nukleinsyrornas uppbyggnad

NUKLEINSYRORNAS UPPBYGGNAD:
Två olika nukleinsyror:
 DNA deoxyribonukleinsyra
 RNA ribonukleinsyra
Monomererna som bygger upp nukleinsyrorna kallas NUKLEOTIDER.
En nukleotid består av tre delar:
 en kvävebas
 en sockerenhet
 en fosfatgrupp
I DNA är sockret deoxyribos och i RNA
ribos:
I respektive nukleinsyra är det nukleotidernas
ordning som står för den genetiska informationen som så småningom kan översättas till
aminosyrasekvens.
Det finns fem olika kvävebaser som delas in i
två grupper efter deras struktur:
I DNA finns: C T A G
I RNA finns: C U A G
Sockret och kvävebasen kopplas samman via
en N-glykosidbindning – en nukleosid bildas:
När en fosfatgrupp förestrats till C5 erhålls
en nukleotid.
Nukleinsyror bildas när nukleotider kopplas
samman. Två nukleotider förbinds via
fosfatgruppen i en FOSFODIESTERBINDNING. Det är C3 i ett socker som
förbinds med C5 i nästa.
En DNA- eller RNA-sekvens skrivs ALLTID
5’ 3’ så att inte missförstånd ska uppstå
(precis som proteinsekvensen alltid skrivs N
 C).
DNA är dubbelsträngat medan RNA är
enkelsträngat.
I DNA-helixen basparar
 adenin (A) med tymin (T)
 cytosin (C) med guanin (G)
Notera;
 En DNA-helix består av två antiparallella
nukleotidkedjor, den ena löper 5’ 3’
och basparar med en annan kedja som går
3’ 5’.
 Fosfatgrupperna och sockerenheterna
sitter på utsidan och kvävebaserna inåt.
 En purin basparar alltid med en pyrimidin
så helixens diameter blir hela tiden lika
stor.
 Ett AT-baspar hålls samman av två
vätebindningar och ett GC-baspar av tre.
DNA-strukturen publicerades av Watson &
Crick 1953.
Dubbelhelixens geometri:
 Högervriden helix
 Eftersom en större pyrimidinbas alltid basparar
med en mindre purinbas är innerdiametern på
helixen hela tiden 11Å (1Å = 1·10-10 m) och
ytterdiametern 20Å.
 Ett varv i dubbelhelixen är 34Å och innehåller 10
baspar.
 På ett varv finns en ”MAJOR GROOVE” och
en ”MINOR GROOVE”. I dessa fördjupningar
kan proteiner fästa.
 Utsidan av helixen är negativt laddad
(fosfatgrupper) vilket gör att positivt laddade
joner (katjoner) som Na+ och Mg2+ associeras till
DNA:t in vitro. In vivo är DNA:t i cellkärnan
uppvirat på positivt laddade proteiner, s k histoner,
vilket ger effektiv tätpackning.
 Prokaryot DNA är cirkulärt medan eukaryot DNA
är linjärt.
Olika strukturvarianter av DNA:
Bilder Stryer 4.14 och 4.16
- A-DNA
- B-DNA
- Z-DNA
Cellulärt DNA: Vanligen B-DNA
A-DNA: Kortare och bredare högervriden helix där
basparen inte är vinkelräta mot helixaxeln.
Ribosenheten har en annan konformation än i
B-DNA. Hybridhelixar DNA-RNA som
temporärt bildas har en struktur som
påminner om A-DNA.
Z-DNA: Vänstervriden helix. Uppkommer vid
sekvenser med varannan purin och varannan
pyrimidin som CGCGCG. Man har funnit
proteiner som känner igen just sådana här
sekvenser genom deras speciella struktur.
Denaturering av DNA:
Eftersom dubbelhelixen bara hålls samman av
nonkovalenta bindningar (vätebindningar)
räcker det att värma ett DNA-prov för att de två
kedjorna ska separera.
När DNA-kedjorna separeras säger man att
DNA:t denatureras eller smälter. Vilken
temperatur som krävs beror på andelen GCbaspar relativt AT-baspar. Om temperaturen
sänks återbildas dubbelhelixen spontant.
