11- 13 december 2006
Christina Fjæraa
Doktorand, avd för kemi och biomedicinsk vetenskap
Karlstads Universitet
[email protected]
054-7001687
Immunologi
Laboration; ej organspecifika
autoimmuna sjukdomar.
• Partikelagglutinationtest för
reumatoid faktor (RAPA)
• Antinukleära antikroppar
(ANA)
1
RAPA
Referenser
Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt´s essential
immunology (eleventh edition). Kapitel, 6, 7 och 18.
Lea, Tor: Basal og klinisk immunologi, kapitel 17.
Centralsjukhuset i Karlstad.
Fujirebio Inc. Produktblad, Seroida®-RA.
Inledning
Reumatoid artrit (RA) är en kronisk inflammationssjukdom i
leder och bindväv. Symptomen är stelhet och smärta, till en
början i fingrarna, och sedan i alla kroppens leder.
Ledkapslarna förtjockas, lederna deformeras och ledhinnorna
inflammeras. Sjukdomen drabbar människor i alla åldrar, och
förekommer 3 gånger så ofta hos kvinnor som hos män.
Undersökningar av ledvävnad och ledvätska hos patienterna
visar tydliga tecken på immunologisk aktivitet.
Ett viktigt laboratoriefynd vid RA är förekomst av
Reumatoid faktor (RF). RF är en autoantikropp som binder
till Fc- delen av IgG- molekyler. Bindningen till
immunkomplex eller aggregat (denaturerat Ig) är bättre än
den till nativt monomert IgG. RF kan vara av IgM-, IgGeller IgA- typ. RF förekommer hos över 80 % av alla
patienter med RA och kan påvisas med laboratorietestet
RAPA.
Förkortningen RAPA står för SEROID-RA, en
PArtikelagglutionationstest for Rheumatoid faktor (RF).
RAPA- testet är en indirekt agglutinationstest. Gelatinpartiklar har klätts med denaturerat kanin- IgG. När
serumprov från patienter med Rheumatoid faktor (RF) blandas
med partiklarna sker en agglutination.
2
Material
10 stk patientprover (serum). Inaktiverade vid 56ºC, 35 -60
minuter.
I kit från kommersiell tillverkare finns:
- PBS = reagens B = spädningsreagens.
- Positiv kontroll.
- Negativ kontroll.
- Sensiterade partiklar (blå lösning, märkt C) OBS:
Färdigt spädd i lösning A.
- Osensiterade partiklar (blå lösning, märkt D) OBS:
Färdigt spädd i lösning A.
Övrigt som behövs för utförande:
- 1 U-bottnad platta/ grupp.
- Aluminiumfolie till övertäckning av plattan.
Utförande
Märk en U-formad 96-hålsplatta:
+K
1
-K
2
P1
3
P2
4
P3
5
P4
6
P5
7
P6
8
P7
9
P8
10
P9
11
P10
12
A
B
C
D
E
F
G
H
1. Tillsätt 100 µl PBS i brunn A2- A12. Var noga med att
det inte bildas luftbubblor.
2. Tillsätt 25 µl PBS till brunn C1-H1, B2-H2, B3-H3, B4H4 osv. till och med brunnarna B12- H12. Undvik
bubblor!
3. Kontrollera att alla brunnar förutom A1 och B1 nu har
PBS i sig, antingen 100 µl (brunnar i A- raden), eller
25 µl (övriga brunnar). Lägg plattan mot en vit
bakgrund, t.ex. Ett A4- papper så syns det tydligare.
3
4. Blanda kontrollerna och proverna genom att vända upp
och ner några gånger.
5. Tillsätt 25 µl positiv kontroll i brunn B1 och C1. Var
noga med att det inte bildas luftbubblor. I stället
för att pipettera upp och ner för att blanda: skaka
försiktigt plattan (knacka lite försiktigt med handen
på plattans sida, försiktigt så att inget åker ur
brunnarna!)
6. Titrera med 25 µl. Detta innebär att du från brunn C1
suger upp 25 µl av blandningen positiv kontroll och
PBS och pytsar i brunn D1. Blanda genom att suga upp
och pytsa ut 3-4 gånger. (Försök att undvika bubblor!)
Sug upp 25 µl från brunn D1 och pytsa över i brunn E1.
Blanda och fortsätt på samma sätt tills du kommer till
brunn H1. du avslutar genom att suga upp 25 µl ur
brunn H1 och kasta bort. Positiv kontroll är spätt
1/10 i kitet. Räkna ut serumspädningen i brunn B1-H1.
7. Tillsätt 25 µl negativ kontroll till brunn A2. Skaka
försiktigt plattan som ovan. Titrera med 25 µl från A2
till brunn B2 till brunn C2 osv. till och med brunn
H2. (Som för positiv kontroll). Räkna ut
serumspädningen i brunn A2-H2.
