Utvärdering av fem olika typningsmetoder för ESBL-producerande
Enterobacteriaceae
Ida Harila
Vårterminen 2015
Examensarbete, 15 hp
Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp
Institutionen för Klinisk mikrobiologi
Biomedicinsk laboratorievetenskap
Biomedicinska analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp
Kursansvarige lärare: Ylva Hedberg Fransson [email protected]
Evaluation of Five Methods for Typing of ESBL Producing Enterobacteriaceae
Handledare: Lena Norlund Laboratoriemedicin, NLL
Läraropponent:
Maria Hedberg
Examinator:
Mari Norgren
Datum för godkännande:
2015 - 06 - 23
2
Abstrakt
β-Laktamaser med utvidgat spektrum, ”Extended spectrum β-lactamases” (ESBL) är plasmidburna
enzymer som är vanligast bland Gram-negativa bakterier som Escherichia coli och Klebsiella
pneumoniae och de leder till resistens mot β-laktamantibiotika. Det finns olika ESBL-typer som delas
in i ESBLA, ESBLM och ESBLcarba beroende på enzymernas substratprofil. CTX-M, SHV och TEM är enzymer som tillhör ESBLA. ESBLM bär på plasmidmedierad AmpC och ESBLcarba producerar karbapenemaser som bryter ner karbapenemer. I studien ingick 34 tidigare karakteriserade kliniska
bakterieisolat med konstaterad ESBLA eller ESBLM fenotyp, samt tio karbapenemresistenta stammar.
Syftet med studien var dels att utvärdera kromogena agarmedier (CHROMagar) som screeningmetod
för upptäckt av ESBL. Dels att jämföra olika metoder för att detektera ESBLA och ESBLM: VITEK 2, Etest och diskdiffusion. Carba NP test utvärderades för att identifiera karbapenemasproducerande
EnterobacteriaceaeKonklusionerna av studien blev att CHROMagar ESBL och C3G var utmärkta för
att identifiera ESBL-typerna ESBLA och ESBLM, medan CHROMagar KPC gav falskt positiva resultat.
ESBL och C3G däremot var utmärkta för att korrekt identifiera ESBL-typerna ESBLA och ESBLM. Efter
jämförelsen mellan VITEK 2, diskdiffusion och E-test konstaterades att metoderna var likvärdiga.
Carba NP testet visade hög specificitet, utan falskt positiva resultat.
Nyckelord
ESBLA, ESBLM, ESBLcarba, karbapenemas, resistens
3
Introduktion
Resistenta bakterier och svårbehandlade infektioner blir ett allt större problem och antalet verksamma
medel mot dessa bakterier minskar. Bakterier som producerar β-laktamaser (Extended Spectrum
β-Lactamases [ESBL]) med ett utvidgat resistensspektrum kallas i dagligt tal för ESBL. Dessa blir allt
vanligare och en stor ökning i antalet fall observerades mellan 2007 och 2013 i Sverige, då antalet
ökade från 2099 till 8131 fall per år, en nästan fyrfaldig ökning (1). ESBL är plasmidburna enzymer
som oftast förekommer bland Gram-negativa bakterier inom familjen Enterobacteriaceae. De leder till
resistens mot flera olika typer av penicilliner och cefalosporiner som hör till gruppen β-laktamantibiotika. Nya typer av β-laktamaser upptäcks ständigt och idag finns mer än 700 olika varianter beskrivna (2).
Gener som kodar för ESBL kan överföras mellan bakterier antingen genom nya kloner, eller via
horisontell överföring av plasmidburna resistensgener mellan bakterier. Plasmider innehåller ofta
mobila genetiska element som är kapabla att flytta gener inom plasmiden men också mellan plasmider
och kromosomer (1).
Folkhälsomyndigheten har definierat ESBL och säger att kodande gen måste vara överförbar, både
inom samma art och mellan olika arter inom familjen Enterobacteriaceae och orsaka fenotypisk
resistens mot någon eller alla av följande antibiotika; cefotaxim, ceftazidim och karbapenemer. ESBLenzymer kan delas in i olika kategorier och de som är av störst klinisk betydelse är ESBLA. Det är dessa
man ofta menar när man talar om ESBL (3). CTX-M, SHV och TEM är enzymer som tillhör ESBLA och
dessa hämmas av klavulansyra som är en β-laktamasinhibitor (1). ESBLM brukar benämnas plasmidmedierad AmpC eftersom många bakterier som har genen naturligt kromosomalt, hämmas av kloxacillin som är en annan β-laktamasinhibitor. Slutligen ESBLcarba som ger upphov till karbapenemaser
vilka bryter ner karbapenemer, vilka delas in A (KPC-enzym), B (metallo-β-laktamaser) och D
(OXA-48) (3).