Man kan följa denatureringen spektrofotometriskt vid 260 nm. Denaturerat DNA
absorberar mer ljus än den nativa formen
eftersom kvävebaserna som svarar för
absorptionen exponeras i denaturerat DNA.
Även enkelsträngat RNA bildar väldefinierade tredimensionella strukturer som
stabiliseras av vätebindningar.
Vätebindningarna binder ihop olika delar av
en och samma RNA-kedja.
Ett vanligt motiv är s k hårnålsloopar:
Molekylärbiologins centrala dogma:
Replikation: Bassekvensen i DNA står för den
genetiska informationen. När en cell ska delas
måste DNA:t dupliceras – man måste få nytt
DNA med exakt samma bassekvens som
originalet.
Vid proteinsyntes överförs informationen från
DNA till aminosyrasekvens i två steg:
Transkription: Bassekvensen i DNA översätts
till bassekvens i mRNA. mRNA fungerar sedan
som mall för proteinsyntesen.
Translation: Bassekvens i mRNA översätts till
aminosyrasekvens m h a tRNA. Processen sker
på ribosomerna. En sekvens av tre baser utgör
den GENETISKA KODEN och specificerar en
viss aminosyra.
REPLIKATIONEN:
Först måste de två DNA-kedjorna separeras
och sedan ska två nya kedjor bildas med
originalen som mallar:
Eftersom det i varje ny DNA-molekyl
kommer att finnas en ny och en gammal
DNA-kedja säger man att DNA-replikationen
är SEMIKONSERVATIV.
(DNA)n + dNTP  (DNA)n+1 + PPi
Reaktionen katalyseras av DNA-polymeraser.
dNTP = dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Reaktionsmekanism för bildande av en ny
fosfodiesterbindning:
Hydroxylgruppen på C3 i ett socker gör en
nukleofil attack på den innersta fosforatomen i nästa trifosfatnukleotid. Fosfaten är
kopplad till C5 i nästa socker, alltså 3’,5’fosfodiesterbindning.
Notera;
 Ny nukleotid binder alltså först till
mallkedjan genom basparning och sedan
sätts den nya kedjan ihop kovalent.
 Energikrävande process
DNA-polymeraser kräver en primer för att
kunna starta syntes av en ny kedja. Primern
utgörs av en kort RNA-sekvens och det
viktigaste strukturmotivet är en fri 3’-OHgrupp:
Finns flera olika DNA-polymeraser men de
viktigaste är:
DNA-polymeras III: Främst ansvarig för
polymerisationen av den nya kedjan.
DNA-polymeras I: Kontrollerar att rätt
nukleotid satts in. DNA-polymeras I har
EXONUKLEAS-aktivitet vilket innebär att om
ett fel upptäcks kan polymeraset klippa bort det
och sätta in rätt nukleotid istället.
Mycket viktigt eftersom fel vid replikationen kan få stora konsekvenser!
Problem:
DNA-polymeras katalyserar bildande av ny
DNA-kedja 5’ 3’ och rör sig längs den
gamla kedjan 3’ 5’. Men en av kedjorna i
helixen exponeras ju 5’ 3’….
Lösning: Den ena kedjan syntetiseras
diskontinuerligt i s k Okazakifragment.
För varje Okazakifragment krävs en primer och
för att sedan koppla ihop fragmenten krävs
ytterligare ett enzym, DNA-ligas.
Andra proteiner som är viktiga vid
replikationen:
Topoisomeras och helikas: Öppnar upp
dubbelhelixen.
”Single strand binding proteins”: Binder till
enkelsträngat DNA som temporärt bildas och
skyddar det från nukleaser som annars attackerar enkelsträngat DNA och bryter ner det.
Primas: Katalyserar bildandet av RNA-primers
som behövs för att DNA-polymeraset ska
kunna syntetisera ny kedja.
Ligas: Kopplar ihop fragment kovalent.
