., 1999). Spridningen
är möjlig tack vare s.k. gap junctions; kanaler i cellmembranet som tillåter joner och molekyler att förflytta
sig från cytoplasman hos en cell till en annan (Alberts et al., 2009). Man har sett att frånvaro av ICC i
tarmvävnad resulterar i att slow-wave aktiviteten upphör och detta ger starka indikationer på att ICC är
involverade i den elektriska aktiviteten i mag-tarmkanalen (Horowitz et al., 1999). Kontrollen av motiliteten
är likartad i olika vertebratklasser, men det är i dagsläget oklart om slow-waves förekommer i fisk. För
närvarande bedrivs forskning på rötsimpans tarmmotilitet där olika motilitetsmönster undersöks in vivo och
resultaten från den studien indikerar att vissa mönster är styrda av slow waves (Brijs et al., 2013).
ICCs undergrupper
ICC kan delas in i undergrupper, där det är IC-MY som står för initieringen av slow-waves. IC-MY är
lokaliserade till det myenteriska plexat (Fig. 1) till skillnad från IC-IM, intramuskulär ICC, som ligger
inbäddade i de cirkulära och longitudinella muskellagren. IC-IM har visat sig uttrycka receptorer för flera
neurotransmittorer (Epperson et al., 2000) och hittas i nära anslutning till enteriska motorneuron (Hwang et
al., 1999) och tros därmed kunna överföra signaler från enteriska nervsystemet till den glatta muskulaturen.
Figur 1: Genomskärning av tarmväggen hos de flesta
vertebrater. Tarmväggen kan delas in i olika lager med
mukosan närmast lumen (tarmens insida), submucokan,
cirkulärt muskellager, myenteriska plexat och ytterst
longitudinellt muskellager. ICC är lokaliserat till det
myenteriska plexat och även till de cirkulära och longitudinella
muskellagren.
Identifiering av ICC
ICC identifierades första gången av den spanska neuroanatomisten Santiago Ramón y Cajal i slutet av
1800-talet. Han hade lyckats färga in dessa multipolära celler med både metylenblått och Golgi-metoden,
som båda också ger infärgning av nervceller. Han drog därför slutsatsen att cellerna han hittat var av
neuronalt ursprung (Thuneberg, 1999). Idag betraktas dock ICC som mesenkymala celler och har alltså
inte neuronalt ursprung som från början föreslagits (Young, 1999). Det skulle ta flera decennier innan det
blev möjligt att identifiera ICC med elektonmikroskopi och först på 1990-talet, när Madea och hans
medarbetare upptäckte att ICC uttrycker proteinkinaset c-kit, kunde cellerna identifieras med den idag
vanligt förkommande metoden immunohistokemi (se metod), vilket avsevärt har underlättat identifieringen
3
av cellerna (Madea et al., 1992). Genom att framställa antikroppar mot c-kit kan man studera utbredning
och utseende av ICC i mag-tarmkanalen hos däggdjur. Försök med anti-c-kit på fisk har däremot fungerat
sämre och på grund av avsaknaden av lämplig antikropp mot c-kit eller mot någon annan ICC-markör har
det varit svårt att helt bevisa förekomst av ICC i fisk. I en studie från 1940-talet finns det dock beskrivningar
av ICC-liknande celler, infärgade med metylenblått, i det myenteriska plexat i fisk (Kirtisinghe, 1940).
Ano1 - ny ICC-markör
Förutom c-kit uttrycks även en annan antigen, nämligen anoctamin 1 (ano 1), på ICC. Ano1 upptäcktes
senare än c-kit och är ett membranprotein som ansvarar för den Ca2+-aktiverade Cl−-transporten (Caputo et
al., 2008) och är involverad i genereringen av slow-waves (Hwang et al., 2009). Med immunoinfärgning kan
man se stora likheter mellan uttryck av ano1 och när man jämför med mönstret av uttryckt c-kit (Espinosa
et al. 2008). Antikroppar mot ano 1 infärgar samtliga klasser av ICC i hela mag-tarmkanalen hos mus och
människa och när man använder ano 1 som markör slipper man dessutom problemet med att även
mastceller infärgas, vilket är fallet då antikroppar används mot c-kit. Ano1 ger dessutom tydligare
infärgning av fler klasser av ICC (Gomez-Pinilla et al. 2009). Ano1 har även med framgång nyligen visats
färga in ICC i zebrafisk (Uytterbroek et al., 2013), vilket ger förhoppningen att uttrycket av ano1 delas av
andra fiskarter. Dock har ingen mer detaljerad studie av ICCs utbredning och olika undergrupper i fisk
gjorts.
