Molekylärbiologins centrala dogma
m
Replikation: Bassekvensen i DNA står för den genetiska informationen. När en cell
ska delas måste DNA:t dupliceras – man måste få nytt DNA med exakt samma
bassekvens som originalet.
Vid proteinsyntes överförs informationen från DNA till aminosyrasekvens i två steg:
Transkription: Bassekvensen i DNA översätts till bassekvens i mRNA. mRNA fungerar
sedan som mall för proteinsyntesen.
Translation: Bassekvens i mRNA översätts till aminosyrasekvens m h a tRNA.
Processen sker på ribosomerna. En sekvens av tre baser utgör den GENETISKA
KODEN och specificerar en viss aminosyra.
Snabb repetition - RNA molekylerna
RNA:
Tre huvudtyper:
•
tRNA
transfer RNA
Hämtar aminosyra i cytosolen och
transporterar den till ribosomen
•
rRNA
ribosomalt RNA
Stora RNA molekyler som tillsammans med proteiner
bygger upp ribosomer (2/3 av massan är RNA,
1/3 proteiner).
•
mRNA
messenger RNA
Innehåller bassekvensen som specificerar
aminosyrasekvensen i ett protein.
Snabb repetition - splicing av mRNA
• De primära mRNA transkripten i
eukaryoter består av EXONER och
INTRONER.
• Exonerna innehåller den genetiska
informationen som kodar för protein - 2%
av vårt genmaterial
• Intronerna (- 98 % av vårt genmaterial)
används inte som mall för proteinsyntes
utan dessa klipps bort från mRNA –
processen kallas för splicing
Exon
Exon
mRNA före splicing
• Splicing sker i cellkärnan på
SPLICEOSOMEN - innehåller proteiner och
snRNA (= small nuclear RNA som har
katalytisk aktivitet!)
Färdigprocessat mRNA som kan translateras
mRNA efter splicing
Translationen
Bassekvensen i mRNA överförs till aminosyrasekvens via GENETISKA KODEN.
Varje aminosyra motsvaras av en eller flera bastripletter. De tre baserna kallas med
ett ord för ett kodon.
1961 knäcktes koden och gav nobelpriset 1968 – kort tid mellan upptäckt och pris.
4 baser kan kombineras och ge 43=64 olika tripletter.
61 av dessa kodar för aminosyror medan 3 koder är STOPP-koder: UAG, UGA, UAA.
20 aminosyror – 61 koder: Flera aminosyror har flera koder ⇒ genetiska koden är
degenererad.
När man väl förstått DNA-strukturen 1953 började jobbet med att förstå hur bassekvensen
översätts till aminosyrasekvensen. 1954 bildades RNA-slipsklubben (RNA-tie club) med 20
välrenommerade forskare där alla fick var sin ullslips broderat med en gulgrön helix. De kläckte
idén att det nog fanns en adaptormolekyl (tRNA) och att det nog var 3 baser som svarade mot
en aminosyra. Dock var det andra forskare som slutligen knäckte koden.
Genetiska koden
Tre nukleotider i följd kodar för en aminosyra
Ex:
UUU = Phe
CAU = His
CAA = Gln
CGU = Arg
CGC = Arg
CGA = Arg
CGG = Arg
AGA = Arg
AGG = Arg
En aminosyra kan kodas av flera kodon = den genetiska koden är degenererad
Genetiska koden
- De olika koderna för en aminosyra liknar
varandra vilket minskar risken för allvarliga
effekter av mutationer.
Ex:
CGU = Arg
CGC = Arg
CGA = Arg
CGG = Arg
AGA = Arg
AGG = Arg
- Antalet koder är korrelerat till hur vanlig
respektive aminosyra är i proteiner.
Koder som kodar för samma aminosyra kallas SYNONYMER
1. Genetiska koden är degenerarad
2. Introner (98 % av genmaterialet)
Många mutationer är tysta! dvs de leder
inte till något fel i aminosyrasekvensen
Genetiska koden
Den genetiska koden
Uppgifter:
Ange vad följande kodoner
motsvarar för aminosyror:
AAG
CCU
GAG
Ange alla koder för:
Asparagin
Serin
Genetiska koden
Varför är genetiska koden degenererad?
Om alla aminosyror bara hade en kod:
20 kodon
44 stoppsignaler (större chans att en mutation leder till en stopkodon)
Risken är mycket hög att ett protein blir inaktivt om translationen avbryts för tidigt.
Ett protein med en utbytt aminosyra har oftast viss aktivitet om det inte är någon av
de katalytiska aminosyrorna som ersatts.
Genetiska koden är nästan universell:
Vissa variationer har dock upptäckts i mitokondrieDNA. Mitokondrierna har
bakteriellt ursprung men upptogs av en eukaryot värd mycket tidigt i evolutionen.