Ibland blir det dock fel vid replikationen:
PUNKTMUTATIONER
Tre typer:
SUBSTITUTION:
en kvävebas byts ut
mot en annan
DELETION:
en bas tas bort
INSERTION:
en bas sätts till
De två sista är allvarligast eftersom de
förskjuter hela läsramen.
Substitution är vanligast och finns i två
varianter: *TRANSITION
purin  purin
pyrimidin  pyrimidin
*TRANSVERSION
purin  pyrimidin
pyrimidin  purin
Felfrekvens: 1/1010 nukleotider
Kemiska mutagener:
 Ämnen som liknar de normala baserna
och därför kan inkorporeras i deras ställe.
Ex. 5-bromouracil.
 Ämnen som modifierar befintliga baser
vilket leder till mutationer vid nästa
replikation. Ex. HNO2.
 Ämnen som interkalerar, binder in mellan
baserna, i DNA-strukturen och kan
uppfattas som en bas vid nästa replikation.
Ex. etidiumbromid.
UV-ljus:
UV-ljus kan leda till ihopkoppling av
närliggande tyminer.
Skydd:
Reparationsmaskineri i tre steg:
 Felet upptäcks och felaktig bas tas bort –
olika enzymer för olika fel.
 Ny korrekt bas sätts in av DNApolymeras I.
 Kedjan kopplas ihop av DNA-ligas.
Flera cancersjukdomar orsakas av defekt
DNA-reparationsmaskineri:
Exempel:
I sjukdomen Xeroderma pigmentosum
saknas enzymet som tar bort tymindimererna som bildas vid exponering för
UV-ljus. Patienterna får hudcancer och dör
ofta innan de fyllt 30 år.
TRANSKRIPTION OCH TRANSLATION
= Översättning av bassekvensen till
aminosyrasekvens
OBS!
I grova drag för prokaryota system - mycket
mer komplicerat i eukaryota system!
RNA:
Tre huvudtyper:
 tRNA
transfer RNA
 rRNA
ribosomalt RNA
 mRNA
messenger RNA
Alla tre är involverade vid proteinsyntesen:
DNA 
mRNA  Protein
Transkription Translation
rRNA
tRNA
I eukaryoter har man även funnit ytterligare en variant,
snRNA (small nuclear): Involverade vid ’splicing’.
Funktioner hos RNA:
rRNA: Bygger tillsammans med proteiner
upp RIBOSOMER. På ribosomerna
sker proteinsyntesen.
tRNA: Transporterar aminosyror från
cytosolen till ribosomen. Ser till att
rätt aminosyra hamnar på rätt plats i
den växande polypeptidkedjan.
mRNA: Utgör mall för proteinsyntesen.
mRNA bildas genom avskrivning av
DNA-sekvensen.
Strukturen hos RNA:
tRNA: Minsta typen av RNA, ca 80
nukleotider. Intramolekylära vätebindningar
gör att tRNA-molekylen blir klöverformad
(2D).
o Aminosyran som hämtas i cytosolen och
transporteras till ribosomen binds till 3’änden av tRNA-molekylen.
o I antikodon-loopen finns tre kvävebaser
som basparar med mRNA och svarar för att
aminosyrorna kommer i rätt ordning i
proteinet.
o Innehåller flera ovanliga, modifierade baser.
Tredimensionellt viker sig sedan tRNA så den
blir L-formad.
I den tredimensionella formen hamnar
bindningsstället för aminosyran så långt som
möjligt ifrån antikodonet.
Olika tRNA-molekyler binder olika aminosyror –
aminosyran måste ”stämma” med antikodonet.
rRNA: Stora molekyler som tillsammans med
proteiner bygger upp ribosomer (1/3 av massan är
RNA, 2/3 proteiner). Ribosomerna består av en
mindre och en större subenhet (30S och 50S).
mRNA: Bassekvensen i mRNA specificerar
aminosyrasekvensen i ett protein.
mRNA bildas när protein ska syntetiseras och
bryts sedan snabbt ner för att nukleotiderna
ska kunna återanvändas och för att cellen ska
kunna kontrollera när ett visst protein
syntetiseras.
