NGS-baserad diagnostik av malignt melanom vid Centrum för Molekylär Diagnostik 2015-02-11 Centrum för molekylär diagnostik (CMD) inrättades i oktober 2014 i syfte att stärka klinisk diagnostik baserat på den s.k. nya generationens sekvenseringsteknik (NGS) inom Region Skåne. CMD tillhör organisatoriskt Medicinsk service-förvaltningen. Vid CMD samverkar verksamhetsområden inom Medicinsk service/Labmedicin, Skånes Universitetssjukhus (SUS) och forskargrupper vid Lunds Universitet (LU). Inom CMD utarbetas korta översikter för NGS-baserad diagnostik vid olika sjukdomstillstånd. Dessa översikter författas av arbetsgrupper för olika diagnoser med en representant från CMD som sammankallande och dokumentansvarig. Aktuell översikt berör NGS-baserad diagnostik av malignt melanom. Arbetsgruppen består av följande personer: • • • • • • Göran Jönsson, Docent, Avd. för Onkologi och Patologi, LU (sammankallande och dokumentansvarig) Per Leveén, processledare molekylärpatologi, Klinisk Patologi. Labmedicin Kajsa Ericson-Lindquist, medicinsk ansvarig molekylärpatologi, Klinisk Patologi, Labmedicin Jens Enoksson, processledare hudpatologi, Klinisk Patologi, Labmedicin Johan Staaf, Docent, Avd. för Onkologi och Patologi, LU Ana Carneiro, specialist, Onkologiska kliniken, SUS 2 Bakgrund Malignt melanom är den sjätte vanligaste tumörsjukdomen i Sverige och ca 500 patienter dör årligen av sin sjukdom. Under senare år har betydande framsteg gjorts avseende behandling av spritt malignt melanom. Redan år 2002 identifierades BRAF onkogenen som frekvent muterad i melanom tumörer (ca 50% mutationsfrekvens) (1). Majoriteten av identifierade mutationer innefattar en substitution av valin till glutaminsyra vid aminosyra position 600. Detta fynd initierade en intensiv forskningsaktivitet med mål att definiera nya terapeutiska möjligheter för patienter med BRAF mutation. Den första fas I studien med den selektiva inhibitorn mot muterat BRAF, RG7204 (senare benämnd Vemurafenib), rapporterades år 2010 och patienter med en BRAF V600E mutation uppvisade tydlig klinisk respons (2). Det har nu i åtskilliga studier visats att BRAF inhibitorer har klinisk effekt i patienter med BRAF V600 muterade tumörer. Nyare studier visar att tillägg av MEK inhibitor i kombination med BRAF inhibitor ger en additiv effekt hos patienter med ett BRAF muterat melanom (3, 4). NRAS onkogenen är också frekvent muterad i melanom. En första fas II studie visar att MEK inhibitorer har effekt hos patienter med NRAS muterat melanom (5). Slutligen pågår det adjuvanta fas III studier där patienter med en regionalt metastatisk BRAF positiv sjukdom behandlas med kombinationen av BRAF och MEK inhibitorer. Beroende på resultat skulle detta öka patient populationen aktuell för BRAF testning avsevärt. Trots att patienter med BRAF muterade tumörer generellt svarar mycket väl på behandling uppkommer resistens mot behandling efter kort tid (ca 6 månader). Bakgrunden till behandlingsresistensen är mångfacetterad och inkluderar sekundära förändringar i BRAF, ex genomisk amplifiering, men även mutationer eller DNA kopietalsförändringar i andra onkogener/tumörsuppressor gener har visats ge upphov till resistens mot BRAF inhibitorer. Därmed föreligger det ett reellt kliniskt behov av att prediktivt testa melanomtumörer för mutationer primärt i BRAF och sekundärt i NRAS, samt i förlängningen mutationer i andra gener för framtida målstyrda terapier och gener involverade i behandlingsresistens. Inom Region Skåne utfördes ca 150 BRAF mutationsanalyser för malignt melanom under 2014. De patienter som främst är aktuella för mutationsanalys och som kommer att erbjudas medicinsk onkologisk behandling är de med spridd sjukdom. Provtagningsrutiner och provhantering för NGS-baserad diagnostik Utgångspunkten för den NGS-baserade diagnostiken är paraffininbäddad formalinfixerad vävnad (s.k. FFPE vävnad). Molekylärpatolog ansvarar för