Tarmlaboration – in vitro undersökning av farmaka som påverkar tarmmotiliteten Målet med laborationen är att 1. demonstrera en klassisk farmakologisk försöksuppställning. 2. visa konstruktionen av dos-respons kurvor, samt hur antagonister förskjuter agonistens dos-responskurva. 3. demonstrera olika läkemedelseffekter på tarmmotiliteten (kolinerga och adrenerga agonister och antagonister, morfin, kalciumantagonister). 4. visa en funktionell metod att karaktärisera ett receptoruttryck. Frågor att besvara efter laborationen: Dessa frågor skall besvaras skriftligen i grupper om 3-4 studenter och inlämnas till labbansvarig inom 7 dagar från laborationstillfället. Svaren på dessa frågor kommer till viss del ges under laborationens gång. Det som inte tas upp vid laborationstillfället får ni själva läsa er till i kurslitteraturen. 1. Vad syftar Krebslösningen till? 2. Vad har gasningen med karbogen för betydelse? 3. Vilka är de funktionella klassiska receptorerna i tarmen och urinblåsan? 4. Vad har tarmen för speciell fysiologi vad gäller spontanaktivitet, sträckningseffekt samt funktionellt syncytium? 5. Redogör för verkningsmekanismen för de olika droger som används. 6. Konstruera koncentrations-responskurvor för a. karbakol (-/+ atropin) – du kan göra en kurva av medelvärdena! b. Uppskatta och ange EC50 för karbakol i frånvaro och närvaro av antagonisten atropin. Inledning Tarmen innerveras av parasympatiska och sympatiska nerver, vilka terminerar på körtelceller, på glatta muskelceller och i ganglier i tarmen. Tillsammans bildar tarmens innervation det så kallade enteriska nervsystemet i vilket flera olika transmittorsubstanser medierar excitatoriska och inhibitoriska signaler. Vid sidan av de klassiska autonoma transmittorerna påverkar ett flertal peptider tarmmotoriken. Många läkemedel påverkar de receptorer som medierar dessa signaler eller den glatta muskelcellens intracellulära signalöverföring. Exempel är läkemedel med antikolinerga effekter. Morfin är ett annat läkemedelsexempel med uttalade tarmeffekter. För den aktuella laborationen har tarmpreparat utdissekerats från råttor. Ett isolerat tarmpreparat behåller sin viabilitet om det förvaras i näringslösning på lämpligt sätt. I preparatet som dissekerats ut förekommer inte bara de glatta muskelcellerna utan också mer eller mindre viabla nervfibrer. I laborationen kan farmaka påverka den glatta muskeln dels direkt, dels indirekt via nervfibrerna i preparatet. Utrustning Utrustning: Petriskål, sax, pincett, 1 ml spruta, kanyl Lösningar: Karbakol Atropin Adrenalin Propranolol Morfin Papaverin Filmen visar hur organbadet fylls med Krebs bikarbonatbuffert upp till markeringen på badet, tempereringen sätts till 38° C, samt att lösningen gasas med karbogen (5 % CO2 i syrgas). Ett aortastrip, detrusorstrip och två tarmpreparat friprepareras (ungefär 2-4 mm). En kort tråd fästs i ena änden; denna kan gärna bilda en mycket liten ögla. I andra änden fästs en ca 20 cm lång tråd; öglan hakas på kroken och sänks ned nästan till botten i organbadet. Andra änden fästs till kraftgivaren. Tråden sträcks med ”hissen”. Registreringen startas. Preparatet sträcks ånyo; dvs. till maximalt utslag på skrivaren. Gasningen med karbogengas (5 % CO2 i syrgas) görs försiktigt så att bubblingen inte ger utslag. Preparatet får kalibrera 50-60 min innan försöket startas. Utförande Alla lösningar tillsättes till badet i volymen 0.1 ml. 1. Karbakol tillsättes till de fyra preparaten i stigande koncentration, från 10-8 M till och 10-4 M (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4). När svaret från en koncentration når en platå tillsättes nästa. Detta kallas kumulativ administrering. Efter tillsats av högsta koncentrationen sköljs badet så att karbakol försvinner. Atropin 10-8 M tillsätts. Därefter upprepas försöket. 2. Samma protokoll utförs efter tillsats av atropin 10-7 och atropin 10-6 M. 3. Efter sköljning tillsätts adrenalin (10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M) i stigande koncentration på samma sätt som för karbakol. Protokollet upprepas efter tillsats av propranolol 10-6 M. 4. Sköljning 5. Isoprenalin tillsätts kumulativt (10-8, 10-7, 10-6 och 10-5 M) Protokollet upprepas efter tillsats av propranolol 10-6 M. 6. Sköljning 7. Morfin 1 mg/ml tillsättes till tarmpreparaten. 8. Sköljning 9. Papaverin (30 mg/ml) tillsättes tarmpreparaten. 10. Karbakol (10-4 M) tillsätts tarmpreparat och detrusor.