ChromoQuant - CyberGene AB

Bruksanvisning – revision 7 (Februari 2009)
ChromoQuant®
In vitro diagnostiskt test kit för analys av vanligen förekommande aneuploidier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt i X
och Y.
Se förpackning
Se förpackning
-18°°C
48
-25°°C
311.002.2-48u, 412.001-48u samt extramarkörer 313.002-24, 318.002-24, 321.002-24, 330.001-24
Användningsområde för produkten
®
Den avsedda användningen av produkten ChromoQuant är för bestämning av de vanligaste förekommande
kromosomala avvikelserna, s k trisomier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt för aneuploidier i könskromosomerna.
®
Produkterna kompletterar traditonell karyotypning. ChromoQuant 311 och 412 kan även användas som fristående
produkt. Extramarkörerna kan inte användas som fristående produkter utan utgör komplement till 311.002.2 och
412.001.
Principer bakom metoden QF-PCR
®
ChromoQuant är baserat på QF-PCR tekniken (Quantitative Fluorescent PCR). För att avgöra om en trisomi föreligger,
användes amplifiering av STR (Short Tandem Repeats). I detta fall är alla markörer tetra-nukleotid repeats utom markör
®
X22 som är ett penta-nukleotid repeat (X/Y). STR har en specifik placering på en given kromosom. I ChromoQuant QFPCR amplifieras flera STR parallellt, s k multiplex PCR. Fluorescensmärkta PCR primers genererar fluorescens för
detektion av de unika PCR fragmenten. Tre olika färger har använts för inmärkning. Varje STR på en given kromosom
har en unik längd som är avhängig hur många repeterande enheter den innehåller. På så sätt skiljer man en homolog
kromosom från en annan.
I det ideala normalfallet, di-allelisk individ, skulle två separata toppar genereras vid gel-separation av en STR. En ideal
tri-allelisk individ skulle generera tre separata toppar. Emellertid förekommer även situationer där homozygoti inträffar
med en (icke informativ) topp, alternativt två toppar med ett ett:två förhållande vid trisomi. I fall av trisomi inträffar detta
särskilt om celldelningen har varit icke disjunct vid den andra meiotiska delningen.
Egenskaper och begränsningar i metoden
Varje kromosom analyseras med fyra-sex separata STR locus i huvudkiten (311.002.2-48u, 412.001-48u).
Minst 2 av dessa markörer måste vara informativa för att resultatet skall kunna användas för tolkning. Kit med
extramarkörer finns tillgängliga (313.002-24, 318.002-24, 321.002-24 samt 330.001-24)
ChromoQuant® kan inte användas för att avgöra om translokationer eller mosaicism förekommer.
ChromoQuant® ger endast indikation på Turner syndrom. Vid misstanke måste andra metoder användas för definitivt
besked.
För vidare information om ChromoQuant® refererar vi till ChromoQuant User´s Guide som kan hämtas via
www.cybergene.se/chromoquantQFPCR.htm
®
ChromoQuant är ett registrerat varumärke som tillhör CyberGene AB, Sweden
Q07-103-S07 Bruksanvisning ChromoQuant.doc
CyberGene product no. 901.117-0, Rev. 07 valid 200902
CyberGene AB
Box 30057
104 25 Stockholm Sweden
www.cybergene.se
1(7)
Viktig information angående användning av ChromoQuant®
®
•
ChromoQuant QF-PCR kit är avsett att användas för analys med filter-set D i utrusting från Applied
Biosystems (ABI Prism3100, 310 and 3130 Genetic Analyzers), och med filter-set 2 i utrustning från
Amersham Biosciences (MegaBACE 500/1000).
•
Försäkra dig om att din sekvensutrustning har filter-set för tolkning av färgerna 6-FAM, HEX och NED.
•
ChromoQuant rekommenderas för analys av DNA extraherat från fostervatten men fungerar även för
saliv, munskrap, blod etc.
•
Funktionen av ChromoQuant kan inte garanteras för andra Taq polymerase än de som
®
rekommenderas i denna instruktion. Taq polymeras är INTE inkluderat i ChromoQuant .
•
För bästa analysresultat skall mängden DNA som används vara > 15 ng - < 150 ng per PCR
reaktion. Mängden DNA som används kan behöva korrigeras beroende på vald reningsmetod och
dess effektivitet.
•
Fostervattensprover innehållande spår av blod skall inte analyseras med detta kit.
•
Salter kan komma att störa fragmentseparationen under gel-elektrofores. Vid behov skall provet därför
avsaltas före eletroinjektion (gäller särskilt kunder som använder MegaBACE utrustning).
