NGS-baserad diagnostik av malignt melanom vid

advertisement
NGS-baserad diagnostik av
malignt melanom vid
Centrum för Molekylär Diagnostik
2015-02-11
Centrum för molekylär diagnostik (CMD) inrättades i oktober 2014 i syfte att stärka
klinisk diagnostik baserat på den s.k. nya generationens sekvenseringsteknik (NGS)
inom Region Skåne. CMD tillhör organisatoriskt Medicinsk service-förvaltningen. Vid
CMD samverkar verksamhetsområden inom Medicinsk service/Labmedicin, Skånes
Universitetssjukhus (SUS) och forskargrupper vid Lunds Universitet (LU).
Inom CMD utarbetas korta översikter för NGS-baserad diagnostik vid olika
sjukdomstillstånd. Dessa översikter författas av arbetsgrupper för olika diagnoser med
en representant från CMD som sammankallande och dokumentansvarig.
Aktuell översikt berör NGS-baserad diagnostik av malignt melanom. Arbetsgruppen
består av följande personer:
•
•
•
•
•
•
Göran Jönsson, Docent, Avd. för Onkologi och Patologi, LU (sammankallande
och dokumentansvarig)
Per Leveén, processledare molekylärpatologi, Klinisk Patologi. Labmedicin
Kajsa Ericson-Lindquist, medicinsk ansvarig molekylärpatologi, Klinisk Patologi,
Labmedicin
Jens Enoksson, processledare hudpatologi, Klinisk Patologi, Labmedicin
Johan Staaf, Docent, Avd. för Onkologi och Patologi, LU
Ana Carneiro, specialist, Onkologiska kliniken, SUS
2
Bakgrund
Malignt melanom är den sjätte vanligaste tumörsjukdomen i Sverige och ca 500
patienter dör årligen av sin sjukdom. Under senare år har betydande framsteg gjorts
avseende behandling av spritt malignt melanom. Redan år 2002 identifierades BRAF
onkogenen som frekvent muterad i melanom tumörer (ca 50% mutationsfrekvens) (1).
Majoriteten av identifierade mutationer innefattar en substitution av valin till
glutaminsyra vid aminosyra position 600. Detta fynd initierade en intensiv
forskningsaktivitet med mål att definiera nya terapeutiska möjligheter för patienter
med BRAF mutation. Den första fas I studien med den selektiva inhibitorn mot muterat
BRAF, RG7204 (senare benämnd Vemurafenib), rapporterades år 2010 och patienter
med en BRAF V600E mutation uppvisade tydlig klinisk respons (2). Det har nu i
åtskilliga studier visats att BRAF inhibitorer har klinisk effekt i patienter med BRAF
V600 muterade tumörer. Nyare studier visar att tillägg av MEK inhibitor i kombination
med BRAF inhibitor ger en additiv effekt hos patienter med ett BRAF muterat melanom
(3, 4). NRAS onkogenen är också frekvent muterad i melanom. En första fas II studie
visar att MEK inhibitorer har effekt hos patienter med NRAS muterat melanom (5).
Slutligen pågår det adjuvanta fas III studier där patienter med en regionalt metastatisk
BRAF positiv sjukdom behandlas med kombinationen av BRAF och MEK inhibitorer.
Beroende på resultat skulle detta öka patient populationen aktuell för BRAF testning
avsevärt. Trots att patienter med BRAF muterade tumörer generellt svarar mycket väl
på behandling uppkommer resistens mot behandling efter kort tid (ca 6 månader).
Bakgrunden till behandlingsresistensen är mångfacetterad och inkluderar sekundära
förändringar i BRAF, ex genomisk amplifiering, men även mutationer eller DNA
kopietalsförändringar i andra onkogener/tumörsuppressor gener har visats ge upphov
till resistens mot BRAF inhibitorer. Därmed föreligger det ett reellt kliniskt behov av att
prediktivt testa melanomtumörer för mutationer primärt i BRAF och sekundärt i NRAS,
samt i förlängningen mutationer i andra gener för framtida målstyrda terapier och
gener involverade i behandlingsresistens.
Inom Region Skåne utfördes ca 150 BRAF mutationsanalyser för malignt melanom
under 2014. De patienter som främst är aktuella för mutationsanalys och som kommer
att erbjudas medicinsk onkologisk behandling är de med spridd sjukdom.