Studiens syfte
Studiens huvudsakliga syfte är att utvärdera om en kommersiellt tillgänglig antikropp mot ano 1 kan
användas för att identifiera ICC i rötsimpa, Myoxocephalus scorpius. Ett ytterligare mål är i så fall att
beskriva utbredning och morfologi hos dessa ICC. Valet av rötsimpa som studeringsobjekt beror på att den
pågående studien av Brijs et al. (2013) indikerar att slow waves är närvarande i rötsimpa.
Metod
För försöket användes rötsimpa, Myoxocephalus scorpius (n=2). Fiskarna var vildfångade av en lokal
leverantör på Sveriges västkust och hölls i akvarier (cirkulerande havsvatten vid 10°C, matade en gång i
veckan) på zoologen på Institutionen för Biologi och Miljövetenskap. Dessutom användes zebrafisk, Danio
rerio (n=1) som kontroll. Dessa var köpta från lokal zooaffär och hölls i akvarier (rumstemperatur, matning
3-5 gånger i veckan) i samma byggnad som rötsimpan. Försöken var godkända av Göteborgs
djurförsöksetiska nämnd (Dnr. 367-2011, 368-2011).
Preparation av vävnad
Rötsimpan avlivades med slag mot huvudet och mag- tarmkanalen dissekerades ut och sköljdes i
fosfatbuffert (PBS; 0.1 M, NaCl 0.9%, pH 7.3). Magsäcken och tarmen klipptes upp, och prover togs från
sex olika delar (Fig.2). Dessa sträcktes och nålades upp på dentalvaxplattor innan de fixerades i 4%
formalin i fosfatbuffert (0.1 M, pH 7,3) i 2 timmar i rumstemperatur varefter de sköljdes i PBS. Zebrafisken
behandlades på samma sätt, med undantaget att de i stället dekapiterades, samt att endast tre delar av
tarmen behandlades. Vävnaden förvarandes i PBS till dess att den skulle användas. Både
utbredningspreparat och kryosnitt användes. Vävnad som skulle bli utbredningspreparat peelades genom
att mukosan, submukosan och det mesta av det cirkulära muskellagret skalades bort så att det
myenteriska plexat blottades. Vävnad som skulle kryosnittas förvarades i PBS innehållande sukros (30%)
över natt och frystes sedan ner i isopentan kyld med flytande kväve. Vävnadsbitarna var inbäddade i
Tissue-Tek O.C.T Compound (Sakura, Nederländerna) och 10 µm tunna tvärsnitt skars av preparatet.
Skivorna placerades på gelatinbehandlade objektsglas och torkade i rumstemperatur.
4
Figur 2 Mag-tarmkanalen hos rötsimpa. Magsäcken delas in i cardiac-magen (CS) och
pylorus-mage (PS). Mellan magsäcken och tarmen sitter de så kallade pylorus-utskotten.
Tarmen kan delas in i fyra delar: Proximal tarm (PI), mellantarm (MI), distal tarm (DI) samt
rektum (R). Den anatomiska gränsen mellan rektum och övriga tarmen är relativt tydlig, medan
övergången från PI till MI och sedan DI är mer svävande.
Immunohistokemi
Indirekt immunohistokemi användes för visualisering av ICC (Fig. 3). Kryosnitten förbehandlades inför
immunoinfärgningen med PBS innehållande 10% NDS (normalt åsneserum, normal donkey serum), 0,1%
BSA (bovint serumalbumin) och 0,2% Triton X-100. Utbredningspreparaten förbehandlades med PBS
innehållande 5% NDS, 5% BSA och 5% Triton X-100. Förbehandlingen förbättrar slutresultatet genom att
inbindningen av antikropparna till vävnaden optimeras.
