LÖSNINGSFÖRSLAG TFKI09 & TFKE32 20111214:
1. a) -1
b) Finns flera alternativ men här kommer några förslag: i)Sekvensera båda peptiderna
ii) av aminoyrainnehållet kan vi sluta oss till att de har olika pI. Peptid A lägre pI
än B. Jonbyteskromatografi bör då ge olika elueringsvolym för de två peptiderna.
iii) tillsätt trypsin till peptiderna. Peptid B innehåller en Lys och klyvs av trypsin Cterm om denna aa. Gelfiltrering: peptiderna ger nu två toppar för peptid B. iv)
Peptid A innehåller Trp kan detekteras spektrofotometriskt vid 280 nm.
c) Disulfidbryggor är en kovalent bindning mellan två Cys och påverkas inte av
denatureringsmedel som urea.
2. a) Gly mot Tyr: Gly vanlig i hårnålsöglor. Den minsta aminosyran och den enda som
får plats. Tyr är en stor (aromat) aa och kommer att påverka strukturen. Troligtvis
ett betydligt mindre aktivt protein. Alt. en ytlig Gly som inte ingår i
sekundärstruktur där skulle ett utbyte till Tyr troligen ge endast en måttlig effekt.
Ile mot Leu: Två snarlika aa ger troligen liten påverkan trots att mutationen är i det
inre av proteinet.
b) Gelfiltreringskromatografi, separation efter storlek, störst - först. Kromatogram med
förslagvis A280nm på y-axeln och volym på x-axeln.
c) Kymotrypsin katalyserar klvyning av peptidbindningar C-term om stora opolära
sidokedjor. De tre aa i aktiva ytan är: Asp, His och Ser. His fungerar som
protonrelä (omväxlande bas/syra). Initialt tar His en proton från Ser som då blir en
bra nukleofil. Asp håller His på plats och underlättar His roll som protonacceptor.
Det finns proteolytiska enzymer med två aa i aktiva ytan. De är då His och Cys.
Fungerar utan Asp då Cys lättare deprotoniseras än Ser. Något exempel med endast
en aa i aktiva ytan känner man inte till (än).
3. a) vmax = 400 pmol/(l·min) = 0.4 nmol/(l·min) (y-interceptet = 1/ vmax)
KM = 3.3 µM (x-interceptet = -1/ KM eller riktningskoefficienten, k = KM / vmax)
b) i) A visar kompetitiv inhibering. Inhibitorn tävlar med substratet om att binda till
aktiva ytan. B visar nonkompetitiv inhibering då inhibitorn binder till en reglerande
yta och detta medför förändringar vid aktiva ytan som gör att katalysen inte
fungerar lika bra.
ii)
iii) Hämmaren ska likna substratet för att kunna binda till aktiva ytan.
4. a) i) ATP (adenosintrifosfat och oxidativ fosforylering (andningskedjan)
ii) Elektroner från NADH och FADH2 transporteras i en elektontransportkedja
mellan flera proteinkomplex i mitokondriens innermembran. Då de passerar vissa
komplex (I, III och IV) pumpas protoner från matrix till
mellanmembransutrymmet vilket leder till uppbyggnad av en protongradient.
Denna fungerar som drivkraft till ATP-syntesen för protonerna kan bara passera
tillbaka till matrix via ATP-syntas som katalyserar bildandet av ATP.
iii) ATP innehåller flera negativa laddningar i närheten av varandra så det kostar
mycket energi att hålla samman molekylen. Hydrolyseras molekylen kan den energi
som krävdes för sammanhållningen frisättas och utnyttjas till andra ändamål.
iv) Glykogen och triacylglycerol
b) i) Om [ATP] är låg behöver kroppen energi vilket innebär att glykolysen bör
aktiveras.
ii) Fosfofruktokinas är det viktigaste enzymet för att kontrollera glykolysens
hastighet.