Karbapenemer är β-laktamer med ett mycket brett antibakteriell spektrum som används vid svåra
infektioner. Multiresistenta ESBLcarba-producerande bakterier har förvärvat resistens mot även karbapenemer och används vanligtvis som ett sista behandlingsalternativ. Bakterier resistenta mot karbapenemer är ofta besvärliga eftersom de samtidigt oftast är resistenta mot de flesta andra β-laktamer
(4). Det är kliniskt relevant att identifiera potentiella karbapenemasproducerande bakterier. Idag finns
det några olika metoder som används och första steget brukar vara att man screenar för uttryck av
resistens med hjälp av karbapenemer och minsta inhiberande koncentration (MIC) som fås fram med
hjälp av E-test. Det finns även andra metoder som baseras på fenotyp, till exempel det modifierade
Hodge testet (4). En ny metod som är billig och enkel för att snabbt identifiera karbapenemasproducerande Enterobacteriaceae bygger på bakteriernas förmåga att hydrolysera imipenem. Med hjälp av
fenolrött i reaktionsblandningen kan en pH-förändring indikeras och synliggöra nedbrytningen av
karbapenem. Metoden kallas Carbapenemase Nordmann-Poirel (Carba NP) test och tar inte mer än
två timmar att utföra (4).
4
Det finns idag olika metoder för att resistensbestämma bakterier och identifiera olika resistensfenotyper. E-test och diskdiffusion är två metoder där man använder sig av små pappersdiskar eller remsor
(E-test) som innehåller antibiotika. Dessa placeras på agarplattor som inokulerats med den bakterie
som skall testas. Antibiotikan diffunderar ut i agarmediet och när bakterierna tillväxer bildas en zon
utan bakterieväxt närmast lappen eller remsan där den högsta antibiotikakoncentrationen finns.
Zonstorleken används som mått på graden av antibiotikakänslighet. E-test är försedd med en
koncentrationsgradient och därmed bildas en elipsformad zon och MIC-värdet kan avläsas direkt på
remsan. Vid diskdiffusion mäter man zondiameter och storleken, vilka relateras till bestämda
brytpunkter och anger om bakterien ska klassas som känslig (S), intermediär (I) eller resistent (R) (5).
VITEK 2 är ett automatiserat instrument som används för att identifiera olika mikroorganismer och
antibiotikakänslighet (6).
Kromogena agarmedier innehåller substanser som ger bakteriekolonier olika färg beroende på deras
egenskaper och har visat sig vara en snabb metod för att ge en preliminär identifiering när det finns
misstanke om ESBL-producerande bakterier och som screeningmetod för att hitta personer som är
bärare av sådana bakterier (7). Tillverkaren av CHROMagar producerar bland annat medierna ESBL,
C3G och KPC som detekterar Gram-negativa bakterier. CHROMagar ESBL används vid Sunderby
sjukhus för att detektera ESBLA-producerande bakteriestammar. CHROMagar C3G detekterar
bakterier med nedsatt känslighet mot tredje generationens cefalosporiner, alltså både ESBLA och
ESBLM. Till sist finns också CHROMagar KPC som detekterar bakterier som producerar
karbapenemaser.
Studien hade tre syften: Det första var att utvärdera de kromogena agarmedierna CHROMagar ESBL,
C3G och KPC med hjälp av dokumenterade ESBL-stammar inför att eventuellt introducera metoden
vid screening av potentiella bärare av ESBL-producerande bakterier, samt för identifiering av ESBL.
Det andra syftet var att jämföra tre olika metoder som används för att typa ESBLA och ESBLM:
VITEK2, E-test och diskdiffusion. Det tredje syftet var att utvärdera Carba NP test för identifiering av
karbapenemasproducerande Enterobacteriaceae.
5
Material och metoder
Odling av bakterier
Nedfrysta bakterier tinades upp från -85 °C och odlades ut på blodagarplattor och inkuberades vid 37
°C över natt (ÖN). Bakterierna förvarades därefter vid 8 °C och ströks om på nya plattor ungefär en
gång i veckan och dagen innan de olika testerna utfördes.
ESBLA- och ESBLM-producerande bakterieisolat
I studien ingick 34 kliniska isolat med konstaterad ESBL fenotyp, insamlade under 2012-2015 på
Sunderby Sjukhus. urvalet bestod av 24 Escherichia coli, sju Klebsiella pneumoniae, en Klebsiella
oxytoca, en Citrobacter freundii och en Salmonella spp. Fem av E. coli stammarna var kända ESBLM,
resterande var ESBLA eller falskt positiva för ESBL. Kontroller utgjordes av referensstammar från
Culture Collection, University of Göteborg (CCUG). Den positiva kontrollstammen som användes var
K. pneumonie CCUG 45421 med ESBLA (SHV-18) och den negativa var E. coli CCUG 17620.
Karbapenemresistenta stammar
De tio karbapenemresistenta stammarna som användes var insamlade år 2013-2015. Urvalet bestod av
sju Enterobacteriaceae varav fem K. pneumoniae, och två E. cloaceae. P. aeruginosa och Bacteroides
fragilis. B. fragilis tillhör inte Enterobacteriaceae, men kan vara karbapenemresistenta. Fyra av
stammarna bildade ett verifierat karbapenemas, det vill säga positiva för ESBLcarba. Den positiva
kontrollstammen som användes var K. pneumoniae CCUG 64452 med ESBLcarba (OXA-48) och den
negativa E. coli CCUG 17620.