Figur 3 En metod som används för att identifiera ICC är immunohistokemi. Metoden går ut
på att antikroppar binder in till antigener antingen inuti cellen eller på dess yta. De
olikfärgade figurerna av olika form representerar olika typer av antigener som är lokaliserade
i cellmembranet. Antikroppen är kopplad till en fluorescerande markör (grön), som möjliggör
att cellens utseende och struktur kan bestämmas genom mikroskopi. Vid direkt
immunohistokemi binder endast primära antikroppar (svart) med markör in till antigenen
(visas ej på bilden). Det finns dock en fördel med att använda ett system med både primära
(svart) och sekundära (lila) antikroppar, indirekt immunohistokemi, eftersom det blir
ytterligare signalförstärkning (www.ihcworld.com, 2013).
De flesta preparaten inkuberades med en kombination av två primära antikroppar, riktade mot anoctamin 1
och endera av nervmarkörerna acetylerat tubulin, acT, eller human neuronal protein, Hu C/D, som fick
verka över natt och sköljdes sedan i PBS. Antikropparna var tillverkade i olika värddjur (kanin respektive
mus). För att kunna identifiera de primära antikropparna fick sekundära antikroppar, som är riktade mot
antikropp i respektive värddjur, binda in till varsin primär antikropp. Dessa fick verka i 2 timmar varefter
preparaten sköljdes i PBS. Antikropparna späddes (Tab. 1 och 2) med spädningsmedium (0,1 M PBS med
0.1% BSA, 0.2% NaN3 och 0.2% Triton X-100) De sekundära antikropparna är i förväg kopplade till en
fluorofor som fluorescerar vid olika våglängd när de belyses med UV-ljus i mikroskop. Tack vare specifika
filter i mikroskopet kan man skilja dem åt och kan på så sätt visualisera olika celltyper i samma preparat.
Innan preparaten undersöktes i fluorecensmikroskop (Nikon Eclipse E1000) sköljdes de i PBS och
monterades med monteringsmedium (Vectashield mountning medium for fluorescence H-1000, Vactor
Labs, USA). Fotografierna togs med hälp av programmet ACT och behandlades i Adobe Photoshop och
Microsoft_Office_Powepoint.
Tabell 1 Primära antikroppar och dess spädningar.
mot antigen
värddjur
kod
leverantör
spädning
acetylerad tubulin, AcT
mus
T-6793
Sigma-Aldrich
1:1000
anoctamin 1, ano1
kanin
ab53212
Abcam
1:1000
c-kit
kanin
sc-168
Santa Cruz Biotechnology
1:200
human neuronal protein, Hu C/D
mus
A21271
Molecular probes
1:200
5
Tabell 2 Sekundära antikroppar och dess spädningar. Samtliga har värddjuret åsna.
antikropp
fluorofor
kod
riktad mot
leverantör
spädning
DaM-CY3
mus
CY3
715-165-150
Jackson ImmunorResearch Lab
1:800
DaM-FITC
mus
FITC
715-095-150
Jackson ImmunorResearch Lab
1:100
DaR-CY3
kanin
CY3
711-165-152
Jackson ImmunorResearch Lab
1:800
DaR-FITC
kanin
FITC
711-095-152
Jackson ImmunorResearch Lab
1:100
CY3, cyanin; FITC, fluorescein isotiocyanat
Kontroll
Specificiteten hos de sekundära antikropparna kontrollerades genom att utesluta primära antikroppar, men
i övrigt följdes utförandet enligt beskrivningen ovan. Ingen ospecifik infärgning med de sekundära
antikropparna kunde noteras.
Resultat
Mikroskopianalysen visade närvaro av ano-1-immunoreaktiva celler i både utbredningspreparaten och
kryosnitten.
Utbredningspreparat
Ano1-positiva celler kunde detekteras i utbredningspreparat från samtliga delar av mag-tarmkanalen i
rötsimpa (Fig. 4). Cellerna bildade ett mer eller mindre tätt, sammanhängade nätverk i myenteriska plexat
längs hela mag-tarmakanlen. Utseendet hos de ICC-liknande cellerna skiljer sig något åt beroende på
vilken del av mag-tarmkanalen som studerades (fig 4C,D). I magsäcken är cellerna större och grövre
jämfört med i tarmen och nätverket som cellerna tillsammans bildar är glesare. I större förstoring (Fig. 4A)
kan multipolära cellkroppar, som är typiska för ICC, urskiljas.
