Biologiska metoder, toxicitet, endokrina effekter, mm Bengt-Erik Bengtsson Varför biologiska tester? Enda sättet att mäta kombinationseffekter av kända och okända ämnen i komplexa blandningar. EOCl i muskel av abborre Biologiska Effekter Ökande: Standardiserade enartstester Modellekosystem eller mesocosmer relevans svårigheter kostnader Studier i recipienten (Fältstudier) Viktigt för biologiska tester: Arter: • Ekologiskt relevant • Lättodlad på lab. • Tillgänglig året om • Känd biologi • Lämplig storlek Effektvariabler: • Ekologiskt betydelsefull • Kostnadseffektiv • Standardiserad • Vetenskapligt sund • Selektiv • Hög känslighet 5.4.1.1 Bioluminiscerande bakterier; Vibrio fischeri Reducerad ljusalstring (EC50) efter 5 och 15 minuter (Ex.: Microtox, Lumistox) 5.4.1 Korttidstester Av tradition är en kombination av mikroalger, vattenloppor och fisk de mest använda korttidstesterna (72-tim, resp. 48-tim EC50 samt 96-tim LC50) Simulerad näringskedja Traditionell: Alternativ: Rödalgen Ceramium Nitocra spinipes Sebrafisk Rödalgen Ceramium, Rödsläke Bengt‐Erik Bengtsson@itm Andmat; Lemna minor Start: Dag 1 Slut: Dag 7 Endpoint: Tillväxt (7-d EC50) 5.4.1.5 Akut toxicitet för kräftdjur Daphnia 48-h EC50 Nitocra 48 el. 96-h LC50 Bengtsson ITM, Stockholm University 5.4.1.5 Avläsning av akut toxicitet hos Nitocra spinipes 5.4.1.6 Akut toxicitet för fisk Sebrafisk (Danio rerio) 5.4.1.6 Försöksdjursetiska aspekter ”De 3 R:n” (Syfte:minska lidandet för försöksdjur) •Reduction •Replacement •Refinement 5.4.1.6 Fiskembryotester (FET) Avläsning av fiskembryoutveckling efter 48 tim. som alternativ till akutester med vuxen fisk. 5.4.2 Subkronisk och kronisk toxicitet Varför copepoder? • Representerar viktiga ekologiska nischer - t ex bottenlevande omsättare av näringsämnen och viktiga bytesdjur för större arter • Marina arter används i standardiserade • tester • Relativt kort livscykel (2-8 veckor) • Sexuell fortplantning (till skillnad från Daphnia) endpoints kan omfatta t ex utveckling och reproduktion Options: Experimental overview for Copepods Acute toxicity Subchronic exposure Partial life cycle test Chronic exposure Life cycle Long term exposure Population dynamics Juvenile development Reproduction Genetic diversity AFLP Individual Growth Rate RNA Hormone levels Body length RNA Offspring production 5.4.2.1 Livscykeltest för Nitocra (LDR) 5.4.2.1 Avläsning av långtidstester med Nitocra spinipes NOEC 70 LOEC 60 * 50 40 50 *** *** 40 30 30 20 20 *** 10 10 0 0 Control 0.003 0.01 0.03 0.1 0.3 (mg/l) Musk ketone (mg/l) NOEC LOEC Fig 1. Larvutvecklingskvot,LDR (svarta staplar), som procent copepoditer hos Nitocra spinipes av totalt antal ungar och larvdödlighet (randiga staplar) efter 8 dagars exponering för 0.003-0.3 mg/l musk ketone (MK) vid 20 1C. Felstaplar indikerar 95 % konfidensintervall för medelvärden. Asterisker visar signifikant avvikelse från kontrollen(*p<0.05, ***p<0.001). 5.8 Recipientundersökningar Hornsimpa som föroreningsindikator Ryggradskrökningar 1980`s Gädda, intressant bifångst… Missbildade gäddor från Norrsundetrecipienten Rapport 3498 år 1988 och 3558 (English version) år 1989 Fiskhälsa i recipienter 5.8 Abborren – en väl beprövad föroreningsindikator 5.8 Fenskador hos abborre Leverstorlek Plasmaklorid EROD-aktivitet Askorbinsyra Röda blodkroppar Lymphocyter Gonadstorlek, GSI Fiskhälsa i Norrsundetrecipienten 1983-1995 Gonad size --- -- 0 - 0 Liver size ++ + 0 0 0 ++ ++ + ++ + + 0 +++ + 0 0 0 ++ + 0 0 0 1983 1988 1990 1993 1995 EROD activity ++++ ++ Red blood cells (volume) + + + Fin erosion Skeleton deformities + = above normal values 0 = normal values - = below normal values 5.5.1 Endokrina effekter i fisk Hormon = intercellulär signalsubstans • Utsöndras från speciella körtlar, • Transporteras till olika kroppsorgan, • Ger effekt i speciella organ/vävnader via bindning till receptorer, • Effektiva i mycket låga koncentrationer (”signal”-effekt) Det endokrina systemet Signal Hormon Körtel/organ Transportmedium, t ex blod Receptor Effekt Vävnad/organ 5.5.1 ”Hormonstörande ämne” Definition: Substans eller blandning som försämrar hälsan i en intakt organism eller dess avkomma genom att störa det endokrina systemet 1985:USA Effekt av avlopp från massaindustri på Mosquitofish Gambusia holbrooki Gonopodium (Howell et al. 1980; Denton et al. 1985) Storspigg Ett kommande alternativ till sebrafisk med högre relevans för vår bräckta och marina miljö 5.5.1.2 Experimentuppställning för att studera hormonella störningar hos fisk 5.5.1.1 Markörer för endokrina effekter i transgena jästceller – YAS (androgen) – YES (östrogen) 5.5.1.2 Markörer för endokrina effekter i fisk – Intersex/könsbyte – Spiggin (androgen) – Vitellogenin (oestrogen) – Könskvot hos avkomma Gonad-histologi: Normal testikel Gonad-histologi: Normalt ovarium Gonad-histologi: Intersex Tånglake har använts för att påvisa androgena effekter i anslutning till Mönsterås bruk Sexuell utveckling hos Vitmärla, Monoporeia affinis Hanar Honor Missbildning av ägg och embryon hos vitmärla ExposMeter, passiv provtagare för lipofila ämnen ExposMeter efter 35 dagar i sjövatten