8. Tillsätt 25 µl patientprov 1 till brunn A3. Skaka
försiktigt plattan som ovan. Titrera med 25 µl från A2
till brunn B2 till brunn C2 osv. till och med brunn H2
som ovan. Räkna ut serumspädningen i brunn A3-H3.
9. Upprepa för samtliga patientprov. (Patientprov 2 i
brunn A4, titrera med 25 µl till och med brunn H4,
tillsätt patientprov 3 i brunn A5, titrera till och
med brunn H5 osv..) Räkna ut serumspädningen i
brunnarna.
10.
Blanda och tillsätt 25 µl osensiterade
gelatinpartiklar till brunnarna i B- raden.
11.
Blanda och tillsätt 25 µl sensiterade
gelatinpartiklar till brunnarna i raderna C-H.
12.
Skaka försiktigt plattan (som ovan). Inkubera i
rumstemperatur 3 timmar (Alternativt över natt om
klockan är mycket). Räkna ut slutspädningen i alla
brunnarna.
4
Avläsning och redovisning
Reaktion Utseende
Kompakt ”knapp” i botten på brunnen.
+/-
Liten ring i botten på brunnen.
+
Stor ring/ matta av agglutinerade partiklar i
stora delar av brunnen.
++
Matta av agglutinerade partiklar täcker hela
brunnen.
•
Läs av och se om det har inträffat en agglutination.
•
Vad har hänt i brunnarna? Försök att beskriva både en
positiv och en negativ reaktion.
•
Bestäm titrarna för positiv kontroll och patientproven
samt ange om det är en specifik reaktion.
•
För att ett patientprov skall svaras ut skall det ha
skett en positiv reaktion i minst spädning 1/40. Har
du något prov som uppfyller dessa kriterier? Dessa
prov svaras ut till kliniken som positiva i spädning
1/?.
OBS: I denna analysmetod räknas inte serumspädningen utan
slutspädningen. (Det bör poängteras att det är väldigt
ovanligt att man anger slutspädning och inte serumspädning,
men enligt tillverkarna av kitet till testen skall man ange
svaret i slutspädning.
5
ANA
Referenser
Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt´s essential
immunology (eleventh edition). Kapitel, 6, 7 och 18.
Lea, Tor: Basal og klinisk immunologi, kapitel 17.
Centralsjukhuset i Karlstad.
Immunoconcepts Inc. Produktblad, ANA.
Inledning
Systemisk lupus erythematosus (SLE) är en systemisk
autoimmunsjukdom. Symptomen är hög feber, trötthet,
hudförändringar, polyartrit, exsudat i lung- hjärtsäck och
glomerulonefrit. Man finner även relativt symptomfattiga
sjukdomsbilder med enbart ledvärk. Symptom med alla
svårighetsgrader mellan dessa ytterligheter kan vara
förenliga med SLE- diagnosen. Sjukdomen drabbar fler
kvinnor än män (ca 10:1).
Hos över 95 % av patienterna med SLE kan man påvisa
cirkulerande antikroppar riktade mot olika komponenter i
cellkärnor (anti- nukleära antikroppar, förkortas ANA).
Antikroppar mot andra vävnadsantigener, t.ex.
membranantigen på erytrocyter, granulocyter och trombocyter
förekommer också.
Kärnantikroppar (ANA) saknar organ- och arts -specificitet.
Kärnantikroppar kan även påvisas vid andra
bindvävssjukdomar, t.ex. Sjögrens syndrom, samt även en del
fall av Rheumatoid artrit. Det är därför nödvändigt att vid
en positiv ANA göra ytterligare studier för att undersöka
antikropparnas specificitet.
6
ANA är en indirekt immunfluorescens metod (IFL). På ett
objektglas finns celler (HEp-2, cellinje från humant
bronkepitel) alternativt vävnadssnitt (råttlever). Då ett
patientprov får reagera med dessa kommer eventuella
antikroppar mot cellerna att fästa. Det är kärnantikroppar
av olika specificitet som kommer att reagera. De
antikroppar som finns i serum, men som inte bundit till
preparatet tvättas bort. Kärnantikropparna synliggör man
sedan genom att tillsätta fluorescin- märkta antihumana
antikroppar. Finns det i preparatet antikroppar bundna
kommer dessa att märkas av den andra antikroppen. De
antihumana antikroppar som inte binder tvättas bort och
preparatet kontrastfärgas svagt för att synliggöra hela
cellerna. (behövs framför allt vid negativa prov). Fördelen
med den här typen av test är att man förutom att få svar på
om provet är positivt även morfologiskt kan se i
mikroskopet var antikropparna binder.
Flera olika typer av kärnfluorescensmönster förekommer:
1. Homogent. Vid SLE.
2. Kornigt. Vid SLE, MCTD (mixed connective tissue
disease) och andra inflammatoriska bindvävssjukdomar.
3. Nukleolärt. Vid systemisk skleros/ sklerodermi.
4. Centromer. Framför allt vid CREST (variant av
sklerodermi).