Figur 4 Utbredningspreparat från cardiac-magen (A,B,C)
och proximala tarmen (D) i rötsimpa. Vävnaden är infärgad
med anti-ano1. A. I hög förstoring (40X-objektiv) syns
cellkroppen (se pil) och utskotten på de ICC-liknande
cellerna. B. ICC i cardiac-magen bildar ett oregelbundet
nätverk (se pilen). C. och D. är i samma förstoring och visar
på skillnader i storlek och struktur hos ICC-liknande celler.
Skalsträck 100 µm.
6
Dubbelinfärgning
För att få en uppfattning hur ICC förhåller sig till nervcellplexat gjordes en dubbelinfärgning mot markören
acetylerat tubulin, AcT, som infärgar nervfibrer. När de ICC-liknande cellerna jämfördes med nervfibrerna
vid låg förstoring syntes hur de ano1-positiva cellerna följde nervplexat (Fig. 5A,B) och vid en högre
förstoring syntes tydliga skillnader (Fig. 5C,D,E). De ICC-liknande cellerna verkar vara lokaliserade i nära
anslutning till nervfibrerna, men de ano1-positiva cellerna har fler förgreningar än nervfibrerna. På större
förstoring kan man således lätt avgöra att det rör sig om två olika celltyper eftersom de ano1-positiva
cellerna föregrenar sig mer än vad nervcellerna gör (Fig. 5E)
figur 5 Utbredningspreparat från
den distala tarmen i rötsimpa.
Vävnaden är dubbelinfärgad med
antikroppar mot ano1 (A,C) och
AcT(B,D). Med anti-AcT färgas
nervfibrer. A - B. Vid lägre
förstoring (10X-objektiv) ger de
två antikropparna snarlik
infärgning, men ICC ligger tätare
än nervfibrerna. C-E. Vid högre
förstoring (40X-objektiv) syns
dock tydliga skillnader i
strukturen (pilarna anger ett
exempel på en sådan skillnad).
E. visar en sammanslagning av C
och D, där man ännu tydligare
kan se skillnaderna mellan ICCnätverket och nervfibrerna.
Skalsträck 100 µm.
Kryosnitt
Kryosnitten visade närvaro av ano1-positiva celler i det myenteriska plexat. Dubbelinfärgning med
antikroppar mot AcT resulterade i infärgning av nervtrådar dels i det myenteriska plexat, men också i
muskellagren och mukosan (Fig. 6A,B). Ano1-positiva celler kunde även lokaliseras till den glatta
muskulaturen, även om närvaron var störst i det myenteriska plexat (Fig. 6C). Med kryosnitten fick man en
bra bild av ICCs utbredning, men till skillnad från utbredningspreparaten så kunde man inte se specifika
morfologiska drag hos ICC.
7
figur 6 Tvärsnitt från distala tarmen (A,B) och cardiac-magen (C) i rötsimpa. A. Antikropp mot ano1 har infärgat celler i det
myenteriska plexat (mp, se pil). Övriga lager i tarmen är markerade i bilden (lm, cm, sm, och m) B. AcT-positiva celler har infärgats
i flera av mag-tarmkanalens olika lager. C. Antikropp mot ano 1 har infärgat celler i det myenteriska plexat (mp, se pil ). Även i de
longitudinella (lm) och cirkulära (cm) muskellagren har celler infärgats (se pilar ). Övriga lager i magsäcken är också markerade i
bilden (sm och m). För mer detaljerad beskrivning av väggen i mag-tarmkanalen, se inledning. Skalsträck 100 µm.
Kontroll
Ingen infärgning kunde noteras när de primära antikropparna hade uteslutits. Immunoinfärgade
utbredningspreparat från mag-tarmkanalen hos zebrafisk gav däremot infärgning av ICC-liknande celler.