CHROMagar C3G, ESBL och KPC
CHROMagar-plattorna C3G, ESBL och KPC (CHROMagar, Paris, Frankrike) tillverkades enligt medföljande instruktioner. Stammar med ESBLA, ESBLM eller ESBLcarba användes. De ströks ut på de tre
olika typerna av kromagarmedier och inkuberades vid 37 °C ÖN. Dagen därpå avlästes kromagarplattorna och resultaten tolkades enligt tillverkarens instruktioner, utifrån koloniernas färg samt
mängden som vuxit fram på agarplattan. Om endast lite växt kunde ses där bakterierna först strukits
ut tolkades det som att bakterien inhiberats, men om tydliga, färgade kolonier kunde ses tolkades det
som att växten inhiberats till viss del med viss inokulationseffekt och provet ansågs som positivt, alltså
att bakterien producerade enzymerna.
Typning av ESBL-producerande bakterier med hjälp av diskdiffusion
Bakterierna slammades i 0,9 % NaCl så att en suspension med optisk täthet motsvarande 0,5
McFarland uppnåddes och inom 15 min ströks inokulatet ut på MuellerHinton-agar (MH) med en
steril bomullspinne. ROSCO ESBL + AmpC screen kit (ROSCO Diagnostica A/S, Taastrup, Danmark)
bestod av följande diskar; CTX30 (cefotaxim 30 µg), CTX+C (30 µg cefotaxim, klavulansyra), CTXCX
(30 µg cefotaxim, kloxacillin) och CTXCC (30 µg cefotaxim, klavulansyra, kloxacillin). Diskarna
applicerades inom 15 min och plattorna inkuberade sedan inom 15 min efter applicering, enligt 15-1515 minutersregeln. De inkuberades vid 37°C ÖN.
6
Typning av ESBL-producerande bakterier med hjälp av E-test
Inokulat tillreddes på samma sätt som för diskdiffusionen. Därefter applicerades E-testremsorna (BioMérieux, Lyon, Frankrike) CN/CNI (cefotetan/cefotetan och kloxacillin), CT/CTL
(cefotaxim/cefotaxim och klavulansyra), TZ/TZL (ceftazidim/ceftazidim och klavulansyra) och
PM/PML (cefepim/cefepim och klavulansyra) på MH-agar. Agarplattorna inkuberades vid 37 °C ÖN.
Även här tillämpades 15-15-15 minutersregeln.
Typning av ESBL-producerande bakterier med VITEK 2
Stammarna analyserades med VITEK2 Compact och det Gram-negativa resistenskortet AST-N218
(BioMérieux, Durham NC, USA). En bakteriesuspension med en optisk täthet på 0,5 McFarland
användes till resistenskorten och som kontroll att respektive stam var ren odlades 10 µL av suspensionen ut på en blodagarplatta inom 15 min och inkuberades vid 37 ◦CÖN.
Tolkning av diskdiffusion
Storleken av de bakteriefria zonerna runt diskarna jämfördes med varandra och om ingen skillnad
kunde observeras ansågs bakteriestammen varken vara resistent mot ESBLA eller ESBLM. Endast
ESBLA uttrycktes om differensen mellan zondiametern för CTX och C samt CTX30 när zonen var ≥5
mm och CTXCC och CTXCX när zonen var <5. Endast ESBLM ansågs uttryckt om differensen mellan
zondiametern för CTXCC och CTX och C var ≥5 mm samt CTXCX och CTX30 när zonen var <5 mm.
Tolkning av E-tester
MIC-värdet för CN, CNI, CT, CTL, TZ, TZL, PM och PML avlästes där den inhiberade elipsen skar Etestremsan. En kvot beräknades för respektive antibiotika och antibiotika med β-laktamas inhibitor
och om värdet var ≥ 8 indikerades ESBL-produktion, liksom om en så kallad fantomzon eller deformering av en elips kunde observeras. Om CN/CNI kvoten var ≥ 8 tolkades det som ESBLM, om
däremot något av de andra preparaten gav en kvot ≥ 8 tolkades provet som ESBLA.
Tolkning av VITEK2 resistenskort
Maskinellt konstruerade kommentarer om förekomst av ESBLA eller ESBLM lämnades av instrumentet
till analyserade isolat. Ingen ytterligare tolkning av kommentarerna har gjorts eftersom frågeställningen var ESBLA eller ESBLM.