Bassekvensen i mRNA erhålls genom transkription (avskrivning) av bassekvensen i DNA.
TRANSKRIPTIONEN:
Transkriptionen katalyseras av RNApolymeras II, ett enzym som kopplar samman
ribosnukleotider i riktning 5’ 3’.
E.coli-enzymet består av fyra olika
subenheter: 2’
-enhetens funktion är att hitta startstället,
sedan dissocierar den och 2’ katalyserar
själva polymerisationen.
Mekanismen liknar DNA-polymerasets
mekanism:
 Syntetiserar ny kedja 5’ 3’.
 3’-OH gör nukleofil attack på innersta
fosfaten i trifosfatnukleotiden varvid
pyrofosfat lämnar.
 Tar instruktioner från en DNA-mall.
Skillnader i funktion mellan DNA- resp.
RNA-polymeras:
 RNA-polymeraset behöver ingen primer.
 RNA-polymeraset saknar exonukleasaktivitet.
Gör inte lika mycket om det blir fel!!!
Transkriptionen startar vid s k promoterregioner. Dessa regioner är AT-rika:
 -35-regionen
 Pribnow-boxen (TATA-boxen)
För att RNA-polymeraset ska hitta rätt
startställe krävs ett antal transkriptionsfaktorer; TFIIA, B, D, E, F, H.
Bild 29.25 Stryer
1. TFIID binder till TATA-boxen via en av
sina subenheter, TBP (’TATA-box
binding protein’). Detta leder till
konformationsförändringar.
2. TFIIA och TFIIB binder in till TBP:s yta.
3. Efter att TFIIB bundit byggs komplexet
på med TFIIF, E och H och RNA-polymeras II varvid transkriptionen startar.
Specifika funktioner:
o TFIID hjälper polymeraset att finna
promotorn.
o TFIIF fungerar som ett helikas.
Transkriptionen fortgår till en termineringssignal nås.
Terminering:
När en viss sekvens skrivits av viks RNA:t
till en hårnålsloop som följs av flera U.
TRANSKRIPTIONSBUBBLA: DNA-helixen öppnas
och stängs med samma hastighet så hela tiden är ca 17
baser oparade.
Ihopvikningen baseras på basparning. RNApolymeraset känner av veckningen och
aktiviteten avstannar.
När det gäller vissa gener krävs dock ytterligare en faktor för att avsluta transkriptionen, ett protein som kallas rho.
Rho känner igen ytterligare sekvenser i det
nysyntetiserade transkriptet, binder till RNA:t
och detta i sin tur leder till att RNA-polymeraset lossnar.
Notera;
I båda fallen ovan så är det signaler i det
nysyntetiserade RNA:t som känns igen och
inte signaler i DNA:t!
I prokaryoter translateras mRNA innan hela
genen transkriberats medan det i eukaryoter
bildas ett primärt transkript som processas
innan färdigt mRNA lämnar kärnan för
transport till ribosomerna i cytosolen.
Bild 29.21 Stryer
’SPLICING’:
De primära transkripten i eukaryoter består
av EXONER och INTRONER.
o Exoner: Kodande genmaterial
o Introner: Icke-kodande genmaterial
Processen då introner avlägsnas och exoner
sammanfogas kallas ’splicing’.
Varför introner? Experimentverkstad för evolution?
Mekanism:
En intron startar alltid med GU och slutar
med AG. De har också alltid en intern
förgreningssite med ett A.
Bild 29.34 Stryer
Stegvis: Bild 29.35 Stryer
1. 2’-hydroxylgruppen på A i förgreningssitet gör en nukleofil attack på
fosforn i fosfodiesterbindningen som
förbinder exon 1 och intronen.
Bindningen bryts.
2. 3’-hydroxylgruppen på exon 1
attackerar fosfodiesterbindningen
mellan intronen och exon 2 varvid en
ny fosfodiesterbindning bildas mellan
exon 1 och exon 2.
Katalyseras av ett komplex, SPLICEOSOMEN, som består av proteiner och snRNA.