Mitokondriellt DNA ärvs bara från mamman och används bland annat inom
forensisk genetik vid identifiering. Mitokondriellt DNA är mer skyddat och
bevaras bättre och därför är det användbart speciellt om det bara finns små
mängder analysmaterial, t ex hudflagor på en tröja.
Translationen
Kodon – antikodon:
Kodon finns på mRNA
Antikodon finns på tRNA
tRNA interagerar antiparallellt med mRNA
3'
Uppgifter:
3’
5’
1.
Kodon:
5’-GCA-3’ (kodar for Ala)
Antikodon?
2.
Ange antikoden för en tRNA som bär metionin
Translationen
mRNA innehåller start signal (AUG) för proteinsyntes
Proteinsyntesen börjar med aminosyran metionin
Formylgrupp
Translationen
Proteinsyntesen sker på ribosomen som utgörs av rRNA (2/3) och protein (1/3)
Ribosomen består av en stor enhet på 50S och en mindre enhet på 30S (60S och 40S hos eukaryoter)
Tillsammans bildar dessa enheter ett komplex på 70S (S = sedimenterings koefficient)
Translationen – stegvis
1. Aktivering av aminosyran
Kopplas till aminosyrans karboxylgrupp
Aminosyra + ATP aminoacyl-AMP + PPi
Reaktionen kräver energi
Translationen – stegvis
2. Koppling av den aktiverade aminosyran till tRNA.
Aminoacyl-AMP + tRNA aminoacyl-tRNA + AMP
En aminosyra kopplad på 3’-OH på tRNA
Aminoacyl-tRNA
Translationen – stegvis
Totalreaktionen för aktivering och koppling av aminosyra till tRNA:
Aminosyra + ATP + tRNA aminoacyl-tRNA + AMP + PPi
Både aktivering och koppling katalyseras av aminoacyl-tRNA-syntetas
Aminoacyl-tRNA-syntetaser = Enzymer som kopplar aminosyran till rätt tRNA.
Varje aminoacyl-tRNA-syntetas är specifikt för en viss aminosyra.
Translationen – stegvis
Aminosyra
Garanti för specificitet dvs att rätt aminosyra
kopplas på:
Aktiva ytan hos enzymet utformad för att
passa en viss aminosyra.
- Hydrofobt för hydrofoba aminosyror
- Hydrofilt för hydrofila aminosyror
- Steriska hinder för stora aminosyror att passa
in i där små aminosyror skall binda in
Finns ett editerings-site – undersöks ytterligare
en gång att det är rätt aminosyra som kopplats
på. Om fel aminosyra har kopplats på så kan
den tas bort genom hydrolys.
aminoacyl-tRNA-syntetas
Translationen – stegvis
Enzymet måste även välja rätt tRNA.
Vissa känner igen sina tRNA-partners enbart på deras antikodon medan andra även
kräver närvaro av vissa sekvenser nära 5’ och 3’ änden (acceptor stem).
tRNA
aminoacyl-tRNA
syntetas
Cirklarna representerar
nukleotider och storleken på
cirklarna är proportionell till
hur ofta positionen används
av aminoacyl-tRNA syntetas
för att känna igen rätt tRNA
Translationen – stegvis
3. Initiering av polypeptidsyntesen
Syntesriktning N C
mRNA:t läses 5’ 3’
Förklaring till varför aa sekvensen skrivs N→C och
nukleotidsekvensen 5’→3’
OBS! Beskrivning av prokaryot system – mer komplicerat i eukaryoter!
Peptidkedjan börjar alltid med formyl-metionin, fMet:
Metionin har koden AUG vilket alltså också fungerar som START-kod.
Translationen – stegvis
Start-AUG märks ut genom att det finns en purinrik sekvens (A+G) i mRNA:t,
SHINE-DALGARNO-sekvensen, som föregår ett start-AUG och skiljer det från
övriga AUG. Sekvensen finns på 5’-sidan, ca 10 nukleotider från start-AUG.
Shine-Dalgarno sekvens – känns igen och binder till rRNA i ribosomen
Translationen – stegvis
Formation av ett 70S initierings komplex
För detta krävs energi samt flera initieringsfaktorer.
Först bildar den lilla ribosomenheten (30S) ett komplex med
IF1 och IF3. Syftet är att förhindra interaktion med den stora
ribosomenheten (50S) i frånvaro av mRNA.
IF2 (bundet till GTP) bildar ett komplex med fMet-tRNA och
mRNA och binder sedan in till den lilla ribosomenheten
IF1 och IF3 lossnar.
GTP (bunden till IF2) hydrolyseras vilket leder till
konformationsförändringar och association med den stora
ribosomenheten (50S). IF2 dissocierar.
Translationen kan starta….