5. PCNA (Prolifererande cellers kärnantigen). Vid SLE.
Material
10 stk patientprover (serum). Inaktiverade 56ºC, 35- 60
minuter.
I kit från kommersiell tillverkare finns:
- Glas med HEp-2 celler. Singelförpackade i folie.
- Små flaskor med positiv kontroll (grön lösning) och
negativ kontroll (genomskinlig lösning).
- Konjugat (stor flaska).
- Evans blue counterstain. (Liten flaska med blå
lösning).
- Monteringsmedium (genomskinligt).
7
Övrigt som behövs för utförande:
- Små plaströr till spädning av prover, 10 stk/ grupp.
- PBS = Phosphate Buffered Saline, 0,01M pH = 7,2. Till
spädning av prover. Finns färdigt i kolvar på
labbänken.
- Fuktig kammare = matlåda med fuktat filterpapper.
- Kyvett med PBS + en droppe Tween- 20.
- Bägare med destillerat vatten.
Utförande
OBS: Ta inte ut glasen med HEp-2 celler ur förpackningen
innan ni är klara med förberedelserna!
1. Blanda proverna genom att vända på rören några gånger.
Späd proverna 1/40 med PBS.
2. Ta fram ett objektsglas med HEp-2 celler. Märk med
gruppnamn (med blyerts).
3. Tillsätt en droppe (= ca 25 µl) positiv kontroll till
det lilla fältet märkt +.
4. Tillsätt en droppe( = ca 25 µl) negativ kontroll till
det lilla fältet märkt -.
5. Tillsätt 20 µl patientprov 1-10 till respektive märkt
brunn.
6. Inkubera 30 minuter i fuktig kammare. Rumstemperatur.
7. Skölj med PBS. Använd en sprutflaska. OBS: skölj inte
direkt på brunnarna, då lossnar cellerna!
8. Tvätta glaset genom att låta det stå i en kyvett med
PBS och en droppe Tween- 20 i 10 minuter. Doppa sedan
glaset i en bägare med destillerat vatten 3-5 gånger.
8
9. Använd en tunn pappersservett och torka glaset
försiktigt och noggrant runt brunnarna. OBS: Torka
inte bort cellerna! Låt inte glaset stå torrt mer än
15 sekunder utan gå snabbt till nästa steg!
10.
Tillsätt en droppe konjugat (konjugat är
antihuman antikropp märkt med fluorescinisothiocyanat, FITC) till varje brunn. Konjugatet är
färdigspätt i kitet. Var noga med att se till att
droppflaskan inte får kontakt med preparatet.
konjugatet kan då bli förorenat.
11.
Inkubera 30 minuter i fuktig kammare.
Rumstemperatur. Låt stå mörkt.
12.
Skölj som i punkt 7.
13.
Tvätta glaset genom att låta det stå i en kyvett
med PBS och en droppe Tween- 20 i 10 minuter.
14.
Tillsätt 5 droppar Evans blue till 100 ml PBS i
en kyvett. Ställ i glaset och låt stå i 5 minuter.
15.
Tvätta genom att doppa glaset i en bägare med
destillerat vatten 3-5 gånger.
16.
Torka baksidan av preparatet med en tunn
pappersservett. Torka försiktigt på ovansidan glaset,
men torka inte på cellerna, och var snabb så att
preparatet inte torkar innan nästa steg.
17.
Tillsätt 1-2 droppar monteringsvätska på glaset
och lägg på ett täckglas. Packa försiktigt glaset in i
aluminiumfolie. (Skyddar mot ljusexponering).
18.
Provet är nu klart för avläsning i
fluorescensmikroskop.
Om proven inte skall läsas av direkt, (det går lika bra
senare samma dag, eller nästa dag) behåll folien på och
lägg i kylskåp.
9
Innan användning av fluorescensmikroskopet
•
Tänk på att preparatet är ljuskänsligt! Håll glaset
mörkt (t.ex. i folie) när ni går till mikroskopet och
när ljuset är på i mörkerrummet.
•
Bekanta er med mikroskopet innan ljuset släcks. Det
finns en röd mörkerrumslampa ni kan tända under
mikroskoperingen, men kom ihåg att släcka denna när ni
lämnar rummet.
•
Under mikroskoperingen skall den vanliga lampan på
mikroskopet INTE vara tänd, endast argonlasern skall
lysa.
•
Lasern skall vara PÅ under hela dagen, ni skall alltså
INTE stänga av lasern mellan grupperna. (Det sliter på
den.) Sista gruppen för dagen stänger av lasern.
•
Ni skall använda objektivet 40x oljelins. Ta EN droppe
olja på första fältet, drag sedan med droppen till de
andra fälten. OBS: Om ni tar mer olja kommer det bli
kladdigt och svårt att se cellerna.
•
Tänk på att fluorescensen kommer att avta med tiden.
Använd ljusbländaren.
10
Positiv.
Homogen.
cytoplasma
cellkärna
Positiv. Kornig.
Positiv.
Nukleolär.
Positiv. Centromer.
Negativ
11