Carba NP test
Karbapenemresistenta bakteriestammar tinades upp från -85 °C och odlades på nonselektiva blodagarplattor och inkuberades därefter vid 37 °C ÖN. Metod B testet utfördes genom att till varje analys
(prov/kontroll) användes två 1,5 mL eppendorfrör till vilka tillsattes 100 µl Tris-HCl lysis buffert (BPERII, Bacterial Protein Extraction Reagent, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). I rören
slammades 10 µL bakterier blandades, därefter tillsätts 100 µl av lösning A, respektive lösning A med 6
mg/L imipenem. Lösning A bereddes genom att 5 mL fenolrött sattes till 13,6 mL destillerat H2O. pHvärdet justerades till 7,8 med NaOH. Sist tillsattes 180 µL 10 mM ZnSO4 (Sigma-Aldrich, Cat: 221376,
St Louis, MO, USA), slutkoncentrationen som erhölls var 0,1 mM. För lösning A med 6 mg/L
imipenem tillsattes Imipenem med cilastin 500 mg/500 mg (Fresenius Kabi AB, Uppsala, Sverige).
7
Reaktionsblandningen inkuberades vid 37 °C i upp till två tim. Om ett färgomslag från rött till
orange/gult uppstod i lösning A med imipenem tolkades det som att bakterien i provet producerade
karbapenemas som hydrolyserar imipenem, och om inget färgomslag observerades indikerar det att
inget enzym producerades.
I de fall där förväntad detektion av enzymet med Carba NP-testet uteblev användes ett selektivt
medium (MH-agar med selektivt tryck av karbapenemerna imipenem, meropenem och ertapenem [ i
form av diskar]) som komplement för att inducera karbapenemasproduktion. Bakteriestammarna som
skulle analyseras igen, samt kontroller odlades om både på blodagarplattor och selektivt
tillväxtmedium. Plattorna inkuberades vid 37 °C ÖN. Carba NP test upprepades med ursprungs
protokoll och med stammarna som vuxit på selektivt tillväxtmedium. Enligt ett förändrat protokoll
utfördes därefter testet på stammarna från båda tillväxtmedierna.
Metod S utfördes genom att till två 1,5 ml eppendorfrör med 200 µL lyseringslösning slammades 2×10
µL bakterier. Rören blandades och inkuberades därefter i 30 min vid rumstemperatur (RT). Rören
centrufugerades 10000×g i fem min vid RT. Av supernatanten överfördes 100 µL till två nya
eppendorfrör med vardera 100 µL Lösning A + imipenem och 100 µL Lösning A och inkuberades vid
30 °C i upp till två tim och tiden antecknades då ett färgomslag från rött till orange/gult observerades.
Statistik
Sensitivitet och positivt prediktivt värde (PPV) beräknades för VITEK, diskdiffusion och E-test. Till
Carba NP testet där blodplattor och den enklare metoden, metod B, använts beräknades sensitivitet,
specificitet, PPV och negativt prediktivt värde (NPV). B. fragilis och P. aeruginosa har ej tagits med i
de statistiska beräkningarna eftersom testet egentligen endast var avsett för Enterobacteriaceae. När
de olika kromogena medierna jämfördes beräknades även här sensitivitet, specificitet, PPV och NPV
för var och en av medierna. Resultaten för B. fragilis och Salmonella har inte tagits med i de
statistiska beräkningarna eftersom det inte fanns någon anvisning från företagen som producerar
dessa medier hur de skulle tolkas. Laboratoriets egna och andra mikrobiologiska laboratoriers
fenotypiska utredningar användes som referens, samt externa kontrollbeskrivningar.
Etiska överväganden
Inget etiskt tillstånd har begärts för studien eftersom de kliniska bakterieisolaten som använts inte kan
härledas till enskilda patienter.
8
Resultat
Typning av ESBLA och ESBLM-producerande bakterieisolat med diskdiffusion,
E-test och VITEK2
Med ett fåtal undantag identifierades samtliga bakteriestammar med känd ESBL-typ korrekt med
diskdiffusion, E-test och VITEK 2 testerna (Tab. 1). De fall som gav missvisande resultat var K.
oxytoca som blev falskt positiv (utredd av Folkhälsomyndigheten) med både diskdiffusion och E-test.
