NGS-baseraddiagnostikav
Gastrointestinalstromacellstumör(GIST)
vidCentrumförMolekylärDiagnostik
2015-12-01
Centrum för molekylär diagnostik (CMD) inrättades i oktober 2014 i syfte att stärka
klinisk diagnostik baserat på den s.k. nya generationens sekvenseringsteknik (NGS)
inom Region Skåne. CMD tillhör organisatoriskt Medicinsk service-förvaltningen. Vid
CMD samverkar verksamhetsområden inom Medicinsk service/Labmedicin, Skånes
Universitetssjukhus(SUS)ochforskargruppervidLundsUniversitet(LU).
Inom CMD utarbetas korta översikter för NGS-baserad diagnostik vid olika
sjukdomstillstånd.Dessaöversikterförfattasavarbetsgrupperförolikadiagnosermed
enrepresentantfrånCMDsomsammankallandeochdokumentansvarig.
Aktuell översikt berör NGS-baserad diagnostik av gastrointestinal stromacellstumör
(GIST).Arbetsgruppenbeståravföljandepersoner:
• Fredrik Mertens, Professor/överläkare, Klinisk Genetik, Labmedicin Skåne
(sammankallandeochdokumentansvarig)
• EmmaMårtensson,Sjukhusgenetiker,KliniskGenetik,LabmedicinSkåne
• PerLeveén,processledaremolekylärpatologi,KliniskPatologi.Labmedicin
• KajsaEricson-Lindquist,medicinskansvarigmolekylärpatologi,KliniskPatologi,
Labmedicin
• HenrykDomanski,specialist,KliniskPatologi,Labmedicin
• MikaelEriksson,specialist,Onkologiskakliniken,SUS
2
Bakgrund
Gastrointestinal stromacellstumör (GIST) är en ovanlig tumörsjukdom; incidensen i
Sverige beräknas till 1,5/100.000/år.1 Medelålder vid diagnos är c:a 60-65 år. Vid
sarkomcentrumiLundblirtumörerfrånc:a25-30patienterperårföremålförgenetisk
diagnostikavseendebehandlingspredikterandemutationer.
Drygt hälften av alla GIST utgår från magsäcken och en tredjedel från
tunntarmen. Resterande fall är lokaliserade till andra regioner i
gastrointestinalkanalen, inkluderande oment och mesenterium, eller debuterar som
disseminerad sjukdom. Kliniska tecken på GIST innefattar diffusa magbesvär, anemi
pga kronisk eller akut blödning, obstruktion, etc. En andel upptäcks accidentellt i
samband med utredning för andra åkommor. Tumörerna sprids regionalt
(intraabdominellt,retroperitonealt)ochmetastaseraroftasttilllevern.1
Diagnostik av GIST vilar på morfologisk analys i kombination med
immunhistokemiförblaKITproteinet(CD117);endastc:a5%avGISTärnegativaför
KIT.Viktigastedifferentialdiagnosärleiomyomochleiomyosarkom.1,2
Behandlingen avgörs av tumörstorlek och -lokalisation, spridningsgrad,
histopatologiskbildsamt,iutvaldafall,mutationsstatus;småtumörer(<2cm)medlåg
mitosaktivitetpåverkarintepatientensöverlevnad,medantumörersomär>10cmoch
harenhögmitosaktivitetnästanalltidprogredierar.Kirurgiäridagdenendakurativa
behandlingen.