Translationen – stegvis
Tre bindningssite för tRNA på ribosomen:
A – aminoacylsitet
P – peptidylsitet
E – exit
Shine-Dalgarnosekvensen (A+G) i mRNA basparar
med pyrimidinrik (C+U) sekvens i rRNA och
positionerar på det sättet mRNA:t rätt för
translationsstart. Start-AUG ska exponeras i P-sitet.
Basparning
Shine-Dalgarnosekvensen roll
1. Märka ut start AUG i mRNA
2. Iteragera med rRNA i ribosomen
Translationen – stegvis
4. Polypeptidkedjans förlängning
Stegvis:
En elongeringsfaktor och GTP (energi) krävs för förlängningsreaktionerna.
En tRNA-molekyl som bär den växande polypeptidkedjan (eller i första varvet formylmetionin)
sitter bunden i P-sitet.
En ny tRNA laddad med aminosyra binder in till A-sitet. Nu kollas att kodonet som exponeras i
A-sitet stämmer överens med antikodonet på tRNA:t.
E
P A
Translationen – stegvis
4. Polypeptidkedjans förlängning
Stegvis:
Den växande polypeptidkedjan på tRNA:t som sitter i P-sitet överförs till aminosyran i A-sitet
varvid en ny peptidbindning bildas vid det s k peptidyltransferascentret, som är en del av den
stora ribosomenheten.
E P A
E P A
Translationen – stegvis
4. Polypeptidkedjans förlängning
Stegvis:
Elongeringsfaktorn EF-G med bunden GTP påverkar ribosomen så när GTP hydrolyseras till GDP
ändras formen på EF-G vilket leder till en TRANSLOKERING där tRNA:t med den växande
polypeptidkedjan flyttas från A-sitet till P-sitet och det fria tRNA:t flyttas till E-sitet. Samtidigt
flyttas mRNA:t motsvarande 3 baser så att ett nytt kodon exponeras i A-sitet.
E P A
E P A
E P A
Translationen – stegvis
4. Polypeptidkedjans förlängning
Stegvis:
Det fria tRNA:t lämnar E-sitet för att hämta ny aminosyra i cytosolen.
Nu kan processen börja om och en ny tRNA med aminosyra kan binda in i A-sitet. Detta upprepas
till ett STOPPKODON visas i A-sitet.
E
P
A
E
P
A
Translationen – stegvis
E P A
E P A
E P A
E P A
Translationen – stegvis
Mekanismen för bildande av en ny polypeptidbindning:
Kvävet i aminogruppen på aminosyran bunden till tRNA i A-sitet gör en
nukleofil attack på karbonylkolet hos aminosyran bunden till tRNA i P-sitet.
Ny peptidbindning
Deacylerat tRNA
Translationen – stegvis
5.Terminering:
Speciella ”RELEASE”-faktorer (proteiner) känner igen stoppkoderna UAA, UGA och
UAG och binder till dem.
-
Blockerar för ny aminoacyl-tRNA i A-sitet.
-
Binder en vattenmolekyl och bindningen mellan den C-terminala aminosyran
och tRNA:t hydrolyseras.
Translationen – stegvis
Mekanism hydrolys av polypeptidkedjan från tRNA
Syret i vattenmolekylen gör en nukleofil attack på
karbonylkolet som fäster polypeptidkedjan till tRNA
→ bindningen mellan den C-terminala aminosyran
och tRNA:t bryts
Translationen – stegvis
Hela ribosomkomplexet dissocieras och polypeptidkedjan veckas till sin
tredimensionella form – vilket krävs for proteinet funktion.
Translationen
Viktiga skillnader vid eukaryot translation:
Eukaryota ribosomer är större; 40S + 60S
Den första aminosyran är metionin, inte formylmetionin
Finns ingen Shine-Dalgarnosekvens utan det AUG som är närmast mRNA:ts 5’ände fungerar som start.
Notera; mRNA i prokaryoter kodar för mer än ett protein, i eukaryoter
motsvarar en mRNA-molekyl = ett protein.
Eukaryoter använder flera initieringsfaktorer.
Termineringen sköts av en ”release”-faktor jämfört med två hos prokaryoter.
Translationen
ANGREPPSPUNKTER FÖR ANTIBIOTIKA!!!
-Streptomycin interfererar med inbindning av formylmetionin-laddad tRNA – Var
ett av de första verksamma läkemedlen mot tuberkulos. Resistensutveckling samt
många biverkningar gör att medlet inte längre används i Sverige
-Erytromycin binder till stora ribosomenheten och förhindrar translokering.
Används vid t ex lunginflammation, clamydiainfektioner och kikhosta –
Pneumokocker är resistenta I allt högre grad (>40% I flera länder)
Resistensutveckling – nya strategier?????
Translationen
Vilken aminosyrasekvens motsvarar följande DNA-sekvens?
DNA templat: 5’-GCA GGT TAG CGT GGA ACC-3’