Diskussion
Resultatet av den här studien visar att ICC-lika celler är vanligt förekommande i hela mag-tarmkanalen hos
rötsimpa. Identifieringen var möjlig tack vare att antikroppar mot ano1 (i däggdjur) immunoinfärgar ICC i
fisk. Antikropp mot ano1 har tidigare möjliggjort infärgning av ICC i människa och mus (Gomez-Pinilla et
al., 2009) och nyligen också i zebrafisk (Uytterbroek et al. 2013). De ICC-liknande cellerna hade ett
utseende som kunde liknas vid tidigare beskriven cellmorfologi av ICC i däggdjur. IC-MY i däggdjur har
trekantig eller multipolär cellkropp med flera utskott som förgrenar sig och bildar ett nätverk som hittas i
nära anslutning till nervplexat (Sanders, 1996). Denna morfologiska beskrivning överensstämmer väl med
de celler som hittades med hjälp av ano1 antiserum i rötsimpa, vilket styrker möjligheten att de infärgade
cellerna verkligen är ICC. Fördelningen av ICC och nätverkets struktur skiljer sig beroende på vilken del av
mag-tarmkanalen som studeras (Komuro, 2006). Denna beskrivning av ICCs utbredning genom magtarmkanalen kan kopplas till resultaten av denna studie som visar att ICC-lika celler finns i hela magtarmkanalen, samt att ICC-nätverket i magsäcken, är glesare än i tarmen, hos rötsimpa.
Dubbelinfärgning med antikroppar mot både ano1 och acetylerat tubulin (AcT), som ger visualisering av
nervfibrer, avslöjade att nätverket av IC-MY ofta ligger i anslutning till nervplexat. Dubbelinfärgningen
visade dock tydligt att det inte föreligger något överlapp mellan ICC och nervceller. Det var Imaizumi och
Hamai (1969) som efter upptäckten att nervceller innerverar ICC, föreslog att ICC har som roll att överföra
stimuli från nervceller till glatta muskelceller. Det är alltså fördelaktigt om ICC är lokaliserade i anslutning
tillnervplexat, eftersom innerveringen underlättas om avståndet mellan ICC och den glatta muskelcellen är
så litet som möjligt.
Kryosnitten gav information om i vilka lager ICC finns och hur stor utbredningen av ICC är i de olika lagren.
Snitten avslöjade förekomst av ano1-positiva celler förutom i det myenteriska plexat, även i de cirkulära
och longitudinella muskellagren. Ano1-positiva celler fanns längs med hela myenteriska plexat med
undantag från små partier i magsäcken som saknade infärgning. I muskellagren låg de ano1-positiva
cellerna istället utspridda i grupper. IC-IM, den undergrupp av ICC som påträffas i de två lagren av glatt
muskulatur hos däggdjur, skiljer sig utseendemässigt från IC-MY cellerna genom sin bipolära cellkropp
(Gomez-Pinilla et al., 2009). Även om förekomst av ano 1-positiva celler i muskellagren kunde bekräftas
8
med kryosnitten, så var inte cellmorfologisk jämförelse med IC-IM i mammalier genomförbar, eftersom
snitten inte gav någon information om de ano1-immunoreaktiva cellernas utseende.
Det finns motstridiga resultat när det gäller c-kit-positiva celler i fisk. I de studier där immunoinfärgning mot
c-kit i fisk gjorts har det varit blandade resultat, trots att samma antikropp och metod använts. I en studie av
Rich et al. (2007) fick man infärgning av ICC med anti-c-kit i zebrafisk, men Uytterbroek et al. (2013) och
Olsson och Holmberg (opublicerad) fick inte någon infärgning i vare sig zebrafisk eller rötsimpa. I denna
studie uteblev också infärgning av c-kit vid försök att infärga ICC med c-kit som markör. Det är oklart varför
infärgning med antikropp mot c-kit fungerat i en studie, men inte kunnat upprepas i andra studier.
