LÖSNINGSFÖRSLAG 9KEA21, del 1: Biokemi 20111214:
1. a) Minst 4 toppar. Elueringsordning störst - först. Mw 20 000 och 22000
samkromatograferar. Y-axel A280 nm, x-axel volym.
b) Ett av proteinerna består av 2 olika stora subenheter.
c) Då eluering sker vid konstant jonstyrka så lossnar alla proteiner på en gång även om
de har olika pI. Vid gradienteluering eluerar det protein med minst laddning först
och sedan övriga i tur och ordning beroende på grad av laddning ( pI).
d) i) Kymotrypsin katalyserar klvyning av peptidbindningar C-terminalt om stora
opolära sidokedjor. De tre aminosyrorna i aktiva ytan är: Asp, His och Ser. His
fungerar som protonrelä (omväxlande bas/syra). Initialt tar His en proton från Ser
som då blir en bra nukleofil. Asp håller His på plats och underlättar His roll som
protonacceptor. Efter klyvning av peptidbindninen donerar His en proton till
aminogruppen. Under enzymregenereringsstegen av katalysen fungerar His i tur
och ordning som proton-acceptor och sedan donator.
I aktiva ytan behövs en bra nukleofil och möjlighet till protonväxling. En bra
nuklefil ska vara en bas, t.ex. en Cys. Det finns proteolytiska enzymer med två
aktiva aminosyror i aktiva ytan. De är då His och Cys. Fungerar utan Asp då Cys
lättare deprotoniseras än Ser (Cys dock något sämre som nuklefil då S är större än
O). Något exempel med endast en aktiv aminosyra i aktiva ytan känner man inte till
(än).
2. a) vmax = 400 pmol/(l·min) = 0.4 nmol/(l·min) (y-interceptet = 1/ vmax)
KM = 3.3 µM (x-interceptet = -1/ KM eller riktningskoefficienten, k = KM / vmax)
b) i) A visar kompetitiv inhibering. Inhibitorn tävlar med substratet om att binda till
aktiva ytan. B visar nonkompetitiv inhibering då inhibitorn binder till en reglerande
yta och detta medför förändringar vid aktiva ytan som gör att katalysen inte
fungerar lika bra.
ii)
iii) Hämmaren ska likna substratet för att kunna binda till aktiva ytan.
3. a) DNA är uppbyggt av nukleotiderna C (cytosintrifosfat), G (guanosintrifosfat), A
(adenosintrifosfat) och T (tymintrifosfat). En kedja hålls samman av
fosfodiesterbindningar som är kovalenta bindningar som förbinder
sockerenheterna i nukleotiderna via en fosfatgrupp. De båda kedjorna i
dubbelhelixen hålls samman av vätebindningar mellan nukleotidernas kvävebaser
(A-T, C-G).
b) i) Processen är replikationen och den katalyseras främst av DNA-polymeraser.
ii) DNA-polymeras I har s k exonukleasfunktion och det innebär att den kan
hydrolysera bort en felaktigt inkorporerad nukleotid. Detta är väsentligt eftersom
fel i DNA ärvs till kommande generationer.
c) i) Om 2’,3’-dideoxyinosin sätts in i en växande nukleinsyra kan den inte fortsätta
byggas på då den saknar 3’-OH. Detta leder till att viruset inte kan föröka sig.
ii) Virusets arvsmassa måste vara enkelsträngat för annars skulle andelen A =
andelen T och andelen C = andelen G då dessa basparar i dubbelhelixen.
d) i) mRNA (messenger RNA)
ii) mRNA fungerar som mall vid translationen.
iii) rRNA (ribosomalt RNA), tRNA (transfer RNA), snRNA (små nukleära RNA)
iv) rRNA bygger tillsammans med proteiner upp ribosomerna där proteinsyntesen
sker. tRNA fungerar som en adaptormolekyler som i ena änden interagerar med
mRNA och i den andra änden håller en aminosyra, d v s tRNA har en nyckelroll i
att översätta nukleotidsekvens till aminosyrasekvens.
snRNA är involverade vid splicing.
4. a) Eukaryot DNA innehåller både kodande och icke-kodande regioner. I mRNA som
resulterat vid transkriptionen måste de icke-kodande regionerna, intronerna,
klippas bort innan sekvensen översätts till aminosyrasekvens.
b) Translationen sker på ribosomerna och innebär att nukleotidsekvensen i mRNA
översätts till aminosyrasekvens i ett protein. mRNA positioneras rätt för
translationsstart m h a den s k Shine-Dalgarno-sekvensen och den första koden i
prokaryoter är AUG. Den växande polypeptidkedjan sitter bunden till tRNA i Psitet. Ny bastriplett exponeras i A-sitet. tRNA med bunden aminosyra binder in
till A-sitet och kvävegruppen i aminosyran gör en nukleofil attack på
karbonylkolet på den innersta aminosyran som binder till tRNA i P-sitet.
Detta resulterar i att hela den växande polypeptidkedjan flyttas över till tRNA i Asitet. Därefter sker en translokering vilket innebär att den fria tRNA-molekylen i
P-sitet flyttar till E-sitet, tRNA som binder den växande polypeptidkedjan flyttar
från A-sitet till P-sitet och mRNA matas fram motsvarande en bastriplett så en ny
kod exponeras i A-sitet. Detta pågår till ett stoppkodon (UAA, UGA, UAG) visas i
A-sitet. För translationen krävs vissa initierings- och elongeringsfaktorer.
c) Shine-Dalgarnosekvensen ser till att mRNA positioneras rätt i förhållande till Aoch P-sitet genom basparning mellan sekvensen som finns i mRNA och den
komplementära sekvensen som finns i rRNA.
d) Koderna för alanin är GCU, GCC, GCA och GCG. Motsvarande antikoder blir
AGC, GGC, UGC, CGC.
5. a) PCR används för att kopiera DNA och består av tre steg: denaturation, annealing
och extension. De komponenter som behövs är: Primers (forward och reverse),
värmetåligt DNA-polymeras, DNTP mix och DNA.
Se figur 5.7-5.8 Stryer sid 151-152:
b) Forward primer: 5´-atggatggtacaagaacttcacttg-3´
Reverse primer: 5´- ttacttttctgtaagtagatataac-3´
c) På en agarosgel separerar du DNA med avseende på storlek (konformation) och bygger
på att DNA är negativt laddat och vandrar i agarosgelen mot pluspolen. Infärgning sker
med etidiumbromid som binder till DNA och fluorescerar vid belysning med UV-ljus.
Vad man förväntar sig att se på denna agarosgel efter PCR är ett band med hög
intensitet motsvarande storleken på TPMT-genen, ca 700 baser. Man kan förvänta sig
att även se primers med på gelen.
d) En expressionsplasmid karakteriseras förutom av antibiotikaresistens även av att det i
anslutning till den inklonade genen finns promotersite, ribosombindande site och
termineringssignal.
