flödescytometri

FLÖDESCYTOMETRI
En lysande teknik
2014-04-08
1
FLÖDESCYTOFLUOROMETRI
FLÖDE: partiklar i en vätskeström
CYTO: cell
FLUORO: fluorescens
METRI: mätning
(FACS - Fluorescens Activated Cell Sorting)
2014-04-08
2
Bakterier
Blodceller
Vävnadsceller
Protozoer
Stamceller
Micropartiklar/
cytokiner
2014-04-08
3
Storlekar
bakterie phytoplankton
0,5 μm 2 μm
erytrocyt
6μm
lymfocyt
8μm
neutrofil
12 μm
monocyt
14 μm
2014-04-08
4
Nukleära antigen
Cytoplasmatiska antigen
Membranceptorer
2014-04-08
5
Material
BLOD
BENMÄRG
LYMFKÖRTLAR
LIKVOR, ASCITES, PLEURA
VÄVNADER
KRAV
SINGELCELLER
BEVARAD MORFOLOGI
BEVARADE ANTIGENSTRUKTURER
2014-04-08
6
Applikationer
Leukemifenotypningar (leukocyter)
Blodproduktskontroller (Leukocyter, trombocyter, erytocyter)
Stamceller (CD34)
Immunbrister (lymfocyter)
HIV (CD4/CD8)
Cytokiner
DNA (tumörceller)
Kvantifiering av D-antikroppar (lösliga antikroppar + erytrocyter)
Funktionstester, differentiering ……………………
2014-04-08
7
Preparation ytstrukturer
•
•
•
•
•
50 µl EDTA blod
5- 20 µl antikroppar
Inkubation; 15 min, 20º, mörkt
Lysering 450 µl
Inkubation; 15 min, 20º, mörkt
• Insamling
• Analys
• FLÖDE
• OPTIK
• ELEKTRONIK
2014-04-08
9
Flöde
Sheath Flow –
bärarvätska
Flowcell – celler
passerar genom
laser
Slask
Inmärkt prov
2014-04-08
10
Optik
Excitation
Emission
Prismor
Fokuseringslins
Fiber optik kablar
Röd laser
Flödes cell
Blå laser
Violett laser
2014-04-08
11
INSAMLINGSOPTIK, FILTER
2014-04-08
12
Vad får vi för information om cellen?
Storlek – Forward Scatter (FSC)
Komplexitet / granulering– Side Scatter (SSC)
Fluorescens intensitet (FL)
Kartläggning av olika celltyper
2014-04-08
13
Forward Scatter – storlek
......::
.. :
Side Scatter –
granularitet, komplexitet
LASER
2014-04-08
14
Storlek / komplexitet
Neutrofiler Eosinofiler
Basofiler
Monocyter
Trombocyter
Lymfocyter
Erytrocyter
2014-04-08
15
Fluorescens
FITC
FluoresceinIsoThioCyanat
PE
Phycoerythrin
PerCP
Peridinin Chlorophyll Protein
2014-04-08
16
Enkelfärgning
Dubbelfärgning
Trippelfärgning
Multifärgning
Fluorescens
Excitation
Emission
405 nm
488 nm
633 nm
2014-04-08
18
antal
Fluorescens
FL1
2014-04-08
19
FL2
Fluorescens
FL1
2014-04-08
20
2013 års utskick
+
+
+
=3
= 100
Utskick 2013
Mars 2st prov
Oktober 2st prov
Färskt EDTA-blod, analys samma dag
Utskick mars 2013
13 deltagande laboratorier
Prov 2013-11/A
Kvinna -66, frisk
U.A.
CV% 2,8-13,6
Prov 2013-11/B
Kvinna -82, MS med Mabtherabehandling
(avsaknad av CD19).
U.A.
Utskick oktober 2013
12 deltagande laboratorier
Prov 2013-42/C
Kvinna -86, frisk
U.A.
CV% 3,3-10,3
Prov 2013-42/D
Kvinna -87, frisk
1 lab anger avvikande högt värde för CD3-16/56+
Troligtvis felregistrering.