Provtagningsrutiner och provhantering för NGS-baserad diagnostik
Utgångspunkten för den NGS-baserade diagnostiken är paraffininbäddad
formalinfixerad vävnad (s.k. FFPE vävnad). Molekylärpatolog ansvarar för materialets
lämplighet för analys, genom att granska tumörvävnad från de histologiska och/eller
cytologiska preparat som finns arkiverade. Ett representativt tumörområde väljs ut
med hög andel maligna cellkärnor. Ofta kan detta utgöra en liten del av den vävnadsbit
som finns i en FFPE klots. Ett antal tunna snitt av urvald tumörvävnad tas, typiskt 4st
5um snitt, samt nya HTX-snitt för att verifiera att representativt material analyserats.
(utförs av VO Klinisk Patologi). Vid tillfälle kan provpreparatet även bestå av
cytologimaterial i form av cytologiutstryk, där ett celllysat förbereds varifrån DNA
extraheras, eller paraffininbäddat centrifugerat cytologimaterial som snittas (s.k.
cellblock). Provet, tillsammans med mutationsremiss, transporteras därefter till
Avdelningen för Onkologi och Patologi. Provtransport sker två gånger i veckan på
bestämda dagar (se Figur 1).
3
Vid ankomst av prov och remiss till avdelningen registreras provet och remissen
arkiveras i ett dedikerat remissrum (se Figur 1). Vid registrering erhåller varje prov ett
avkodat löpnummer specifikt för laboratoriet. Detta löpnummer används därefter i
den laborativa såväl som dataanalysdelen av mutationsanalysen. Kopplingen mellan
löpnummer och persondata är endast tillgänglig för dedikerad personal från
Avdelningen för Onkologi och Patologi och VO Klinisk Patologi via Region Skånes ITstruktur, inom vilken även färdigställande av mutationsrapport sker.
Figur 1. Översikt av NGS-baserad diagnostik vid Avdelningen för Onkologi och Patologi. Varje vecka
utförs två stycken parallella analyser med olika startdagar. En analys tar 5 arbetsdagar i anspråk från det
att DNA/RNA extraktion påbörjats till dess att mutationssvar rapporteras tillbaka.
Nukleinsyra extraktion och DNA kvalitetskontroll
Från provet (FFPE snitt) extraheras DNA och RNA. Först avparaffiniseras provet med
hjälp av lösningsmedel (xylen), varefter den rena tumörvävnaden bryts ner
enzymatiskt så att DNA och RNA frisläpps i lösning. DNA/RNA isolering sker därefter
automatiserat med ett kommersiellt extraktionskit (Qiagen FFPE AllPrepp). DNA/RNA
extraktion utförs två gånger i veckan (se Figur 1).
Formalinfixering av tumörvävnad leder till degradering av nukleinsyror. Det är
därför av stor betydelse att uppskatta hur utbredd DNA degraderingen är innan
molekylärgenetisk analys genomförs. Extraherat DNA används i en kvantitativ PCR
reaktion för att bestämma hur stor mängd av det totala DNAt som motsvarar en viss
storlek. Detta är ett viktigt steg för att kunna förutspå vilka prover som kommer att ge
ett tillförlitligt mutationssvar. Den kvantitativa PCR analysen resulterar i ett
kvalitetsvärde som indikerar provets lämplighet för NGS-baserad diagnostik. Om
kvalitetsvärdet faller utanför empiriskt definierade ramar återrapporteras detta till
4
Klinisk Patologi där ett beslut tas om preparatet trots allt ska gå vidare till
mutationsanalys eller om nytt material ska begäras. Detta förfarande förkortar
avsevärt svarstiden för prov som sannolikt inte skulle ge informativa svar i NGSanalysen.
NGS-baserad diagnostik för identifiering av somatiska mutationer
Prov vars DNA passerat kvalitetskontrollen går vidare till den NGS-baserade
mutationsanalysen. Metoden som används vid Avdelningen för Onkologi och Patologi
är baserad på Illuminas (www.illumina.com) ”next generation sequencing” (NGS)
teknik i kombination med en riktad genpanel (Illumina TruSight Tumor genpanel). Den
riktade genpanelen innefattar 26 stycken utvalda cancerrelaterade gener (Figur 2 och
Tabell 1).
Figur 2. Gruppering av TruSight Tumor 26-gen NGS panel enligt tumörsjukdom (www.illumina.com).
GIST: Gastrointestinal stromacellstumör.