materialets lämplighet för analys, genom att granska tumörvävnad från de histologiska och/eller cytologiska preparat som finns arkiverade. Ett representativt tumörområde väljs ut med hög andel maligna cellkärnor. Ofta kan detta utgöra en liten del av den vävnadsbit som finns i en FFPE klots. Ett antal tunna snitt av urvald tumörvävnad tas, typiskt 4st 5um snitt, samt nya HTX-snitt för att verifiera att representativt material analyserats. (utförs av VO Klinisk Patologi). Vid tillfälle kan provpreparatet även bestå av cytologimaterial i form av cytologiutstryk, där ett celllysat förbereds varifrån DNA extraheras, eller paraffininbäddat centrifugerat cytologimaterial som snittas (s.k. cellblock). Provet, tillsammans med mutationsremiss, transporteras därefter till Avdelningen för Onkologi och Patologi. Provtransport sker två gånger i veckan på bestämda dagar (se Figur 1). 3 Vid ankomst av prov och remiss till avdelningen registreras provet och remissen arkiveras i ett dedikerat remissrum (se Figur 1). Vid registrering erhåller varje prov ett avkodat löpnummer specifikt för laboratoriet. Detta löpnummer används därefter i den laborativa såväl som dataanalysdelen av mutationsanalysen. Kopplingen mellan löpnummer och persondata är endast tillgänglig för dedikerad personal från Avdelningen för Onkologi och Patologi och VO Klinisk Patologi via Region Skånes ITstruktur, inom vilken även färdigställande av mutationsrapport sker. Figur 1. Översikt av NGS-baserad diagnostik vid Avdelningen för Onkologi och Patologi. Varje vecka utförs två stycken parallella analyser med olika startdagar. En analys tar 5 arbetsdagar i anspråk från det att DNA/RNA extraktion påbörjats till dess att mutationssvar rapporteras tillbaka. Nukleinsyra extraktion och DNA kvalitetskontroll Från provet (FFPE snitt) extraheras DNA och RNA. Först avparaffiniseras provet med hjälp av lösningsmedel (xylen), varefter den rena tumörvävnaden bryts ner enzymatiskt så att DNA och RNA frisläpps i lösning. DNA/RNA isolering sker därefter automatiserat med ett kommersiellt extraktionskit (Qiagen FFPE AllPrepp). DNA/RNA extraktion utförs två gånger i veckan (se Figur 1). Formalinfixering av tumörvävnad leder till degradering av nukleinsyror. Det är därför av stor betydelse att uppskatta hur utbredd DNA degraderingen är innan molekylärgenetisk analys genomförs. Extraherat DNA används i en kvantitativ PCR reaktion för att bestämma hur stor mängd av det totala DNAt som motsvarar en viss storlek. Detta är ett viktigt steg för att kunna förutspå vilka prover som kommer att ge ett tillförlitligt mutationssvar. Den kvantitativa PCR analysen resulterar i ett kvalitetsvärde som indikerar provets lämplighet för NGS-baserad diagnostik. Om kvalitetsvärdet faller utanför empiriskt definierade ramar återrapporteras detta till 4 Klinisk Patologi där ett beslut tas om preparatet trots allt ska gå vidare till mutationsanalys eller om nytt material ska begäras. Detta förfarande förkortar avsevärt svarstiden för prov som sannolikt inte skulle ge informativa svar i NGSanalysen. NGS-baserad diagnostik för identifiering av somatiska mutationer Prov vars DNA passerat kvalitetskontrollen går vidare till den NGS-baserade mutationsanalysen. Metoden som används vid Avdelningen för Onkologi och Patologi är baserad på Illuminas (www.illumina.com) ”next generation sequencing” (NGS) teknik i kombination med en riktad genpanel (Illumina TruSight Tumor genpanel). Den riktade genpanelen innefattar 26 stycken utvalda cancerrelaterade gener (Figur 2 och Tabell 1). Figur 2. Gruppering av TruSight Tumor 26-gen NGS panel enligt tumörsjukdom (www.illumina.com). GIST: Gastrointestinal stromacellstumör. För dessa gener analyseras olika antal hela kodande exon. Val av exon är baserat på förekomst av rapporterade somatiska tumörförändringar via exempelvis COSMIC (http://cancer.sanger.ac.uk), CAP (www.cap.org) och NCCN (www.nccn.org) riktlinjer, samt kliniska prövningar (www.clinicaltrials.gov). Den experimentella delen av NGS metoden kan delas upp i två steg, i) preparering av ett s.k. DNA provbibliotek för varje prov och ii) själva sekvenseringen. Ett DNA provbibliotek betyder här en vätskelösning av ett stort antal olika DNA fragment för vilka DNA sekvensen ska bestämmas. I prepareringen av ett provbibliotek för ett specifikt prov anrikas först DNA från de specifika genregioner som ska analyseras via en hybridiseringsprocess. Denna anrikning utförs separat för de två olika DNA strängarna via olika oligonukleotidpooler. Detta innebär att för varje prov skapas i slutändan två individuella provbibliotek vilka är att betrakta som tekniska replikat. Därefter amplifieras de utvalda genregioner i en PCR reaktion, och specifika oligonukleotidadaptorer kopplas på varje fragment för att möjliggöra sekvensering. Innan sekvensering poolas de två biblioteken för varje prov. På grund av NGS teknikens massiva kapacitet kan många prov prepareras parallellt, poolas, och sekvenseras samtidigt, vilket medger ett högt provflöde. Sekvenseringen sker därefter på ett Illumina MiSeq instrumentet. Den experimentella mutationsanalysen (bibliotekspreparation och sekvensering) utförs två gånger per vecka (se Figur 1). 5 Tabell 1. Gener och hela exon ingåendes i Illumina TruSight Tumor genpanelen. Gen Typ av gen Analyserade hela exon AKT1 Onkogen 2 ALK Onkogen 23 APC Tumörsuppressor gen 15 BRAF Onkogen 11, 15 CDH1 Tumörsuppressor gen 8, 9, 12 CTNNB1 Onkogen 2 EGFR Onkogen 18, 19, 20, 21 ERBB2 Onkogen 20 FBXW7 Tumörsuppressor gen 7, 8, 9, 10, 11 FGFR2 Onkogen 6 FOXL2 Onkogen 1 GNAQ Onkogen 4, 5, 6 GNAS Onkogen 6, 8 KIT Onkogen 9, 11, 13, 17, 18 KRAS Onkogen 1, 2, 3, 4 MAP2K1 Onkogen 2 MET Onkogen 1, 4, 13, 15, 16, 17, 18, 20 MSH6 Tumörsuppressor gen 5 NRAS Onkogen 1, 2, 3, 4 PDGFRA Onkogen 11, 13, 17 PIK3CA Onkogen 1, 2, 7, 9, 20 PTEN Tumörsuppressor gen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 SMAD4 Tumörsuppressor gen 8, 11 SRC Onkogen 10 STK11 Tumörsuppressor gen 1, 4, 6, 8 TP53 Tumörsuppressor gen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 Analys av somatiska varianter från NGS data NGS tekniken genererar en massiv sekvensmängd för varje prov. För att kunna identifiera somatiska mutationer (varianter) i denna stora datamängd för de 26 generna sker ett antal dataanalyssteg i samband med sekvensering (Figur 1). Först måste sekvensdatan från MiSeq instrumentet matchas mot ett humant referensgenom för att definiera vilka sekvenser som hör till en viss undersökt genregion, ex exon 19 i EGFR. För Illumina TruSight Tumor panelen sker detta via en BWA baserad alignment algoritm (6). Därefter identifieras basparspositioner där den undersökta sekvensen inte matchar referensgenomet, s.k. varianter (potentiella mutationer). Denna analys sker via en implementering av en GATK baserad algoritm (7). Genom att räkna antalet sekvenser med en viss variant jämfört med totala antalet sekvenser för området kan en variantfrekvens beräknas (Figur 3). 6 Figur 3. Illustration över begreppet variantfrekvens. A) NGS-analys har identifierat en deletion av 15 baser i exon 19 i EGFR genen i ett lungcancer adenocarcinom. X-axeln visar basparspositioner i genomet för exon 19 i EGFR genen. Y-axeln visar antalet gånger respektive bas har sekvenserats, s.k. täckningsgrad. Deletionen visar sig som en tydlig nedgång i täckningsgrad eftersom de 15 baserna är deleterade i många tumörcellers genom. B) NGS-analys har identifierat en punktmutation i exon 6 i tumörsuppressorgenen TP53 i ett lungcancer adenocarcinom. X-axeln visar ett begränsat antal baser (en cirkel motsvarar en bas) i exon 6 i TP53 genen. Y-axeln visar täckningsgrad enligt A. Röd linje visar antalet gånger en bas med avvikande sekvens mot referensgenomet (grön linje) har identifierats. Punktmutationen ses som en höjning av den röda linjen över