Flödescytometri Hematologi med mikroskop • • • • • • • Bürkerkammare eller blodutstryk, Diff Cellens storlek Kärnans storlek Cytoplasmans färg Eventuella granula, antal och storlek Räknar ofta 100- 200 celler Begränsat till vad man ser 1 Automatiserad hematologi • • • • • t.ex. FACS eller Sysmex Storlek Eventuella granula Ytstrukturer (märkta med fluorescens) Räknar typiskt 5.000 – 300.000 celler på några få minuter 2 Uppbyggnad, FACScan D DATAANALYS Side scatter Ut i slask Forward scatter Laser D Bärarvätska Celler sugs in Hydrodynamisk fokusering 3 Ljusspridning • Forward scatter (FSC) Ljusspridning • Side scatter (SSC): 4 SSC (Granula) FSC (Cellstorlek) SSC Granulocyter Mycket granula Granulering Side scatter Monocyter Lymfocyter Lite granula Liten cell Celldiameter (storlek) Forward scatter FSC Stor cell 5 Mycket granula Granulocyt Granulering Side scatter Monocyt Lite granula Lymfocyt Liten cell Celldiameter (storlek) Forward scatter Stor cell Flödescytometri 3-partsdiff granulocyter lymfocyter monocyter 6 • Storlek, forward scatter • Granulering, side scatter • Fluorescensinmärkning Uppbyggnad, FACScan DATAANALYS Orange fluorescens Röd fluorescens D D Side scatter Ut i slask D Grön fluorescens D Forward scatter Laser D Bärarvätska Celler sugs in 7 Fluorescensmärkta antikroppar DIREKT INDIREKT Fluorescensmarkörer • Cellyteproteiner – Antikroppar märkta med fluorescens • CD markörer • Intracellulära proteiner – Antikroppar märkta med fluorescens • DNA / RNA – Fluorescerande kemikalier • Intracellulära processer 8 CD-markörer • CD = cluster of differentiation • Antigen som uttrycks på cellens yta Celltyp CD-markör Leukocyt CD 45 Monocyter CD 14 T- lymfocyter CD 3 B- lymfocyter CD 19 T- helper celler CD 4 T- cytotox celler CD 8 9 CD-markörer Fluorescens Antikroppar med fluorokrom 10 Olika fluorokromer • FITC, fluorescein-iso-thio-cyanat (grön) • PE, phyco-erytrin (orange) • PerCp (röd) • Alla dessa kan exciteras vid 488nm • Emmission: FITC: 530 nm, PE: 575 nm, PerCp: 670 nm 11 Mycket fluorescens PE Lite fluorescens Lite fluorescens FITC Mycket fluorescens Vad kan man mäta? 2-6 parametrar på varje cell eller partikel – Ljusspridning • Liten vinkel, FSC (forward scatter) • Stor vinkel, SSC (side scatter) – Fluorescens • • • • Grön (FITC) Orange (PE) Röd (PerCp) (Blå) 12 Optik och elektronik Kvalitetskontroll Förutsättningar • att instrumentet har tillräcklig känslighet • att reagensen är reproducerbara • att provbehandling kan upprepas • att analysen är reproducerbar 13 Begränsningar • Dyr utrustning och dyra reagens • Kräver tränad personal • Väldigt känsligt system • Fluorescensen bleks av lasern- man kan inte köra samma prov flera gånger Provbehandling Provtagningsrör - antikoagulantia, ex: lymfocyter – EDTA, stamceller - ACD lösning förvaringstid varierar - analys inom 30h Karlstad - analys inom 6h, ofta snabbare än så Temperatur: perifert blod 18-22 °C 14 Laboration FACS/Mikroskop • 3 och 3 labbar ihop • 2 blodprov, 1 normal, 1 ”onormal” • 3 metoder: Bürker, Diff, FACS • Jämföra resultaten och metoderna Cellytemarkörer, CD • Allmän leukocytmarkör – CD45 • Monocytmarkör – CD14 • Lymfocytsubpopulationer – CD3 – T-lymfocyter • CD4 • CD8 Delar upp lymfocyter i T och B celler Delar upp T cellerna i hjälparoch cytotox celler – CD19 – B-lymfocyter 15 Dataanalys I, ljusspridning Granulering, Side scatter granulocyter monocyter lymfocyter Celldiameter (storlek) Forward scatter Fortsatt undersökning av lymfocyter SSC/ granulering Ni ”gatar” lymfocyterna granulocyter monocyter lymfocyter FSC/ Celldiameter (storlek) 16 Dataanalys II, fluorescenssignal Mycket Fluorescens (+) -, + +,+ Orange Fluorescens PE Lite Fluorescens (-) -, - Lite fluorescens (-) +, - Grön fluorescens FITC Mycket fluorescens ( + ) Dataanalys II, fluorescenssignal Mycket Fluorescens (+) Orange Fluorescens PE Lite Fluorescens (-) Lite fluorescens (-) Grön fluorescens FITC Mycket fluorescens ( + ) 17 Kontroll Mycket fluorescens Markering som skapar 4-fält < 2% celler i övre, yttre rutan Orange fluorescens PE Lite fluorescens Lite fluorescens Grön fluorescens FITC Mycket fluorescens Identifiera lymfocyter, CD 45 / CD 14 Orange Fluorescens PE Monocyter CD 14 Markering kopieras från kontrollröret Grön fluorescens FITC Lymfocyter CD 45 18 Lymfocyter indelning i B- och T-celler Orange fluorescens PE B-celler CD19 Markering kopieras från kontrollröret Grön fluorescens FITC T-celler CD3 T- lymfocyter indelning i hjälpar- och cytotox-celler Orange fluorescens PE CD4 Markering kopieras från kontrollröret Grön fluorescens FITC CD8 19 Analys • Använder programmet CellQuest (gate- statistics) • Läser ut %-andelen lymfocyter i provet, %-andelen B- och T- lymfocyter, %-andelen T- helper och Tcytotox Bedömning • Jämför metoderna: Bürker, Diff, FACS, Sysmex • Stämmer resultaten överens? • Fördelar, nackdelar med respektiva metoder. Felkällor? • Examination: Labrapport 20