Vid inoperabel tumörsjukdom är behandling med tyrosinkinashämmare (TKI)
det viktigaste alternativet. Detta beror på att c:a 60-85% uppvisar mutationer i KIT
genen, ledande till aktivering av KIT-beroende signalvägar. De vanligaste (två
tredjedelar av fallen) KIT mutationerna är belägna i exon 11 (som kodar för
juxtamembranösdomän),följtavexon9(extracellulärdomän;10%),exon13ochexon
17 (tyrosinkinasdomäner).1,2 Mutationerna varierar från punktmutationer till
kompliceradekombinationeravdeletionerochinsertioner.2C:a50%avrapporterade
mutationer i COSMIC databasen klassas som insertion, deletion eller komplex; den
stora majoriteten av dessa är belägna i exon 11. Majoriteten av KIT exon 11
mutationer är interstitiella deletioner i början av exonet (kodon 550-579) eller
punktmutationerislutetavexonet(kodon557,559,560eller576).Enlitenandel(510%) uppvisar mutation i PDGFRA genen, ffa exon 18, istället för i KIT genen.1,2
MutationsspektrumiKITochPDGFRAvarierarmedtumörensstorlekochlokalisation.13
Insertioner, deletioner eller komplexa mutationer i PDGFRA utgör c:a 15% av de
mutationersomrapporteratsiCOSMICdatabasen,varavdenstoramajoritetensitteri
exon 12. En mycket liten andel av GIST uppvisar mutation i andra exon av KIT eller
PDGFRAellerärmutations-negativa.Sådanafalläroftaklinisktavvikande(ungålder,
associationtillneurofibromatostyp1,CarneytriadellerCarney-Stratakissyndrom)och
kan ha mutation i NF1 eller i en SDH gen.1 Vissa studier antyder att även sekundära
kromosomavvikelsemönsterpåverkarklinisktförlopp.4
IdefalldärbehandlingmedTKIövervägsärmutationsstatusviktigt,eftersom
typochlokalisationavmutationpåverkarkänslighet.Sålundasvarartexdeflesta(c:a
70%) GIST med mutationer i exon 11 av KIT mycket väl på standardbehandling (400
mg/dag) med imatinib, medan de med den vanligaste substitutionen (D842V) i
PDGFRA exon 18 inte svarar på imatinib, och majoriteten (c:a 70%) med mutation i
exon 9 av KIT svarar dåligt, och behöver högre dos imatinib eller annan TKI (t ex
sunitinib eller nilotinib).1,2 Vid sjukdomsprogression och/eller efter längre tids
3
behandlingmedTKIsesoftaklonalevolutionmeduppkomstavsubklonermednyaKIT
mutationersomintelängresvararpågivenbehandling.5
InomRegionSkåneutfördesårligenca25mutationsanalyserförexon9,11,13
och17avKITochexon12och18avPDFGRAunderperioden2011-2014.
ProvtagningsrutinerochprovhanteringförNGS-baseraddiagnostik
Utgångspunkten för den NGS-baserade diagnostiken är paraffininbäddad
formalinfixerad vävnad (s.k. FFPE vävnad). Molekylärpatolog ansvarar för materialets
lämplighet för analys, genom att granska tumörvävnad från de histologiska och/eller
cytologiska preparat som finns arkiverade. Ett representativt tumörområde väljs ut
medhögandeltumörceller.Oftakandettautgöraenlitendelavdenvävnadsbitsom
finnsienFFPEklots.Ettantaltunnasnittavutvaldtumörvävnadtas,typiskt4st5um
snitt, samt nya HTX-snitt för att verifiera att representativt material analyserats.
(utförs av VO Klinisk Patologi). Vid tillfälle kan provpreparatet även bestå av färsk
tumörvävnadsomskickasviaKliniskPatologitillGenetiskaKlinikenförDNAextraktion
och mutationsanalys; om provmängden tillåter utförs även genomisk array. Även
cytologimaterialefterfinnåls-ellermellannålsbiopsikanvaraaktuellt.Dettaskickasdå
antingen färskt till Genetisk Kliniken för DNA extraktion eller så extraheras DNA vid
Klinisk Patologi efter paraffininbäddning. Prov, tillsammans med mutationsremiss,
transporteras till Genetiska Kliniken. Provtransport sker snarast efter
utskärning/punktionförfärskvävnadochendagiveckanförextraheratDNAfrånFFPE
vävnad.
Vid ankomst av prov och remiss till Genetiska kliniken registreras provet och
remissen scannas i klinikens patientdatabas. Vid registrering erhåller varje prov ett
unikt löpnummer, som därefter används såväl i det laborativa arbetet som vid
dataanalysdelen.Kopplingenmellanlöpnummerochpersondataärframtillbesvaring
endasttillgängligförbehörigpersonalvidGenetiskakliniken.
Sekvenseringkommerattutförasengångpervecka.Sålundakommersvarpå
NGS-analysen att meddelas inom två veckor efter provets ankomst till Genetiska
Kliniken.
NukleinsyraextraktionochDNAkvalitetskontroll
Från provet (FFPE snitt) extraheras DNA på Klinisk Patologi. Först avparaffiniseras
provetmedhjälpavlösningsmedel(xylen),varefterdenrenatumörvävnadenbrytsner
enzymatiskt så att DNA och RNA frisläpps i lösning. DNA/RNA isolering sker därefter
automatiserat med ett kommersiellt extraktionskit (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit,
Qiagen).