En E. coli ESBLM uppfyllde inte helt kriterierna med diskdiffusion för att klassas som ESBLM enligt
disktillverkarens instruktioner eftersom CTXCC - CTX+C inte visade en zon ≥ 5 mm (Tab. 1). Med Etest var det två E. coli som indikerade ESBLM medan ESBLA inte gick att typa på grund av växt på hela
agarplattan (Tab. 1). En E. coli stam med verifierad ESBLM fick olika resultat med VITEK 2 (ESBLA),
E-test visade ingen ESBL-aktivitet medan diskdiffusion visade på ESBLM fenotyp. På grund av dessa
varierande resultat odlades stammen på nytt och försöken upprepades. Försöket visade då ESBLM för
alla tre metoderna. Sensitiviteten och PPV för diskdiffusionen beräknades till 97 % respektive 100 %
eftersom en E. coli stam blev falskt negativ och K. oxytoca blev sant negativ. Sensitivitet och PPV för
E-test beräknades till 100 respektive 97 % eftersom K. oxytoca blev falskt positiv. För VITEK2
beräknades både sensitivitet och PPV till 97 %.
Identifiering av karbapenemasaktivitet med Carba NP test (metod B)
Endast tre av fem stammar som producerade något karbapenemas gav ett positivt utslag i Carba NP
testet. En K. pneumoniae (KPC) gav kraftigt färgomslag från rött till gult redan efter fem min och de
två andra K. pneumoniae stammarna (VIM och OXA-48) gav färgomslag till orange efter 30 min
inkubering. B. fragilis med cfiA-gen som kodar för ett metallo-β-laktamas gav även färgomslag i den
negativa kontrollen. K. pneumoniae (NDM) gav inget färgomslag. De nio stammar som inte
producerade några karbapenemaser blev som förväntat alla negativa (Tab. 2). För Carba NP test
beräknades sensitiviteten, specificiteten, PPV och NPV till 75, 100, 100 respektive 92 %.
Carba NP test efter induktion av karbapenemas (metod S)
I tillägget till Carba NP test utfördes testet med det förändrade protokollet (metod S) med bakteriestammar odlade på både t selektivt tillväxtmedium och blodagar, Testet utfördes också med det ursprungliga protokollet (metod B) och bakteriestammar från det selektiva tillväxtmediet. K. pneumoniae NDM blev positiv och man kunde observera ett färgomslag med båda metoderna när det selektiva
odlingsmediet användes, men inte efter växt på blodagar (non-selektivt medium). B. fragilis blev positiv i testet efter växt både på selektivt och non-selektivt medium, men färgomslag uppstod även i den
negativa kontrollen (Tab. 2).
CHROMagar ESBL, C3GR och KPC
På ESBL-agar växte alla sju stammar med ESBLA, tre av fem stammar med ESBLM inhiberades helt
och alla sex karbapenemresistenta stammarna växte förutom K. pneumoniae (OXA-48) och B. fragilis.
Alla testade stammar förutom K. pneumoniae (OXA-48) och B. fragilis växte på C3G-mediet (Tab. 3).
Alla karbapenemresistenta stammar förutom två växte på KPC-mediet. Den ena av dem som inte växte
9
producerade inte karbapenemas utan var resistent mot ertapenem på grund av någon annan resistensmekanism, den andra var B. fragilis. Resterande tolv stammar med ESBLA och ESBLM inhiberades,
några noterades med ”inokulationseffekt” (Tab. 3). Sensitivitet, specificitet, PPV och NPV för KPC
beräknades till 100, 83, 67 respektive 100 %, ESBL och C3G beräknades alla till 100 %.
10
Diskussion
Infektioner orsakade av ESBL-producerande bakterier är ofta kopplade till höga kostnader, men också
hög mortalitet (8). Många allvarliga infektioner behöver snabb insättning av antibiotikabehandling
och är beroende av empirisk behandling då den diagnostiska utredningen tar lång tid. För att den
empiriska behandlingen inte ska bli ineffektiv är det viktigt med både nationell och global kännedom
om aktuellt resistensläge, eftersom utbredningen av resistenta bakterier ser mycket olika ut i olika
delar av världen och vi reser mycket. Resistenta bakterier håller idag på att bli ett stort allmänt hälsoproblem. För att antibiotika som används idag också ska vara verksamma i framtiden krävs att vi är
mer försiktiga och restriktiva med användningen (1). Olika metoder finns för att identifiera och typa
ESBL-producerande bakterier och därför har vi i den här studien utvärderat och jämfört olika metoder
för att underlätta diagnostisering och därmed behandling av infektioner orsakade av resistenta
bakterier. För att vi ska vinna kampen mot allt mer resistenta bakterier krävs det ett omfattande
arbete för att minska användningen av antibiotika, hitta nya behandlingsalternativ och även snabbt
kunna identifiera dessa motståndskraftiga bakterier.
Diskdiffusionen var den enda metoden som kunde avslöja att K. oxytoca inte bar på ESBLA utan hade
ett artspecifikt kromosomalt enzym. K. oxytoca har ofta detta kromosomala β-laktamas som kallas K1
eller KOXY (9). En liten del av dessa bakterier saknar ESBL men hyperproducerar K1 (10). Med E-test
gick det inte att fastställa som två av E. coli-stammarna bar på ESBLA, eftersom det inte gick att
beräkna någon kvot. Dock konstateras att dessa stammar var ESBLM. Det är inte ovanligt att E. coli
och K. pneumoniae producerar både ESBLA och ESBLM (10). VITEK 2 har tidigare ingått i en studie
där man utvärderade dess förmåga att detektera ESBL-producerande E. coli och K. pneumoniae.