OBS! Även RNA kan ha katalyserande roll!
Alternativ splicing:
Viktigt för ett begränsat genmaterial kan ge
upphov till många olika proteiner.
Typexempel: Antikroppsproduktion
Notera; En stor andel av alla genetiska
sjukdomar orsakas av mutationer
som påverkar var gener ’splicas’.
TRANSLATIONEN:
Bassekvensen i mRNA överförs till aminosyrasekvens.
mRNA-sekvensen kan översättas till aminosyrasekvens via den s k GENETISKA
KODEN.
Varje aminosyra motsvaras av en eller flera
bastripletter. De tre baserna kallas med ett
ord för ett kodon.
4 baser kan kombineras och ge 43=64 olika
tripletter.
61 av dessa kodar för aminosyror medan 3
koder är STOPP-koder: UAG, UGA, UAA.
20 aminosyror – 61 koder: Flera aminosyror
har flera koder  genetiska koden är
degenererad.
Uppgifter:
Ange vad följande kodoner motsvarar för aminosyror:
 AAG
 CCU
 GAG
Ange alla koder för:
 asparagin
 serin
Notera; - De olika koderna för en aminosyra
liknar varandra vilket minskar risken
för allvarliga effekter av mutationer.
- Antalet koder är korrelerat till hur
vanlig respektive aminosyra är i
proteiner.
Varför är genetiska koden degenererad?
Om alla aminosyror bara hade en kod:
20 kodon
44 stoppsignaler
Risken är mycket hög att ett protein blir
inaktivt om translationen avbryts för tidigt.
Ett protein med en utbytt aminosyra har
oftast viss aktivitet om det inte är någon av
de katalytiska aminosyrorna som ersatts.
Genetiska koden är nästan universell:
Vissa variationer har dock upptäckts i
mitokondrie-DNA. Mitokondrierna har
bakteriellt ursprung men upptogs av en
eukaryot värd mycket tidigt i evolutionen.
Kodon – antikodon:
tRNA interagerar antiparallellt med mRNA:
Uppgifter:
1. Kodon: GCA
Antikodon?
2. Ange antikoden för en tRNA som bär
metionin.
Translationen stegvis:
1. Aktivering av aminosyran – koppling till
tRNA via aminoacyl-tRNA-syntetas. Energi
krävs.
Aminoacyl-tRNA-syntetaser = Enzymer som
kopplar aminosyran till rätt tRNA.
Aminosyra + ATP  aminoacyl-AMP + 2 Pi
Aminoacyl-AMP + tRNA  aminoacyl-tRNA + AMP
Varje aminoacyl-tRNA-syntetas är specifikt
för en viss aminosyra.
Garanti för specificitet;
o Aktiva ytan utformad för att passa en viss
aminosyra.
o Finns ett editeringssite – undersöks
ytterligare en gång att det är rätt
aminosyra som kopplats på.
Enzymet måste även välja rätt tRNA.
Vissa känner igen sina tRNA-partners
enbart på deras antikodon medan andra
även kräver närvaro av vissa sekvenser
nära vinkeln i ”L-et”.
2. Initiering av polypeptidsyntesen
Syntesriktning N  C
mRNA:t läses 5’  3’
OBS! Beskrivning av prokaryot system – mer komplicerat i eukaryoter!
Peptidkedjan börjar alltid med formylmetionin, fMet:
Metionin har koden AUG vilket alltså också
fungerar som START-kod.
Start-AUG märks ut genom att det finns en
purinrik sekvens (A+G) i mRNA:t, SHINEDALGARNO-sekvensen, som föregår ett startAUG och skiljer det från övriga AUG.
Sekvensen finns på 5’-sidan, ca 10 nukleotider
från start-AUG.
När fMet bundit till mRNA binder
komplexet till den mindre ribosomsubenheten som då associeras med den
större.
För detta krävs energi samt flera
initieringsfaktorer. Bild 30.20 Stryer
1. I vilande läge bildar den lilla ribosomenheten ett komplex med IF1 och IF3.
Syftet är att förhindra interaktion med den
stora ribosomenheten i frånvaro av mRNA.