•
För att undvika korskontamination under arbetet innan PCR – skall pipettspets bytas innan varje
pipetteringssteg.
•
Om formamid används vid elektroinjektionen – skall högsta kvalitet användas, då denna påverkar
känsligheten i tolkningen (gäller särskilt användare med ABI instrument).
®
®
1
•
Reagens för rening av genomiskt DNA ingår ej i detta kit.
•
Användare måste inneha licens för användande av PCR tekniken från Hoffman La-Roche.
Innehåll
•
•
•
•
Tolv (12) 8-rörs strips (311), Sex (6) 8-rör strips (412)
•
1X QF-PCR buffert – 1,7 mL (gult lock) (extramarkörkits 0,45 ml)
(MgCl2, (NH4)2SO4, dNTPs, β-mercaptoetanol, Bovint Serum Albumin)
Tre (3) 8-rörs strips (extramarkörkits; 313, 318, 321 och 330)
Lock för PCR strips.
1X Enzyme Dilution Buffer – 300 µL (vitt lock)
(Tris-buffert, EDTA)
Sammansättning
Varje PCR rör innehåller en torkad mix, klar att använda. Vilka kromosomer som analyseras samt färgerna på rören
för respektive analys framgår av tabellen nedan.
Prod. Nr.
Färg på PCR rör
311.002.2-48u
-” 313.002-24
318.002-24
321.002-24
330.001-24
412.001-48u
Orange
Blå
Röd
Lila
Gul
Grön
Blå
Markörer för
kromosom
kromosom 13, 18, X/Y
kromosom 21, X/Y
kromosom 13
kromosom 18
kromosom 21
kromsom X/Y
Kromosom 13, 18, 21
En 8-rörs strip räcker till att analysera åtta (8) patientprover i aktuell(a) kromosom(er). För att analysera
könskromosomerna med kit 311 måste man använda två rör; ett blått och ett orange. Det är inte tillräckligt att bara
använda ett rör.
Kit 412 innehåller inga markörer för könskromosomer.
1
The PCR process is covered by USA patents 4,683,195 and 4,683,202 and foreign equivalents owned by Hoffman-La
Roche AG
2(7)
Q07-103-S07 Bruksanvisning ChromoQuant.doc
CyberGene product no. 901.117-0, Rev. 07 valid 200902
Lagringsinstruktioner och hållbarhet efter öppnande
Lagring
•
Oanvända PCR rör, innehållande torkade lösningar samt QF-PCR buffert lagras mörkt i < -18°C.
•
Enzyme dilution buffer kan lagras vid -20°C - +8°C
•
Använd aluminium folie för att skydda rören från ljus vid arbete på labbänk innan PCR.
•
Vi rekommenderar att oanvänt material förvaras i sin originalförpackning.
Hållbarhhet
•
Se “Expiry date” på förpackningen.
Reagens tillhandahållna av användaren
•
Taq polymerase;
-1
HotStar Taq polymerase, Qiagen #203203, 250U [5 U µL ] alternativt GoTaq, Promega Inc.; # M
-1
M8301/M3171, 100U [5U µL ]
Gel-elektrofores fluorescent storleks standard, t ex ABI GeneScan-500 [ROX] produkt # 401734 eller
Amersham Biosciences ET-ROX 550 produkt #25-6550-01. Storleksstandad sätts till provet efter PCR men före
gel-elektrofores.
Kolonner för avsaltning av PCR produkt innan gel-elektrofores (vid behov)
•
Reagens för rening av genomiskt DNA.
•
•
Metodbeskrivning
Rening och preparering av DNA före PCR
Reagenser för rening av DNA från humant material är INTE inkluderat i ChromoQuant. Vi rekommenderar
användning av kommersiellt tillgängligt kit som ger hög renhet av genomiskt DNA.
-1
•
Rent DNA skall spädas med destillerat och autoklaverat vatten till en slutkoncentration av 1,5-15 ng µL
Multiplex PCR amplifiering av genomiskt DNA
1. Tina QF-PCR buffert och Enzyme dilution buffert och placera på is.
2. Plocka fram antal PCR rör av respektive färg (se sid 2) som skall användas vid analys (n).
3. Blanda i ett separat polypropylene rör (t ex 1,5 mL Eppendorf -rör) en master mix bestående av;
- 1,6 µL Enzyme dilution buffer
- 0,4 µL Taq Polymerase
multiplicerat med n
- 13 µl QF-PCR buffert
Blanda alltid några extra för att lösningen skall räcka till samtliga rör.