noll för en specifik bas i exon 6, motsvarande 25% av alla sekvenser för denna bas. Variantfrekvensen ger en indirekt uppfattning av hur frekvent mutationen är i tumören. En variant (mutation) som detekteras endast i ett fåtal sekvenser kan reflektera att endast en subklon av tumören bär på mutationen, alternativt att det analyserade preparatets tumörhalt är låg. I denna analys utnyttjas det faktum att varje prov representeras av två olika provbibliotek. Endast varianter som korrekt återfinns i båda provbiblioteken används för vidare analys. Detta tillvägagångssätt har fördelen av att kunna identifiera och filtrera bort basparsvariationer som tillkommit genom exempelvis formalinfixeringen av vävnaden (DNA skada). Alla dessa steg är inbyggda i ett strömlinjeformat analysflöde som utförs automatiskt på MiSeq instrumentet under och efter att den faktiska sekvenseringen är klar. Resultatet av analysen består av en textfil med alla identifierade varianter för respektive prov. För annotering och klassificering av varianter för den slutliga mutationsrapporten används ett specifikt annoteringsprogram, VariantStudio, (Illumina). Detta program möjliggör på enkelt sätt annotering av identifierade varianter mot ett stort antal olika databaser, inklusive COSMIC (http://cancer.sanger.ac.uk), ClinVar (www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar), och databaser över naturligt förekommande varianter i det humana genomet (SNP databaser). Kopplat till variantannoteringen sker även klassning och filtrering av identifierade varianter. I detta steg identifieras dels kända behandlingsprediktiva mutationer som exempelvis BRAF V600E, EGFR L858R, och KRAS G12C, men även somatiska varianter som kan vara drivande i tumörutvecklingen men för vilka ingen behandling existerar i nuläget. Återrapportering av mutationsresultat till VO Klinisk Patologi Efter att identifierade varianter från sekvenseringen har annoterats, filtrerats, och klassats sammanställs en rapport över samtliga kvarvarande varianter (mutationer). Först i denna rapport sker återkopplingen mellan patient och mutationssvar. Mutationsrapporten färdigställs inom Region Skånes IT-struktur, varefter rapport samt grunddata över identifierade varianter överförs till VO Klinisk Patologi för vidare sammanställning/formatering och slutgiltig återrapportering till remitterande kliniker. 7 Svarstider NGS-baserad diagnostik Arbetsschemat för NGS-baserad diagnostik inom Avdelningen för Onkologi och Patologi (Figur 1) innebär att två analyser utförs per vecka på bestämda dagar, där varje labanalys tar 5 arbetsdagar i anspråk efter att FFPE tumörvävnad ankommit till avdelningen. Svarstid till VO Klinisk Patologi blir därigenom 5-7 arbetsdagar beroende på när FFPE tumörvävnad är redo för transport från Klinisk Patologi efter snitting. Referenser 1. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002;417: 949-54. 2. Flaherty KT, Puzanov I, Kim KB, Ribas A, McArthur GA, Sosman JA, et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N Engl J Med 2010;363: 809-19. 3. Long GV, Stroyakovskiy D, Gogas H, Levchenko E, de Braud F, Larkin J, et al. Combined BRAF and MEK inhibition versus BRAF inhibition alone in melanoma. N Engl J Med 2014;371: 1877-88. 4. Robert C, Karaszewska B, Schachter J, Rutkowski P, Mackiewicz A, Stroiakovski D, et al. Improved overall survival in melanoma with combined dabrafenib and trametinib. N Engl J Med 2014;372: 30-9. 5. Ascierto PA, Schadendorf D, Berking C, Agarwala SS, van Herpen CM, Queirolo P, et al. MEK162 for patients with advanced melanoma harbouring NRAS or Val600 BRAF mutations: a non-randomised, open-label phase 2 study. Lancet Oncol 2013;14: 249-56. 6. Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2009;25: 1754-60. 7. DePristo MA, Banks E, Poplin R, Garimella KV, Maguire JR, Hartl C, et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat Genet 2011;43: 491-8. 8