Metodens sensitivitet, specificitet, PPV och NPV blev 98,8, 98,5, 99,5 respektive 96,3% (11). I vår
studie beräknades både sensitivitet och PPV för VITEK till 97 %, om ett större antal kliniska isolat
ingått i studien kan det tänkas att resultaten blivit mer lik de erhållna resultatet i den andra studien.
Kostnaden för typningsmetoderna jämfördes och kostnaden för VITEK AST-N218 kortet är 55 kr per
styck. En gemensam klumpsumma för alla de E-testremsorna som användes till ett prov beräknades
till 151 kr. Antibiotikadiskarna beräknades till 71 kr. Övrigt material, andra omkostnader och
arbetstiden har inte tagits med i beräkningarna.
I tidigare studier har Carba NP testet visat hög sensitivitet och specificitet för Enterobacteriaceae, hela
100 % för både sensitivitet och specificitet (12), 91,1 % sensitivitet och 100 % specificitet (13) samt 100
% sensitivitet och specificitet (4). Vid utförandet av Carba NP test i vår studie noterades överraskande
låg sensitivitet, 75 %. I studien ingick dock endast ett fåtal stammar, beräkningarna är därför inte helt
tillförlitliga. Resultatet från det andra försöket med Carba NP testet med olika metodprotokoll och
olika odlingsmedier visade att K. pneumoniae NDM gav bäst resultat med det selektiva tillväxtmediet
tillsammans med metod S. Att K. pneumoniae stammen först blev negativ behöver inte vara på grund
av att produktionen av enzymer minskat, utan kan också bero på minskad permeabiliteten av
bakteriens yttermembran (12), eller att bakterierna inte fullständigt lyserats. I nyligare studier har
metodprotokollet ändrats, bland annat har mängd bakterier ökats eftersom vissa mycket mukoida
stammar har visat sig svåra att lysera (16). Vidare har bakterierna inkuberats med lyseringsbufferten
11
för att försäkra sig om att bakterierna lyserats och β-laktamaset frigjorts. Andra har ändrat den slutliga
inkuberingen då det helt enkelt gett bättre resultat (17).
B. fragilis är en anaerob bakterie som tillhör Bacteroidetes och inte Enterobacteriaceae familjen.
Carba NP testet verkade inte ha förmåga att detektera andra bakteriearter med karbapenemas än de
tillhörande Enterobacteriaceae. B. fragilis tillhör den grupp anaeroba bakterier där resistensen ökar
och blivit ett allt större problem. Hos många stammar inom B. fragilis-gruppen har man hittat genen
cfiA som tros leda till minskad känslighet eller i vissa fall total resistens mot karbapenemer och andra
β-laktamer (14).
CHROMagar mediet ESBL används idag som screeningmetod vid Sunderby Sjukhus för att identifiera
bärare av ESBL-producerande bakterier i tarmen. Detta medium fångar upp ESBLA, men inte ESBLM. I
Sverige är man intresserad av att skilja ESBLA och ESBLM och därför har ett nytt kromagarmedium,
CHROMagar C3G tagits fram, med vars hjälp man ska hitta alla bakterier med nedsatt känslighet för
tredje generationens cefalosporiner. Eftersom ESBLcarba också blir allt vanligare söker man i dagsläget
efter ett bra kromogent agarmedium, t.ex. CHROMagar KPC, som screeningmetod för stammar som
producerar olika karbapenemaser. Laboratoriets mål är att nuvarande metod med antibiotikadiskar
som screening för ESBLM och ESBLcarba, kan bytas ut mot kromogena substrat för ökad känslighet samt
enklare utodlingsmetodik. Kromagarplattan CHROMagar ESBL har i tidigare studier utvärderats.
Sensitivitet, specificitet, PPV och NPV beräknades till 100, 93,3, 51,5 respektive 100 %. Konklusionen
från studien blev att CHROMagar kan med god selektiv förmåga detektera stammar som producerar
ESBL (7). I vår studie beräknades sensitivitet, specificitet, PPV och NPV för KPC 100, 83, 67 respektive
100 %, ESBL och C3G gav utmärkta resultat och beräknades alla till 100 %. Slutligen, vid jämförelse
mellan metoderna för att typa ESBLA och ESBLM kan det konstateras att dessa inte skiljer sig mycket.
Diskdiffusion och E-test visade stabilare resultat än VITEK 2. Med hänsyn till kostnaden
rekommenderas därför diskdiffusionen från ROSCO ESBL tillsammans med AmpC Screen kit.