®
PCR rören i ChromoQuant är arrangerade i strips om 8. Ett rör av vardera färg skall användas för
komplett analys av en patient.
För bästa resultat – utför arbetet på is om du arbetar med GoTaq polymerase.
Observera att det torkade innehållet i röret kan vara statiskt. Öppna locket försiktigt!
4. Sätt 15 µL master-mix från steg 4 till varje PCR rör. Kontrollera att pelleten löses i master-mixen. Pelleten kan
ibland sitta högt upp i röret.
-1
5. Tillsätt 10 µl DNA till varje rör (1,5-15 ng µL ). Mixa genom att pumpa med pipetten 5X. Slutvolym 25 µl.
6. Kontrollera att all vätska har samlats i botten av röret. Centrifugera ned lösningen vid behov.
7. Utför genast PCR reaktionen enligt följande protokoll:
PCR protokoll:
PCR protocol: Välj steg 1 beroende på vilket enzym
som används. Steg 2-4 repeteras 26 cykler.
Gel-elektrofores av amplifierat DNA:
1.
2.
Utför gel-elektrofores enligt instrumentmanual eller “bestpractice”. Förväntad fragmentlängd är 93 – 500 nukleotider.
Avsalta vid behov PCR proverna individuellt innan elektrokinetisk injektion på kapillär.
Q07-103-S07 Bruksanvisning ChromoQuant.doc
CyberGene product no. 901.117-0, Rev. 07 valid 200902
Steg
1.GoTaq
1. HotStar
Taq
2
3
4
5
6
7
Antal cykler
1
1
Temp.
94oC
95 oC
Tid
3 min
15 min
Repeat 26
"
"
1
1
HOLD
94oC
57oC
71oC
71oC
60oC
4 oC
30 sek
1 min
2 min
5 min
60 min
∞
3(7)
Marköridentiteter i respektive kit
311.002.2-48u
Kromosom 13/18- orange PCR rör
Markörnamn
Location
Kromosom
STR
Storlek bp
Färg
Inmärkning
AMEL
Xp22.31-Xp22.1
X/Y (AMEL)
-
x: 103-108
Grön
HEX
Yp11.2
y: 109-114
Ny!
D13S256
13q14.1-13q22
13
Tetra
125-175
Blå
6-FAM
D18S391
18p11.31
18
Tetra
135-185
Grön
HEX
D18S976
18p11.31
18
Tetra
171-201
Gul
NED
Ny färg!
D18S819
18q11.2
18
Tetra
230-275
Gul
NED
Ny!
XHPRT
Xq26.1
X
Tetra
260-304
Blå
6-FAM
D13S742
13q12.13
13
Tetra
230-326
Grön
HEX
DXSY218
Xp22.32/Yp11.3
X/Y
Tetra
310-350
Blå
6-FAM
Ny!
D18S390
18q22.3-18q23
18
Tetra
315-360
Gul
NED
Ny!
D18S386
18q22.1
18
Tetra
330-405
Grön
HEX
D13S634
13q21.33
13
Tetra
380-445
Blå
6-FAM
D13S628
13q31.1
13
Tetra
420-475
Gul
NED
D13S305
13q13.3
13
Tetra
425-470
Grön
HEX
D18S535
18q12.3
18
Tetra
450-505
Blå
6-FAM
Markör A: En topp vid (103-108) bp indikerar XX. En topp i vardera intervallet (103-108)resp. (109-114) bp indikerar
XY. Markör A är inte polymorf.
Kromosom 21 – blå PCR rör
Markörnamn
Location
Kromosom
STR
Storlek bp
Färg
Inmärkning
DXS6854
Xq26
X
Tetra
93-119
Blå
6-FAM
DXS6803
Xq21.31
X
Tetra
101-139
Grön
HEX
D21S1409
21q21.2
21
Tetra
193-219
Gul
NED
SRY
Yp11.3
Y
-
202-207
Blå
6-FAM
X22
(PAR 2) Xq/Yq
X/Y
Penta
190-250
Grön
HEX
D21S11
21q21
21
Tetra
220-285
Gul
NED
D21S1246
21q22.2-21qter
21
Tetra
282-336
Grön
HEX
D21S1411
21q22.3
21
Tetra
292-340
Gul
NED
D21S1444
21q21-21q22
21
Tetra
304-345
Blå
6-FAM
D21S1435
21q21.3
21
Tetra
350-410
Grön
HEX
Markör SRY representeras som en topp i intervallet (205-207) bp endast om provet är XY. Markör R är inte polymorf
och skall endast generera en topp. Markören SRY saknas helt i XX-prover.