Formalinfixeringavtumörvävnadledertilldegraderingavnukleinsyror.Detär
därför av stor betydelse att uppskatta hur utbredd DNA degraderingen är innan
molekylärgenetisk analys genomförs. Extraherat DNA analyseras med hjälp av ett
automatiserat gelelektroforessystem (Tapestation) för att bestämma hur stor mängd
avdettotalaDNAtsommotsvararenvissstorlek.Dettaärettviktigtstegförattkunna
förutsevilkaproversomkommerattgeetttillförlitligtmutationssvar.Vidbehovkan
även en kvantitativ PCR-analys tillämpas för att ge ytterligare information om DNAprovetskvalitet.OmDNA-kvalitetenbedömsvaraotillräckligförattkunnaerhållaett
tillförlitligt resultat i mutationsanalysen återrapporteras detta omgående till Klinisk
Patologi,därettbesluttasompreparatettrotsalltskagåvidaretillmutationsanalys
4
elleromnyttmaterialskabegäras.Dettaförfarandeförkortaravsevärtsvarstidenför
provsomsannoliktinteskullegeinformativasvariNGS-analysen.
NGS-baseraddiagnostikföridentifieringavsomatiskamutationer
Prov vars DNA passerat kvalitetskontrollen går vidare till den NGS-baserade
mutationsanalysen. Metoden som används vid Genetiska kliniken är baserad på Ion
TorrentNGS-teknologi(www.thermofisher.com)ikombinationmedenriktadgenpanel
(IonAmpliSeqTM CancerHotspotPanelv2).Denriktadegenpaneleninnefattarutvalda
regionerfrån50cancerrelateradegener(Tabell1).
Tabell1.MålgenerförIonAmpliSeqTMCancerHostpotPanelv2a
ABL1
EZH2
JAK2
PTEN
AKT1
FBXW7
JAK3
PTPN11
ALK
FGFR1
KDR
RB1
APC
FGFR2
KIT
RET
ATM
FGFR3
KRAS
SMAD4
BRAF
FLT3
MET
SMARCB1
CDH1
GNA11
MLH1
SMO
CDKN2A
GNAS
MPL
SRC
CSF1R
GNAQ
NOTCH1
STK11
CTNNB1
HNF1A
NPM1
TP53
EGFR
HRAS
NRAS
VHL
ERBB2
IDH1
PDGFRA
ERBB4
IDH2
PIK3CA
a
GeneriröttärdesomäraktuellaförGISTdiagnostik.Generiblåttkanvaraavdiagnostiskt
intressevidandraben-ochmjukdelstumörer.
För dessa gener analyseras de (delar av) exon som rapporterats ha hög
mutationsfrekvens i tumörsjukdom, baserat på förekomst av rapporterade somatiska
tumörförändringarviaexempelvisCOSMIC(http://cancer.sanger.ac.uk).Denlaborativa
delen av NGS analysen kan delas upp i tre steg: 1) preparering av ett s.k. DNAprovbibliotek för varje prov, 2) sammanslagning (poolning) av provbibliotek och
förberedelse av prov för sekvensering, s.k. templatpreparering och 3) själva
sekvenseringen.EttDNA-provbibliotekbetyderhärenvätskelösningavettstortantal
olikaamplifieradeDNAfragmentförvilkaDNAsekvensenskabestämmas;detaktuella
kitet innehåller 207 primerpar, som ska amplifiera 207 DNA fragment med en
nukleotidlängd på 111-187 (genomsnitt 154) nukleotider. De utvalda regionerna
amplifierassamtidigtienPCRreaktion,ochspecifikaoligonukleotidadaptorerkopplas
påvarjefragmentförattmöjliggörasekvenseringochsamkörningavfleraprover(från
olika patienter). Tack vare NGS-teknikens massiva kapacitet kan många prov
prepareras parallellt, poolas, och sekvenseras samtidigt, vilket medger ett högt
provflöde. Sekvenseringen sker därefter på ett Ion PGM-instrument. Den laborativa
delen av mutationsanalysen (bibliotekspreparation och sekvensering) utförs generellt
1gångpervecka,menkanvidbehov,somt.ex.försärskiltbrådskandeprover,startas
flergångerpervecka.
