Lektion 2: Fluorescens
Uppgift 2:1.
a) Det höga våglängdsområdet tyder på att vi tittar på fluorescensen av DAUDA,
inte av proteinet som sådant (Trp fluorescerar kring 350 nm). DAUDAfluorescensen ökar då protein tillsätts, vilket indikerar att DAUDA binder till
proteinet på ett sätt som låser upp den fluorescerande gruppen och/eller skyddar
den från lösningsmedlet. Båda dessa mekanismer ökar fluorescensen genom att
öka kvantutbytet. Ett svagt rödskift i våglängdsmaximat tyder på en begravning
av DAUDA (annorlunda kemisk omgivning, ändrade vågfunktioner). Då linoleic
acid tillsätts går fluorescensen tillbaks till utgångsläget, vilket indikerar att
fettsyran konkurrerat ut DAUDA från bindningssitet.
b) Om man börjar med att titrera in DAUDA och bestämma affiniteten för denna
bindning kan man sedan konkurrera ut DAUDA med ökande halt fettsyra. Från
den minskande fluorescensen kan då bindingskonstanten för fettsyran bestämmas.
Experimentdesignen kallas kompetitionsexperiment.
Uppgift 2:2
a) FRET-experiment: man kan bestämma avstånd mellan de fluorescerande
grupperna genom att titta på singlet-singlet resonance transfer. En mutation har
gjorts för att införa W i position 188 på proteinet, och en fluorofor har länkats på
DNA antingen uppströms (TATA22up) eller nedströms (TATA22down) från
TATA-boxen. Fluoroforer behövs på två positioner för att energi i form av
ljusöverföring ska kunna ske emellan dem. Förklara FRETöverföringsmekanismen m hj av figur med energinivåer (jfr utkopierat material
från Cantor&Schimmel) och diskutera villkoren för FRET.
b) Med bara en fluorofor skulle man kunna mäta bindningskonstanten mellan
protein och DNA genom att t ex studera quenchningseffekter på fluoroforen i det
bundna/fria tillståndet, men man skulle inte kunna mäta några avstånd.
c) Eftersom fluorescensen vid 440 nm, dvs FRET-signalen från fluoroforen på
DNA, ökar för E188W med TATA22up så är den dominerande orienteringen av
TBP på DNA konsistent med den översta bilden i högerspalten.
Uppgift 2:3
a) I figur A har man använt cirkulärdikroism-spektroskopi (CD) och i B har man
mätt fluorescens. I figur A har man mätt ellipticitet i våglängdsområdet 260-290
(near-UV), där man kan ta reda på om proteinets aromater ligger välordnat eller
oordnat i proteinet beroende på om ellipticiteten är hög eller låg. I figur B har man
mätt fluorescens vid ~450 nm, vilket tyder på att man mätt på en extern prob.
Baserat på emissionsvåglängden är det troligt att man mätt på ANS.
b) De proteiner som visar streckade figurer i B verkar ha delvis foldats upp, eftersom
hydrofoba ytor uppvisas som binder ANS (högre fluorescens när inbundet).
c) Den mindre graden av folding hos de proteiner som är ’streckade’ stämmer
överens med den lägre ellipticiteten i A, vilket tyder på ett oordnat core där
aromaterna inte ligger välordnat. Likadant stämmer det väl överens att det
välordnade proteinet – heldragna linjer, nativt a-lactalbumin – inte binder ANS –
låg fluorescens – ANS binder inte till välveckade proteiners ytor om det inte finns
hydrophoba bindningssites där.
d) Det vore intressant att mäta sekundärstrukturinnehållet genom CD-mätningar i far
UV-området (190-230) för att se om den påverkas. Det vore också intressant att
bestämma Tm för proteinerna genom att mäta ellipticiteten som funktion av
temperaturen t ex vid 220 nm. Det mer flexibla proteinet borde också ha lägre
stabilitet.
Uppgift 2:4.
a) Approachen innebär att man utnyttjar att man har en fluorescensmärkt prob som
binder till det aktiva sitet för proteinet. Genom att se vid vilka koncentrationer den
kan titrera ut andra ligander kompetitivt kan man bestämma affiniteten för en
mängd omärkta ligander. I detta fall vill man dessutom detektera genom att
använda fluorescensanisotropi – även kallat polarisation – vilket ger stor effekt,
eftersom molekylvikten för proben i komplex med proteinet blir oerhört mycket
större än för proben självt, vilket ger ökad anisotropi i det emitterade ljuset pga
långsammare rotation.
b) Figuren visar att anisotropin ökar när fluoroforen binder in till vildtypsproteinet.
Det verkar inte som om proben binder in till mutanten, den kan därför vara inaktiv
– kanske mutationen sitter i aktiva sitet.
c) Biotin konkurrerar delvis ut fluoroforen vilket leder till att anisotropin minskar för
provet som helhet – man får ett medelvärde av anisotropin för obunden och
bunden fluorofor.
d) Man tänker sig att studera anisotropin hos prover i en 96-hålsplatta eller liknande.
Där man får liten anisotropi blir inhiberingsgraden hög. Det innebär alltså att
utslaget är en invers funktion av polarisationen.