2. IF2 bildar ett komplex med formylmetioninladdad tRNA och mRNA och binder
sedan in till den lilla ribosomenheten
varvid IF1 och IF3 lossnar.
3. GTP bunden till IF2 hydrolyseras vilket
leder till konformationsförändringar och
association med den stora ribosomenheten.
IF2 dissocierar. Translationen kan starta….
Shine-Dalgarnosekvensen (A+G) basparar
med pyrimidinrik (C+U) sekvens i rRNA
och positionerar på det sättet mRNA:t rätt
för translationsstart. Start-AUG ska
exponeras i P-sitet.
Tre bindningssite för tRNA på ribosomen:
A – aminoacylsitet
P – peptidylsitet
E – exit
3. Polypeptidkedjans förlängning
Stegvis: Bild 30.23 Stryer
En elongeringsfaktor och GTP (energi) krävs
för förlängningsreaktionerna.
1. En tRNA-molekyl som bär den växande
polypeptidkedjan (eller i första varvet
formylmetionin) sitter bunden i P-sitet.
2. En ny tRNA laddad med aminosyra
binder in till A-sitet. Nu kollas att
kodonet som exponeras i A-sitet
stämmer överens med antikodonet på
tRNA:t.
3. Den växande polypeptidkedjan på
tRNA:t som sitter i P-sitet överförs till
aminosyran i A-sitet varvid en ny peptidbindning bildas vid det s k peptidyltransferascentret, som är en del av den
stora ribosomenheten.
4. Elongeringsfaktorn EF-G med bunden
GTP påverkar ribosomen så när GTP
hydrolyseras till GDP ändras formen på
EF-G vilket leder till en TRANSLOKERING.
tRNA:t med den växande polypeptidkedjan flyttas från A-sitet till P-sitet och
det fria tRNA:t flyttas till E-sitet.
Samtidigt flyttas mRNA:t framåt motsvarande 3 baser så att ett nytt kodon
exponeras i A-sitet.
5. Det fria tRNA:t lämnar E-sitet för att
hämta ny aminosyra i cytosolen.
Nu kan processen börja om och en ny tRNA
med aminosyra binda in i A-sitet. Detta upprepas till ett STOPPKODON visas i A-sitet.
Mekanismen för bildande av en ny
polypeptidbindning:
Bild 30.22 Stryer
Kvävet i aminogruppen på aminosyran
bunden till tRNA i A-sitet gör en nukleofil
attack på karbonylkolet hos aminosyran
bunden till tRNA i P-sitet.
4. Terminering:
Speciella ”RELEASE”-faktorer känner
igen stoppkoderna UAA, UGA och UAG
och binder till dem.
- Blockerar för ny aminoacyl-tRNA i Asitet.
- Binder en vattenmolekyl och när syret i
vattenmolekylen gör en nukleofil attack
på karbonylkolet som fäster polypeptidkedjan till tRNA så bryts bindningen
mellan den C-terminala aminosyran och
tRNA:t.
Hela ribosomkomplexet dissocieras och
polypeptidkedjan veckas till sin tredimensionella form.
Viktiga skillnader vid eukaryot translation:
o Eukaryota ribosomer är större; 40S + 60S
o Den första aminosyran är metionin, inte
formylmetionin. Dock finns speciell
tRNA som binder den första metioninen.
o Finns ingen Shine-Dalgarno-sekvens utan
det AUG som är närmast mRNA:ts 5’ände fungerar som start.
Notera;
mRNA i prokaryoter kodar för
mer än ett protein, i eukaryoter motsvarar en mRNAmolekyl = ett protein.
o Eukaryoter använder flera initieringsfaktorer.
o Termineringen sköts av en ”release”faktor jämfört med två hos prokaryoter.
ANGREPPSPUNKTER FÖR ANTIBIOTIKA!!!
-Streptomycin interfererar med inbindning av
formylmetionin-laddad tRNA
-Erytromycin binder till stora ribosomenheten och
förhindrar translokering
Resistensutveckling – nya strategier?????