Utifrån resultaten från denna studie kan Carba NP test med bakterier från selektivt tillväxtmedium
enligt metod S, med bland annat effektivare lysering av bakterierna, rekommenderas framför Carba
NP testet med bakterier odlade på blodagar och enligt metod B. För vidare studier borde ett större
antal kliniska bakteriestammar analyseras med Carba NP testet, resultaten blir då mer tillförlitliga och
man kan avgöra om det finns någon skillnad mellan metoderna och tillväxtmedierna.
Vid analys av bakterier odlade på CHROMagarmedierna visade att ESBL och C3G vara utmärkta för
att identifiera ESBL-typer. KPC konstaterades som i tidigare studier vara mindre tillförlitlig. Eftersom
man tidigare använt CHROMagar ESBL vid Sunderbyn sjukhus, vilken endast kan detektera ESBLA,
ska man nu se över om man eventuellt ska byta till CHROMagar C3G som även fångar upp ESBLM.
Konklusionerna av studien var att efter jämförelsen mellan metoderna för att typa ESBLA och ESBLM
kan man konstatera att resultaten av metoderna var likvärdiga. Carba NP testet visade sig ha en hög
specificitet, utan falskt positiva resultat. CHROMagar ESBL och C3G visade sig vara utmärkta för att
korrekt identifiera ESBL-typerna ESBLA och ESBLM. KPC konstaterades vara mindre tillförlitlig och
gav falskt positiva resultat.
12
Tack tillägnas
Jag vill tacka min handledare Lena Norlund för bra handledning och Minna Ygge för handledning och
stöttning genom hela arbetet. Jag vill även tacka Christina Tjärner, Inger Larsson och Birgitta
Lundström för stöttning av de laborativa momenten i studien. Sedan vill jag även tacka CHROMagar
som bidragit med kromagarmedierna C3G och KPC.
13
Referenser
1.
Brolund A. Overview of ESBL-producing Enterobacteriaceae from a Nordic perspective. Infect
Ecol Epidemiol. 2014; 4:1-9.
2. Franiczek R and Krzyzanowska B. ESBL-producing Escherichia coli isolated from bloodstream
infections – Antimicrobial suseptibility, conjugative transfer of resistance genes and phylogenetic
origin. Adv Clin Exp Med. 2014; 23:865-870.
3. Folkhälsomyndigheten. ESBL-producerande tarmbakterier.
http://www.folkhalsomyndigheten.se/pagefiles/17838/ESBL-producerande%20tarmbakterier.pdf
(2015-03-06).
4. Nordmann P, Poirel L and Dortet L. Rapid detection of carbapenemase producing
Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis. 2012; 18:1503-1507.
5. Jenkins S, Schuetz A. Current conceps in laboratory testing to guide antimicrobial therapy. Mayo
Clin Proc. 2012; 87:290-308.
6. Pincus D. Microbial identification using the BioMérieux VITEK 2 system. BioMérieux, inc.
7.
Saito R, Koyano S, Nagai R, Okamura N, Moriya K and Koike K. Evaluation of a chromogenic agar
medium for the detection of extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae. Lett
Appl Microbiol. 2010; 51:704-706.
8. Wintermans B B, Reuland E A, Wintermans R G F, Bergmans A M C and Kluytmans J A J W. The
cost-effectiveness of ESBL detection: Towards molecular detection methods? Clin Microbiol
Infect. 2013; 19:662-665.
9. Gheorghiu R, Yuan M, Hall L. M. C. and Livermore D. Bases of variation in resistance to β-lactams
in Klebsiella oxytoca isolates hyperproducing K1 β-lactamse. J Antimicrob Chemother. 1997;
40:533-541.
10. Sturenburg E, Sobottka I, Djahesh D, Laufs R and Mack D. Evaluation of a new cefepimeclavulanate ESBL Etest to detect extended-spectrum beta-lactamases in an Enterobacteriaceae.
strain collection. J Antimicrob Chemother. 2004; 54:134-138.
11. Chen HM, Wu JJ, Tsai PF, Wann JY and Yan JJ. Evaluation of the capability of the VITEK 2
system to detect extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella
pneumonia isolates, in particular with the coproduction of AmpC enzymes. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis. 2009; 28:871-874.
12. Dortet L, Bréchard L, Cuzon G, Poirel L, Nordmann P. Strategy for rapid detection of
carbapenemase-producing Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother. 2014; 58:24412445.
13. Yusuf E, Van Der Meeren S, Schallier A and Piérard D. Comparison of the Carba NP test with the
Rapid CARB Screen Kit for the detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae and
Pseudomonas aeruginosa. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33:2237-2240.
14. Garcia N, Gutiérrez, Lorenzo M, Vadillo S, Píriz S, Quesada A. Gene context and DNA
rearrangements in the carbapenemase locus of division II strains of Bacteroides fragilis.
Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53:2677-2678.
14
15. Chancey S, Zähner D and Stephens D. Acquired inducible antimicrobial resistance in Grampositive bacteria. Future Microbiol. 2012; 7:959-978.
16. Dortet L, Poirel L and Nordmann P. Further proofs of concept for the Carba NP Test. Antimicrob
Agents Chemother. 2014; 58:1269.
17. Österblad M. NordicAST. Evaluering av en snabb fenotypisk testmetod för detektering av
karbapenemaser: Carba NP. http://s3-eu-west-1.amazonaws.com/hlintranet/files/2d740541e1343e4b2b85aacdebf66be553aa84e9/103b68410bc3e4c9bf3658b0a444e
118_130531084731.pdf (2015-04-14).
15
Tabell 1. Bakteriearter med känd ESBL-typ (ESBLA eller ESBLM) testade
med diskdiffusion, E-test och VITEK 2.
Antal korrekt typade isolat
Bakterieart
E. coli (n=24)
Diskdiffusion
E-test
VITEK 2
23
24
23
K. pneumoniae (n=7)
7
7
7
K. oxytoxa (n=1)
1
0
0
C. freundii (n=1)
1
1
1
Salmonella sp. (n=1)
1
1
1
16
Tabell 2. Carba NP test utfört på karbapenemresistenta och ESBLA producerande bakteriestammar.
Bakteriestammara
ESBLA
K. pneumoniae
E. coli
Karbapenem R, Enterobacteriaceae
K. pneumoniae (Ertapenem R)
K. pneumoniae (NDM)
E. cloaceae (─)
K. pneumoniae (VIM)
P. aeruginosa (─)
K. pneumoniae (KPC)
K. pneumoniae (OXA-48)
Karbapenem R, övriga
B. fragilis (MBL)
P. aeruginosa (─)
a) ).
b) A, negativ kontroll.(Lösning A).
Kontroller
K. pneumoniae CCUG (pos)
E. coli CCUG (neg)
n
Metod B
Metod S
A+imb,c
Ab,d
A+im
A
3
6
─
─
─
─
1
1
─
─
─
─
+30
─
2
─
─
1
1
1
1
+30
─
++5
+30
─
─
─
─
1
1
(+)
─
(+)e
─
(++)5
(++)5
1
1
+20
─
─
─
++10
─
aBakterierna odlades på blodagarplattor och lysering enligt standardprotokoll (metod B)
respektive odling på selektivt medium och utvidgad lyseringsteknik (metod S).
bFärgomslag
från rött till orange +; gult ++ samt tiden i min vid färgomslag.
A+im (Lösning A med imipenem
d A, negativ kontroll (lösning A)
eFärgomslag i lösning A, negativ kontroll, resultat går ej att tolka
cReaktionsblandning
17
Tabell 3. Resultat från tre olika kromagarmedier.
CHROMagar
ESBL
C3G
KPC
ESBLA
K. pneumoniae
+a
+
─b
K. oxytocad
+
+
(+)c
K. pneumoniae
+
+
(+)
E. coli
+
+
─
E. coli
+
+
─
C. freundii
+
+
─
Salmonella sp.
+
+
─
E. coli
─
+
─
E. coli
+
+
─
E. coli
(+)
+
─
E. coli
─
+
─
E. coli
─
+
─
K. pneumoniae (ertapenem R)
+
+
─
K. pneumoniae (NDM)
+
+
+
K. pneumoniae (VIM)
+
+
+
K. pneumoniae (KPC)
+
+
+
K. pneumoniae (OXA-48)
─
─
+
B. fragilis (MBL)
─
─
─
Neg. E. coli CCUG 17620
─
─
─
Pos. K. pneumoniae CCUG 45421 (SHV-18)
+
+
(+)
Pos. K. pneumoniae CCUG 64452 (OXA-48)
(+)
(+)
+
Bakteriestammar
ESBLM
ESBLcarba
Kontroller
aVäxt
bInhibition
cVäxt
inhiberad men med ”inokulationseffekt”, lite färgad växt i primärutstryket
dKromosomalt
medierat β-laktamas
18
Figur 1. Exempel på resultat erhållna med Carba NP test utfört på bakterier som odlats på selektivt
tillväxtmedium och behandlats enligt metod B. Lösning A med imipenem (A+im) till vänster och
lösning A (A) till höger.
19
ESBL
C3G
KPC
Figur 2. Bakteriestammar odlade på tre olika kromagarmedier. Från vänster CHROMagar ESBL, C3G
och KPC. A) C. freundii ESBLA, B) E. coli ESBLM, C) K. pneumoniae (NDM) och D) K. pneumoniae
(ESBLA) på CHROMagar KPC här ses ”inokulationseffekt”, lite blå växt vid primärutstryket.
20