ICC-lika celler kunde identifieras i de två individer som undersöktes i studien, men för att få en ännu
tydligare bild av utbredningen av ICC i rötsimpa bör man upprepa immunoinfärgningen på ett större antal
individer. I studien där ano1 bekräftads vara en selektiv markör för ICC hos däggdjur (Gomez-Pinilla et al.,
2009) gjordes en dubbellokalisering av ano1 och c-kit i syfte att verifiera att de ano1-positiva var ICC. Detta
är i nuläget möjligt att göra endast i däggdjur som har två kända markörer för ICC. En dubbellokalisering i
fisk är möjlig först när ytterligare markörer för ICC upptäckts.
Hos däggdjur har ICC en roll i kontrollen av motiliteten av mag-tarmkanalen (Farrugia, 2008), men
eftersom man inte lyckats bekräfta att ICC även finns i fisk så har man heller inte kunnat veta om
tarmkontraktionerna delvis styrs av slow-waves som hos däggdjur, eller om tarmkontraktioner hos fisk
fungerar på ett annorlunda sätt. Som en påbyggnad av studien skulle man kunna undersöka om IC-MY har
samma funktion i fisk som de har i däggdjur, d.v.s. generera slow-waves. Langton med medarbetare
kunde, med hjälp av patch-clamp metoden, visa att ICC är exciterbara och spontant genererar slow-waves
(Langton et al., 1989). Med samma metod skulle man kunna undersöka den elektriska aktiviteten hos de
ano1-positiva cellerna hos fisk och därmed kunna avgöra om dessa celler har samma funktion som hos
mammalier. Studien på tarmmotiliteten hos rötsimpa (Brijs et al., 1013) där man försöker karaktärisera
tarmens rörelsemönster, fann man att vissa rörelsemönster kvarstog även om nervsignaleringen slogs ut,
vilket tyder på att det är slow waves som är med och styr tarmmotiliteten hos fisk. Nu när man hittat en
fungerande markör för ICC i fisk kan studier av den här typen breddas med vidare utforskning av ICC’s roll
i kontrollen av mag- och tarmkanalens funktioner. När det nu finns indikationer på att ICC även finns i fisk,
uppkommer möjligheten att vidare undersöka om ett samband föreligger mellan ICC och slow-waves i fisk.
I en nyligen publicerad studie på zebrafisk av Rich med medarbetare föreslås det att c-kit-positiva celler
krävs för ett samordnat motilitetsmönster. I studien studerades zebrafiskens larver och man upptäckte att
uppkomsten av koordinerad tarmmotilitet visade sig sammanfalla med den tidpunkt då ICC-lika celler
kunde urskiljas hos larven (Rich et al., 2013).
Sammanfattningsvis, så tyder resultaten i studien på att interstitiella Cajal-celler kan lokaliseras till det
myenteriska plexat och till de cirkulära och longitudinella muskellagren i mag-tarmkanalen hos rötsimpa.
Detta kan bekräftas eftersom studien visar att antikroppar mot Ano1 ger infärgning av celler som är
morfologiskt identiska med ICC i däggdjur. Nätverket som bildas av utskotten hos IC-MY ser något olika ut
vid jämförelse av nätverket i magsäcken med tarmen. Stödet för ICCs existens i fisk öppnar för nya
möjligheter att vidare undersöka mag-tarmkanalens elektriska egenskaper.
Tackord
Tack till GENI-gruppen som jag fick vara en del av under projektets gång och till Anna Ansebo för
assistans inför laborerandet. Särskilt tack till min handledare Catharina Olsson för laborativa
demonstrationer och stöd i skrivandet.
9
Referenser
Alberts B, Bray D, Hopkin K, D Johnson A, Lewis J. Essential Cell Biology. Ed 3, Garland publisher; 2009
Brijs J, Hennig G, Axelsson M, Olsson C. The rumblings of the Shorthorn sculpin gut! Effects of food on motility in the proximal
intestine of a fish species. SEB (Society for Experimental Biology) annual meeting Valencia 2013.
Burns AJ, Roberts RR, Bornstein JC, Young HM. Development of the enteric nervous system and its role in intestinal motility
during fetal and early postnatal stages. Semin Pediatr Surg, 2009;18: 196-205
Caputo A, Caci E, Ferrera L, Pedemonte N, Barsanti C, Sondo E, Pfeffer U, Ravazzolo R, Zegarra-Moran O, J. V. Galietta L.