Omvandlingen mellan fruktos-6-fosfat och fruktos-1,6-bisfosfat samt glukos och
glukos-6-fosfat skiljaer sig åt genom att de katalyseras av olika enzymer i
glykolysen respektive glukoneogenesen. Omvandlingen mellan fosfoenolpyruvat
och pyruvat sker i ett steg i glykolysen men i två steg i glukoneogenesen (via
oxaloacetat) och katalyseras då av olika enzymer.
c) Under ett varv i citronsyracykeln frisätts 3 NADH, 1 FADH2 och 1 GTP. Detta
motsvarar 3·2.5 + 1·1.5 + 1 ATP = 10 ATP. 8 acetylCoA kräver 8 varv i
citronsyracykeln vilket alltså motsvarar 80 ATP. Sammanlagt frisätts alltså 80 + 26
ATP = 106 ATP.
5. a) DNA är uppbyggt av nukleotiderna C (cytosintrifosfat), G (guanosintrifosfat), A
(adenosintrifosfat) och T (tymintrifosfat). En kedja hålls samman av
fosfodiesterbindningar som är kovalenta bindningar som förbinder
sockerenheterna i nukleotiderna via en fosfatgrupp. De båda kedjorna i
dubbelhelixen hålls samman av vätebindningar mellan nukleotidernas kvävebaser
(A-T, C-G).
b) i) Processen är replikationen och den katalyseras främst av DNA-polymeraser.
ii) DNA-polymeras I har s k exonukleasfunktion och det innebär att den kan
hydrolysera bort en felaktigt inkorporerad nukleotid. Detta är väsentligt eftersom
fel i DNA ärvs till kommande generationer.
c) i) Om 2’,3’-dideoxyinosin sätts in i en växande nukleinsyra kan den inte fortsätta
byggas på då den saknar 3’-OH. Detta leder till att viruset inte kan föröka sig.
ii) Virusets arvsmassa måste vara enkelsträngat för annars skulle andelen A =
andelen T och andelen C = andelen G då dessa basparar i dubbelhelixen.
d) Eukaryot DNA innehåller både kodande och icke-kodande regioner. I mRNA som
resulterat vid transkriptionen måste de icke-kodande regionerna, intronerna,
klippas bort innan sekvensen översätts till aminosyrasekvens.
e) Translationen sker på ribosomerna och innebär att nukleotidsekvensen i mRNA
översätts till aminosyrasekvens i ett protein. mRNA positioneras rätt för
translationsstart m h a den s k Shine-Dalgarno-sekvensen och den första koden i
prokaryoter är AUG. Den växande polypeptidkedjan sitter bunden till tRNA i Psitet. Ny bastriplett exponeras i A-sitet. tRNA med bunden aminosyra binder in
till A-sitet och kvävegruppen i aminosyran gör en nukleofil attack på
karbonylkolet på den innersta aminosyran som binder till tRNA i P-sitet.
Detta resulterar i att hela den växande polypeptidkedjan flyttas över till tRNA i Asitet. Därefter sker en translokering vilket innebär att den fria tRNA-molekylen i
P-sitet flyttar till E-sitet, tRNA som binder den växande polypeptidkedjan flyttar
från A-sitet till P-sitet och mRNA matas fram motsvarande en bastriplett så en ny
kod exponeras i A-sitet. Detta pågår till ett stoppkodon (UAA, UGA, UAG) visas i
A-sitet. För translationen krävs vissa initierings- och elongeringsfaktorer.
f) Koderna för alanin är GCU, GCC, GCA och GCG. Motsvarande antikoder blir
AGC, GGC, UGC, CGC.
6. a) PCR används för att kopiera DNA och består av tre steg: denaturation, annealing
och extension. De komponenter som behövs är: Primers (forward och reverse),
värmetåligt DNA-polymeras, DNTP mix och DNA.
Se figur 5.7-5.8 Stryer sid 151-152:
b) Forward primer: 5´-atggatggtacaagaacttcacttg-3´
Reverse primer: 5´- ttacttttctgtaagtagatataac-3´
c) På en agarosgel separerar du DNA med avseende på storlek (konformation) och bygger
på att DNA är negativt laddat och vandrar i agarosgelen mot pluspolen. Infärgning sker
med etidiumbromid som binder till DNA och fluorescerar vid belysning med UV-ljus.
Vad man förväntar sig att se på denna agarosgel efter PCR är ett band med hög
intensitet motsvarande storleken på TPMT-genen, ca 700 baser. Man kan förvänta sig
att även se primers med på gelen.