För dessa gener analyseras olika antal hela kodande exon. Val av exon är baserat på
förekomst av rapporterade somatiska tumörförändringar via exempelvis COSMIC
(http://cancer.sanger.ac.uk), CAP (www.cap.org) och NCCN (www.nccn.org) riktlinjer,
samt kliniska prövningar (www.clinicaltrials.gov). Den experimentella delen av NGS
metoden kan delas upp i två steg, i) preparering av ett s.k. DNA provbibliotek för varje
prov och ii) själva sekvenseringen. Ett DNA provbibliotek betyder här en vätskelösning
av ett stort antal olika DNA fragment för vilka DNA sekvensen ska bestämmas. I
prepareringen av ett provbibliotek för ett specifikt prov anrikas först DNA från de
specifika genregioner som ska analyseras via en hybridiseringsprocess. Denna
anrikning utförs separat för de två olika DNA strängarna via olika oligonukleotidpooler.
Detta innebär att för varje prov skapas i slutändan två individuella provbibliotek vilka
är att betrakta som tekniska replikat. Därefter amplifieras de utvalda genregioner i en
PCR reaktion, och specifika oligonukleotidadaptorer kopplas på varje fragment för att
möjliggöra sekvensering. Innan sekvensering poolas de två biblioteken för varje prov.
På grund av NGS teknikens massiva kapacitet kan många prov prepareras parallellt,
poolas, och sekvenseras samtidigt, vilket medger ett högt provflöde. Sekvenseringen
sker därefter på ett Illumina MiSeq instrumentet. Den experimentella
mutationsanalysen (bibliotekspreparation och sekvensering) utförs två gånger per
vecka (se Figur 1).
5
Tabell 1. Gener och hela exon ingåendes i Illumina TruSight Tumor genpanelen.
Gen
Typ av gen
Analyserade hela exon
AKT1
Onkogen
2
ALK
Onkogen
23
APC
Tumörsuppressor gen
15
BRAF
Onkogen
11, 15
CDH1
Tumörsuppressor gen
8, 9, 12
CTNNB1
Onkogen
2
EGFR
Onkogen
18, 19, 20, 21
ERBB2
Onkogen
20
FBXW7
Tumörsuppressor gen
7, 8, 9, 10, 11
FGFR2
Onkogen
6
FOXL2
Onkogen
1
GNAQ
Onkogen
4, 5, 6
GNAS
Onkogen
6, 8
KIT
Onkogen
9, 11, 13, 17, 18
KRAS
Onkogen
1, 2, 3, 4
MAP2K1
Onkogen
2
MET
Onkogen
1, 4, 13, 15, 16, 17, 18, 20
MSH6
Tumörsuppressor gen
5
NRAS
Onkogen
1, 2, 3, 4
PDGFRA
Onkogen
11, 13, 17
PIK3CA
Onkogen
1, 2, 7, 9, 20
PTEN
Tumörsuppressor gen
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9
SMAD4
Tumörsuppressor gen
8, 11
SRC
Onkogen
10
STK11
Tumörsuppressor gen
1, 4, 6, 8
TP53
Tumörsuppressor gen
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11
Analys av somatiska varianter från NGS data
NGS tekniken genererar en massiv sekvensmängd för varje prov. För att kunna
identifiera somatiska mutationer (varianter) i denna stora datamängd för de 26
generna sker ett antal dataanalyssteg i samband med sekvensering (Figur 1). Först
måste sekvensdatan från MiSeq instrumentet matchas mot ett humant referensgenom
för att definiera vilka sekvenser som hör till en viss undersökt genregion, ex exon 19 i
EGFR. För Illumina TruSight Tumor panelen sker detta via en BWA baserad alignment
algoritm (6). Därefter identifieras basparspositioner där den undersökta sekvensen
inte matchar referensgenomet, s.k. varianter (potentiella mutationer). Denna analys
sker via en implementering av en GATK baserad algoritm (7). Genom att räkna antalet
sekvenser med en viss variant jämfört med totala antalet sekvenser för området kan
en variantfrekvens beräknas (Figur 3).
6
Figur 3. Illustration över begreppet variantfrekvens. A) NGS-analys har identifierat en deletion av 15
baser i exon 19 i EGFR genen i ett lungcancer adenocarcinom. X-axeln visar basparspositioner i genomet
för exon 19 i EGFR genen. Y-axeln visar antalet gånger respektive bas har sekvenserats, s.k.
täckningsgrad. Deletionen visar sig som en tydlig nedgång i täckningsgrad eftersom de 15 baserna är
deleterade i många tumörcellers genom. B) NGS-analys har identifierat en punktmutation i exon 6 i
tumörsuppressorgenen TP53 i ett lungcancer adenocarcinom. X-axeln visar ett begränsat antal baser (en
cirkel motsvarar en bas) i exon 6 i TP53 genen. Y-axeln visar täckningsgrad enligt A. Röd linje visar
antalet gånger en bas med avvikande sekvens mot referensgenomet (grön linje) har identifierats.
