David Månsson Nya strategier för att angripa Alzheimers sjukdom Den tyska psykiatern Alois Alzheimer upptäckte Alzheimers sjukdom för mer än 100 år sedan. Sjukdomen är idag den vanligaste formen av demens och drabbar människor i västvärlden lavinartat. Alzheimers sjukdom behandlas med läkemedel som ökar nivåerna av transmittorsubstansen acetylkolin i hjärnan, vilka endast ger tillfällig symtomförbättring och det går inte att bota sjukdomen. Forskare har under lång tid försökt att förstå de bakomvarande mekanismerna för Alzheimers sjukdom och de har sett att nervceller dör i en snabbare takt jämfört med normalt, i hjärnområden som är viktiga för minnesfunktioner. På senare år har denna nervcellsdöd kopplats till ansamling av felveckade protein utanför cellerna som stör nervsignaleringen och hjärnfunktionerna. En ny strategi för att behandla denna sjukdom är att angripa bildandet utav dessa proteinansamlingar genom att stänga av inblandade enzym med olika läkemedel. Möss som blivit behandlade med enzymblockerande läkemedel var efter undersökning helt friska och hade inga synliga proteinansamlingar i hjärnan. För att vidare kunna studera hur effektiva de enzymblockerande läkemedlen är, utvecklade jag en metod för att mäta minskningen i proteinansamlingarna. Med den nya metoden kunde jag studera aktiviteten på ett specifikt enzym med en mycket högre noggrannhet jämfört med tidigare metoder. Andra fördelar med metoden var att den är billig, snabb och lätt att använda för att studera effekten av nya enzymblockerande läkemedel. Det är mycket vanligt att läkemedel ger biverkningar och påverkar andra områden av kroppen än den tilltänkta. Ett läkemedel som hindrar proteinansamlingar i hjärnan genom att blockera speciella enzym, påverkar även aktiviteten av enzymet i resten av kroppen. Jag valde därför att studera hur olika protein i nervceller från musungar påverkas av enzymblockerare. Genom att i så tidigt stadium som möjligt välja ut de läkemedelskandidater som ger liten påverkan på andra protein men ändå minskar proteinansamlingen utanför cellerna kan ett läkemedel snabbare komma ut på marknaden och behandla patienter med Alzheimers sjukdom. Vidare var min hypotes att enzym och protein måste vara nära varandra inne i cellen för att kunna bilda proteinansamlingar. Jag valde därför att titta på proteinet och enzymet i mikroskop med hjälp utav inmärkta antikroppar som binder direkt till proteinet. Den inmärkta antikroppen avgav ljus som kunde ses i mikroskopet och jag kunde avgöra om proteinet och enzymet var placerade på samma ställe i cellen. Resultaten visade att proteinet och enzymet var placerade i cellmembranet och nya läkemedel som hindrar inbindning till membranet kan användas som en ny strategi för att angripa Alzheimers sjukdom. Handledare: Christiane Volbracht, Leif Bjellin Examensarbete 60hp, farmakologi vt 2007 Institutionen för cell- och organismbiologi, Lunds universitet David Månsson Development of novel cellular SEAP-assay to measure BACE-1 activity. Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease characterized by extracellular amyloid plaques composed of 40-42 amino acid amyloid β-peptide (Aβ). Accumulation of Aβ in the brain is believed to be the primary influence driving AD pathogenesis. Aβ is generated by sequential processing of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases. BACE-1 (β-site APP Cleaving Enzyme 1) has been identified as the major β-secretase and is a primary therapeutic target for amyloidlowering strategies in AD. Here, we determined APP processing in Hek cells and developed a cellular assay using a fusion protein of secreted embryonic alkaline phosphate (SEAP) and recombinant APP with a mutation in the alpha cleavage site (APPKalphaV) to measure BACE-1 activity. Additionally, we investigated the processing of alternative endogenous substrates than APP such as APP-like protein 1 and 2 (APLP 1 and 2), sialyltransferase (ST6Gal1), and neuregulin (NRG1) by BACE-1 in primary neurons and Hek cells. We conclude that in Hek293 cells transfected with BACE-1 and APPswe, APP was processed by α-secretase and BACE-1 into sAPPα and sAPPβ, respectively and that the endogenous BACE-1 and γ-secretase activity in Hek293 cells was sufficient to generate Aβ from exogenous APP. We developed a novel cellular assay to measure BACE-1 activity by expressing a fusion protein of recombinant NRG1β1 and SEAP. We conclude from these data that SEAP-assay can be used to measure BACE-1 activity in cells without interference from other proteases. Further, we show that neurons display a BACE-1 activity dependent decrease of cleaved fragments corresponding with an increase of the pro-proteins. Key words: Alzheimers Disease, BACE-1, APP, APP-like protein 1 and 2, neuregulin, SEAP, and cerebellar granule cells Advisor: Christiane Volbracht, Leif Bjellin Degree project 60hp, 2006-09-25 – 2007-09-24 Department of Cell and Organism Biology, Lund University Pharmacology