Q07-103-S07 Bruksanvisning ChromoQuant.doc
CyberGene product no. 901.117-0, Rev. 07 valid 200902
4(7)
313.002-24
Kromosom 13- röda PCR rör
Markörnamn
Location
Kromosom
Storlek bp
Färg
Inmärkning
D13S762
D13S252
13q31.3
13q12.2
13
13
270-326
330-390
Grön
Blå
HEX
6-FAM
318.002-24
Kromosom 18 – lila PCR rör
Markörnamn
Location
Kromosom
Storlek bp
Färg
Inmärkning
D18S878
D18S1002
18q22.1
18p11.1
18
18
158-192
280-370
Grön
Blå
HEX
6-FAM
321.002-24
Kromosom 21- gula PCR rör
Markörnamn
Location
Kromosom
Storlek bp
Färg
Inmärkning
D21S1409
D21S1411
D21S1280
21q21.2
21q22.3
21q22.11
21
21
21
193-219
292-340
316-386
Grön
Blå
Grön
HEX
6-FAM
HEX
Kromosom X och Y – gröna PCR rör
Markörnamn Location
Kromosom
Storlek bp
Färg
Inmärkning
DXS6803
DXS8377
DXS6809
G10_STS47
101-139
198-280
230-285
338-343
Grön
Grön
Blå
Grön
HEX
HEX
6-FAM
HEX
330.001-24
Xq21.31
Xq28
Xq21.33
Yq11.222
X
X
X
Y
Q07-103-S07 Bruksanvisning ChromoQuant.doc
CyberGene product no. 901.117-0, Rev. 07 valid 200902
5(7)
412.001-48u
Kromosom 13, 18 och 21- blå PCR rör
Markörnamn
Location
Kromosom
Storlek bp
Färg
Inmärkning
D13S742
13q12.13
13
230-326
Grön
HEX
D13S634
13q21.33
13
380-445
Blå
6-FAM
D13S628
13q31.1
13
420-475
Gul
NED
D13S305
13q13.3
13
425-470
Grön
HEX
D18S391
18p11.31
18
135-185
Grön
HEX
D18S976
18p11.31
18
171-201
Blå
6-FAM
D18S386
18q22.1
18
330-405
Grön
HEX
D18S535
18q12.3
18
450-505
Blå
6-FAM
D21S11
21q21.1
21
220-285
Gul
NED
D21S1246
21q22.2
21
282-336
Blå
6-FAM
D21S1444
21q22.13
21
226-267
Blå
6-FAM
D21S1435
21q21.3
21
150-210
Gul
NED
Q07-103-S07 Bruksanvisning ChromoQuant.doc
CyberGene product no. 901.117-0, Rev. 07 valid 200902
6(7)
Tolkning av data
Vi rekommenderar användande av Visualizer™ Software (CyberGene AB) för beslutsstöd och tolkning av data.
Varje markör genererar ett specifikt mönster i ett väl definierat område, i en förutbestämd färg.
Normala mönster
De mönster som avbildas nedan är exempel på mönster för normala patienter.
Normal Heterozygot –
informativ 1:1
Homozygot –
icke informativ
Trisomi mönster
Ett patientprov som indikerar en trisomi genererar antingen tre toppar av samma höjd (1:1:1) alternativt två toppar med
ett 1:2 (eller 2:1) förhållande. Endast heterozygota mönster kan användas för tolkning av eventuella trisomier.
Homozygota trisomi patienter kan generera en topp. Denna topp kan ej användas för tolkning, den är icke informativ då
den lika gärna skulle kunna vara en homozygot normal.
Trisomiskt 2:1 (1:2) förhållande genererar normalt inte ett exakt 2:1 (1:2) förhållande. En kvot om 0,8-1,4 tolkas som ett
normalt prov. En kvot överstigande 1,8 eller mindre än 0,65 indikerar en trisomi. Värden utanför dessa gränser betraktas
som ej informativa. Vi rekommenderar att sådana prover analyseras om, vid behov med justering av DNA-koncentration.
Trisomi 2:1
Trisomi 1:1:1
Friskrivning
®
ChromoQuant QF-PCR kit skall endast användas och hanteras av personal med relevant utbildning för
®
molekylärbiologiskt arbete. Resultat som uppnås med ChromoQuant skall endast användas och tolkas
inom den normala kliniska beslutsprocessen. CyberGene AB kan inte hållas ansvarig för kliniska beslut.
Q07-103-S07 Bruksanvisning ChromoQuant.doc
CyberGene product no. 901.117-0, Rev. 07 valid 200902
7(7)