5
Tabell2.SpecifikationavvilkaregioneravKITochPDGFRAsom
täcksavIonAmpliSeqTMCancerHostpotPanelv2a
Gen
Exon c.position
p.position
KIT
2
c.68-174
p.22-58
KIT
9
c.1482-1540
p.494-514
KIT
10
c.1611-1647
p.537-549
KIT
11
c.1648-1761
p.550-587
KIT
13
c.1880-1982
p.627-661
KIT
14
c.1991-2052
p.664-684
KIT
15
c.2142-2172
p.714-724
KIT
17
c.2407-2484
p.803-828
KIT
18
c.2495-2572
p.832-858
PDGFRA 12
c.1654-1749
p.552-583
PDGFRA 14
c.1931-2002
p.644-668
PDGFRA 15
c.2013-2127
p.671-709
PDGFRA 18
c.2457-2562
p.819-854
a
Referenssekvenser för positioner: KIT och PDGFRA NC_000004.12
AnalysavsomatiskavarianterfrånNGSdata
NGS-tekniken genererar en massiv sekvensmängd för varje prov. För att kunna
identifiera somatiska mutationer (varianter) i denna stora datamängd för de 50
generna sker ett antal dataanalyssteg i samband med sekvensering. Först måste
sekvensdata från PGM-instrumentet (Thermo Fisher) matchas mot ett humant
referensgenom för att definiera vilka sekvenser som hör till en viss undersökt
genregion, t.ex. exon 11 i KIT. Base calling, alignment och identifiering av
mutationsvarianter(variantcalling)utförsiIonTorrentsTorrentSuite-mjukvara,med
genomversion GRCh37/hg19 som referenssekvens. För annotering och filtrering av
varianter används mjukvaran Ion Reporter (Thermo Fisher). Varianter i intron och
vanligtförekommandeSNP:arexkluderas.Förattutökakänslighetenfördetektionav
deletioner i KIT och PDGFRA kompletteras analysen med ett internt utvecklat
bioinformatisktverktyg,baseratpåBLAST-algoritmen.
ÅterrapporteringavmutationsresultattillVOKliniskPatologi
Efter att identifierade varianter från sekvenseringen har annoterats, filtrerats, och
klassats sammanställs en rapport över samtliga kvarvarande varianter (mutationer).
MutationsrapportenfärdigställsinomRegionSkånesIT-struktur,medhjälpavinternt
utvecklade rapportmallar, varefter rapport samt grunddata över identifierade
varianteröverförstillVOKliniskPatologiförvidaresammanställning/formateringoch
slutgiltigåterrapporteringtillremitterandekliniker.
Lagringavsekvensdata
Rådata i form av de filer som används för basecalling, samt processad sekvensdata i
form av BAM-filer (sekvenser som har alignats till referensgenomet) och vcf-filer
6
(detekterade varianter) lagras på PGM-instrumentets server under en begränsad tid,
samtidigtsomenback-up-exportskertillRegionSkånesservrar.Datasomsedermera
tas bort från instrumentets server arkiveras automatiskt på Region Skånes servrar.
Rådatasombehövsfördeninitialasignalprocessningenarkiverasej.
SvarstiderNGS-baseraddiagnostik
Arbetsschemat för NGS-baserad diagnostik innebär att 1 analys utförs per vecka på
bestämdadagar,därvarjelab-ochdataanalystar3-4arbetsdagarianspråkefteratt
DNAfråntumörvävnadankommittillavdelningen.
Referenser
1. MiettinenMM,CorlessCL,Debiec-RychterM,etal.Gastrointestinalstromal
tumours.In:FletcherCDM,BridgeJA,HogendoornPCW,MertensF(Eds.)WHO
ClassificationofTumoursofSoftTissueandBone.Lyon:IARCPress,2013,pp.
164-167.
2. PovedaA,GarciádelMuroX,López-GuerreroJA,etal.GEIS2013guidelinesfor
gastrointestinalsarcomas(GIST).CancerChemotherPharmacol2014;74:883898.
3. EmileJF,BrahimiS,CoindreJM,etal.FrequenciesofKITandPDGFRA
mutationsintheMolecGISTprospectivepopulation-basedstudydifferfrom
thoseofadvancedGISTs.MedOncol2012;29:1765-1772.
4. SilvaM,VeigaI,RibeiroFM,etal.Chromosomecopynumberchangescarry
prognosticinformationindependentofKIT/PDGFRApointmutationsin
gastrointestinalstromaltumors.BMCMedicine2010;8:26.
5. Casali PG. Successes and limitations of targeted cancer therapy in
gastrointestinal stromal tumors. Prog Tumor Res 2014;41:51-61.
7