Punktmutationen ses som en höjning av den röda linjen över noll för en specifik bas i exon 6,
motsvarande 25% av alla sekvenser för denna bas.
Variantfrekvensen ger en indirekt uppfattning av hur frekvent mutationen är i
tumören. En variant (mutation) som detekteras endast i ett fåtal sekvenser kan
reflektera att endast en subklon av tumören bär på mutationen, alternativt att det
analyserade preparatets tumörhalt är låg. I denna analys utnyttjas det faktum att varje
prov representeras av två olika provbibliotek. Endast varianter som korrekt återfinns i
båda provbiblioteken används för vidare analys. Detta tillvägagångssätt har fördelen av
att kunna identifiera och filtrera bort basparsvariationer som tillkommit genom
exempelvis formalinfixeringen av vävnaden (DNA skada). Alla dessa steg är inbyggda i
ett strömlinjeformat analysflöde som utförs automatiskt på MiSeq instrumentet under
och efter att den faktiska sekvenseringen är klar. Resultatet av analysen består av en
textfil med alla identifierade varianter för respektive prov. För annotering och
klassificering av varianter för den slutliga mutationsrapporten används ett specifikt
annoteringsprogram, VariantStudio, (Illumina). Detta program möjliggör på enkelt sätt
annotering av identifierade varianter mot ett stort antal olika databaser, inklusive
COSMIC (http://cancer.sanger.ac.uk), ClinVar (www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar), och
databaser över naturligt förekommande varianter i det humana genomet (SNP
databaser). Kopplat till variantannoteringen sker även klassning och filtrering av
identifierade varianter. I detta steg identifieras dels kända behandlingsprediktiva
mutationer som exempelvis BRAF V600E, EGFR L858R, och KRAS G12C, men även
somatiska varianter som kan vara drivande i tumörutvecklingen men för vilka ingen
behandling existerar i nuläget.
Återrapportering av mutationsresultat till VO Klinisk Patologi
Efter att identifierade varianter från sekvenseringen har annoterats, filtrerats, och
klassats sammanställs en rapport över samtliga kvarvarande varianter (mutationer).
Först i denna rapport sker återkopplingen mellan patient och mutationssvar.
Mutationsrapporten färdigställs inom Region Skånes IT-struktur, varefter rapport samt
grunddata över identifierade varianter överförs till VO Klinisk Patologi för vidare
sammanställning/formatering och slutgiltig återrapportering till remitterande kliniker.
7
Svarstider NGS-baserad diagnostik
Arbetsschemat för NGS-baserad diagnostik inom Avdelningen för Onkologi och
Patologi (Figur 1) innebär att två analyser utförs per vecka på bestämda dagar, där
varje labanalys tar 5 arbetsdagar i anspråk efter att FFPE tumörvävnad ankommit till
avdelningen. Svarstid till VO Klinisk Patologi blir därigenom 5-7 arbetsdagar beroende
på när FFPE tumörvävnad är redo för transport från Klinisk Patologi efter snitting.
Referenser
1.
Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, et al. Mutations of
the BRAF gene in human cancer. Nature 2002;417: 949-54.
2.
Flaherty KT, Puzanov I, Kim KB, Ribas A, McArthur GA, Sosman JA, et al.
Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N Engl J Med 2010;363:
809-19.
3.
Long GV, Stroyakovskiy D, Gogas H, Levchenko E, de Braud F, Larkin J, et al.
Combined BRAF and MEK inhibition versus BRAF inhibition alone in melanoma. N Engl J
Med 2014;371: 1877-88.
4.
Robert C, Karaszewska B, Schachter J, Rutkowski P, Mackiewicz A, Stroiakovski
D, et al. Improved overall survival in melanoma with combined dabrafenib and
trametinib. N Engl J Med 2014;372: 30-9.
5.
Ascierto PA, Schadendorf D, Berking C, Agarwala SS, van Herpen CM, Queirolo
P, et al. MEK162 for patients with advanced melanoma harbouring NRAS or Val600
BRAF mutations: a non-randomised, open-label phase 2 study. Lancet Oncol 2013;14:
249-56.
6.
Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler
transform. Bioinformatics 2009;25: 1754-60.
7.
DePristo MA, Banks E, Poplin R, Garimella KV, Maguire JR, Hartl C, et al. A
framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA
sequencing data. Nat Genet 2011;43: 491-8.
8
Download
Random flashcards
Ölplugg

1 Cards oauth2_google_ed8be09c-94f0-4e6a-8e55-87a3b14a45db

Create flashcards