Immunologi
Laboration; Epstein Barr Virus
(EBV) – serologi.
• Oxblodshemolysat test (OCH)
• Epstein Barr Virus ELISA
(EBNA)
1
OCH
Referenser.
Jawas et al: Medical Microbiology.
Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt´s essential
immunology (eleventh edition). Kapitel, 6 och 7.
Serologen, Centralsjukhuset Karlstad
Inledning.
Mononucleosis infectiosa (MI) är en infektionssjukdom som
orsakas av Epstein Barr- virus (EBV). Symptomen är
långvarig feber och lymfkörtelsvullnader. Sjukdomen drabbar
framför allt unga människor och kallas i USA för ”kissing
disease”. EBV ses även i cancerceller hos patienter med
Burkitt’s lymfom. Hos patienter med MI kan man i
blodutstryk påvisa variantformer av lymfocyter, (kallas
även retningspåverkade lymfocyter, McKinley- celler eller
aktiverade lymfocyter), heterofila antikroppar och
specifika EBV antikroppar.
EBV infekterar B- lymfocyter. In vitro metoder visar att
dessa infekterade B- lymfocyter transformeras och kommer
tidigt att producera s.k. heterofila antikroppar som är av
IgM typ. Mer än 95 % av alla patienter med primär EBVinfektion har heterofila IgM- antikroppar. Heterofila
antikroppar är dock inte specifika, så de kan skyllas en
rad olika tillstånd som CMV- infektion, hepatit, primär
Herpes- simplex- tonsillit, maligna blodsjukdomar, tidigare
nämnda Burkitt´s lymfom mm. Heterofila antikroppar
tillsammans med ovanstående symptom och blodbild diagnosen
MI.
De heterofila antikropparna har bl. a. förmågan att
agglutinera fårblodkroppar (Paul Bunnels reaktion) samt
binda till nöterytrocyter (OCH). Varför dessa heterofila
antikroppar har denna specificitet är idag inte förklarat.
En vanlig metod för att identifiera heterofila antikroppar
är OCH- metoden. Det finns även olika snabbtest av
varierande kvalité kommersiellt tillgängliga.
2
Material.
Veronalbuffert (VB). Späds 1/5 i destillerat vatten.
Marsvinskomplement 15 % i VB (färdigt på is). OBS:
komplementet har en kontinuerlig omsättning och är därför
på samma sätt som enzymer känsliga för ”optimala
temperaturer”. Det betyder att vid 4ºC är de hyfsat satta
ur funktion. Se till att hålla dem där, annars kommer de
som använder komplementet sist att få enbart negativa prov!
Nöterytrocyter 1% i VB (färdigt på is). OBS: håll kallt.
10 patientprover (Serum) Inaktiverade vid 56ºC 35 – 60
minuter.
U- bottnade mikrotiterplattor.
Utförande.
1. Ta fram och märk en U- bottnad mikrotiterplatta.
-K
1
+K
2
P1
3
P2
4
P3
5
P4
6
P5
7
P6
8
P7
9
P8
10
P9
11
P10
12
A
B
C
D
E
F
G
H
2. Tillsätt 90 µl spätt VB till alla brunnarna i rad A och
50 µl spätt VB till alla brunnarna i rad B-H. Undvik
bubblor!
3
3. Blanda kontrollerna och proverna ordentligt genom att
vända på rören några gånger. Tillsätt 10 µl positiv
kontroll i brunn A1 och 10 µl negativ kontroll i brunn
A2. Tillsätt 10 µl patientprov 1 i brunn A3, 10 µl
patientprov 2 i brunn A4 osv. till och med patientprov 10
i brunn A12.
1. Skaka plattan försiktigt (knacka med handen på sidan av
plattan, var försiktig så att inget åker ur brunnen!)
2. Titrera med 50 µl. Detta innebär att du från brunn A1
suger upp 50 µl av blandningen positiv kontroll och VB
och pytsar i brunn B1. Blanda genom att suga upp och
pytsa ut 3-4 gånger. Sug upp 50 µl från brunn B1 och
pytsa i brunn C1 och blanda. Fortsätt tills du kommer
till brunn H1. Du avslutar genom att suga upp 50 µl från
brunn H1 och kasta bort. Fortsätt sedan på motsvarande
sätt med den negativa kontrollen och de 10
patientproverna. Räkna ut spädningen i brunnarna.
(Serumspädning 1/?).
3. Tillsätt 25 µl komplement till alla brunnarna. OBS: håll
komplementet på is!
4. Tillsätt 50 µl nöterytrocyter till alla brunnarna. OBS:
håll på is!
5. Skaka plattan försiktigt (som ovan). Inkubera 1 timme i
37ºC. (Värmeskåp).
Avläsning och redovisning.
•
Läs av och se om det har inträffat en agglutination.
•
Vad har hänt i brunnarna? Försök att beskriva både en
positiv och en negativ reaktion.
•
Bestäm titrarna för positiv kontroll och patientproven
samt ange om det är en specifik reaktion.
I denna analysmetod räknas serumspädningen.
4
Epstein Barr Nuclear
Antigen (EBNA)
Referenser.
Jawetz et al: Medical Microbiology
Delves, Martin, Burton and Roitt: Roitt´s essential
immunology (eleventh edition). Kapitel, 6 och 7.
Biotest- Anti-EBV IgG ELISA manual.
Inledning.
Antikroppsmönstret mot olika EBV- antigen varierar beroende
på vilken fas av EBV- infektion patienten är i. Efter en
primärinfektion med Epstein Barr virus (EBV) bildas olika
EBV- antikroppar. En av dessa är IgG mot EBNA
(kärnantigen). Antikropparna kommer efter 1-6 månader och
kvarstår livet ut. Om en patient har IgG mot EBNA kan man
därmed utesluta primär EBV- infektion.
Utförande.
Läs bifogad EBNA- manual från Biotest och följ
instruktionerna.
Under testutförande, spädning av prov 1:21, välj
förspädning i rör.
Ni har 10 serumprover. Blank, positiv och negativ kontroll
skall köras som dubbelprov, patientproverna som enkelprov.
Ni skall därför ta loss två rader med brunnar från racket i
kitet. Ert pipetterings- schema kommer att se ut som
följande:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Blank
Blank
+K
+K
-K
-K
P1
P2
2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
5
Avläsning och redovisning.
•
Läs av och se om det har inträffat en reaktion.
•
Vad har hänt i brunnarna? Försök att beskriva både en
positiv och en negativ reaktion.
Tolkningschema för resultat från OCH och EBNA.
EBNA -
EBNA +
OCH –
Ingen ev. mycket
tidig EBVinfektion.
Ingen primär EBVinfektion, men har
haft det tidigare.
OCH +
Primär EBV- infektion
eller annan
virusinfektion.
Svagt +: sen
primärinfektion.
Starkt +: kronisk EBVinfektion. HIV?
Leukemi? Lymfom?
6