TMEM16A, A Membrane Protein Associated with Calcium-Dependent Chloride Channel Activity. Science, 2008; 322: 590-594
Epperson A, Hatton WJ, Callaghan B, Doherty P, Walker RL, Sanders KM, Ward SM, Horowitz B. Molecular
markers expressed in cultured and freshly isolated interstitial cells of Cajal. Am J Physiol Cell Physiol, 2000; 279: 529539.
Espinosa I, Lee CH, Kim MK, Rouse BT, Subramanian S, Montgomery K, Varma S, Corless C, Heinrich M, Smith K, Wang
Z, Rubin B, Nielsen T, Seitz R, Ross D, West R, Cleary M, van de Rijn M. A novel monochlonal antibody against DOG1 is a
sensitive and specific marker for gastrointestinal stromal tumors. Am J Surg Pathol, 2008; 32: 210-218
Farrugia G. Interstitial cells of Cajal in health and disease. Neurogastroenterol Motil, 2008;1: 54-63
Gomez-Pinilla PJ, Gibbons SJ, Bardsley MR, Lorincz A, Pozo MJ, Pasricha PJ, Van de Rijn M, West RB, Sarr MG, Kendrick
ML, Cima RR, Dozois EJ, Larson DW, Ordog T, Farrugia G. Ano 1 is a selective marker of interstitial cells of cajal in the human
and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2009; 296:1370-1381
Horowitz B, Ward SM, M. Sanders KM. Cellular and molecular basis for electrical rhythmicity in gastrointestinal
muscles. Annual Review of Physiology, 1999; 61: 19-43
Hwang SJ, Blair PJ, Britton FC, O'Driscoll KE, Hennig G, Bayguinov YR, Rock JR, Harfe BD, Sanders KM, Ward SM.
Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.
J Physiol, 2009; 587: 4887-4904
Imaizumi M, Hama K. An electron microscopic study on the interstitial cells of the gizzard in the love-bird (Uroloncha domestica).
Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie,1969; 3: 351-357
Kirtisinghe P. The Myenteric Nerve-Plexus in some lower Chordates. Quarterly Journal of Microscopical Science,1940; 81:521539
Komuro T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol, 2006; 576: 653-658
Langton P, Ward SM, Carl A, Norell MA, Sanders KM. Spontaneous electrical activity of interstitial cells of Cajal isolated from
canine proximal colon. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989; 86: 7280–7284
Maeda H, Yamagata A, Nishikawa S, Yoshinaga K, Kobayashi S, Nishi K, Nishikawa S. Requirement of c-kit for development
of intestinal pacemaker system. Development,1992;116:369-375.
Olsson C, Holmgren S. The control of gut motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2001; 28:481-503
Rich A, Leddon SA, Hess SL, Gibbons SJ, Miller S, Xu X, Farrugia G. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal
tract reveals putative ICC. Dev Dyn, 2007; 236: 903-911
Rich A, Gordon S, Brown C, Gibbons SJ, Schaefer K, Hennig G, Farrugia G. Kit Signaling Is Required for Development of
Coordinated Motility Patterns in Zebrafish Gastrointestinal Tract. Zebrafish, 2013; 10: 154-160.
Sanders KM. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.
Gastroenterology, 1996; 111: 492-515.
Sanders KM, Don Koh S, M. Ward S. Interstitial cells of Cajal as pacemakers in the gastrointestinal tract. Annual Review of
Physiology, 2005; 68: 307-343
10
Suzuki N, Prosser CL, Dahms V. Boundary cells between longitudinal and circular layers: essential for electrical slow waves in
cat intestine. Am J Physiol, 1986; 250: 287-294
Thuneberg L. One hundred years of interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech, 1999; 47: 223-238
Uyttebroek L, Shepherd IT, Hubens G, Timmermans JP, Van Nassauw L. Expression of neuropeptides and anoctamin 1 in the
embryonic and adult zebrafish intestine, revealing neuronal subpopulations and ICC-like cells. Cell Tissue Res, 2013; 354:355-370.
Young HM. Embryological origin of interstitial cells of Cajal. Microsc Res Tech, 1999; 47: 303-308.
www.ihcworld.com, 2013
11
