EKOLOGI
MILJÖ OCH
GEOVETENSKAP
MIKROBIOLOGISK UNDERSÖKNING OCH
KEMISKA ANALYSER AV LIVSMEDEL
Schema för mikrobiologisk undersökning av livsmedel
Dag 1
Principer för bakteriologisk undersökning av livsmedel
Ansättning
Dag 2
Avläsning
Konfirmering
Dag 3
Avläsning
Konfirmering
Dag 4
Avläsning
Konfirmering
Redovisning
2
ANSÄTTNING AV LIVSMEDEL, EX. FALUKORV
MATERIAL
10 g prov
90 ml peptonvatten i flaska
Steril plastpåse
Spädningsrör med 9 ml peptonvatten
Sterila petriskålar
Smält TGE-agar
Färdiga blodagarplattor
Smält VRG-G-agar (gjuts i 2 lager)
ETGP-platta/or
Bacillus cereus-platta/or
SFP-platta (gjuts i 2 lager)
Skål med 70 % etanol
Rackla
Pipetter (sterila)
UTFÖRANDE
Väg upp 10 g (1 decimal) prov i en steril plastpåse. Tillsätt 90 ml peptonvatten i plast-påsen.
Kör i stomacher 1 minut så att provet homogeniseras. Detta blir spädning 1:10. Vi kallar den
1, dvs. första spädningen. Gör därefter en spädningsserie i provrören genom att ta 1 ml
direkt ur plastpåsen (spädning 1, till första spädningsröret. Du gör då åter igen en 1:10
spädning och får som resultat spädning 1:100, dvs spädning 2. Byt pipett och fortsätt
likadant i alla rör. OBS! Byt pipett mellan varje rör och var noga med att alltid bränna av
pipetten.
Man får aldrig blåsa ur en pipett med munnen.
OBS! MÄT pH FRÅN SPÄDNING 1.
3
DETTA ÄR ENDAST ETT EXEMPEL
Märk upp plattor enligt spädningsschema sid 5 och 6.
PLATTORNA
Av de odlingssubstrat som används här är fyra av substraten färdiggjutna:
ETGP (för Staphylococcus aureus)
Cereus (för Bacillus cereus)
SFP (för Cl. perfringens)
Blodagarplattor ( hämolyserande bakterier och typ av bakterieflora)
Två substrattyper gjuter du själv vid ansättningen:
TGE (för Totalantal)
VRG-G (för Enterobacteriaceae +37° och E-coli +44° C).
Två av substraten skall gjutas i två lager:
VRG-G (för Enterobacteriaceae +37°, E-coli +44°)
SFP (för Clostridium perfringens) OBS! SFP-plattan är redan gjuten ett lager när du får den.
Lager två görs av lab.personal.
När du gjuter plattorna observera att agarlagret inte får vara för tunt utan gjut minst ett 5
mm tjockt lager så att inte agarn torkar. Detta är gäller framförallt TGEplattorna (för
totalantal) eftersom de skall vara i odlingsskåp under 3 dygn.
4
TOTALANTAL (TGE) OCH ENTEROBACTERIACEAE +37° OCH E-COLI +44° (VRG-G)
Tag 1 ml ur resp spädningsrör och överför till den uppmärkta plattan. Gjut därefter över med
"handvarm" agar och blanda in provet ordentligt. Du skall använda TGE-agar till totalplattorna och
VRG-G agar till Enterobacteriaceae +37° och E-coli +44°-plattorna (gjuts i två lager).
BACILLUS CEREUS, STAF (ETGP) OCH CL. PERFRINGENS (SFP), BLODAGARPLATTOR
Tag endast o,1ml ur respektive spädningsrör och överför till den uppmärkta färdiggjutna plattan.
Ex: för att få spädning 3, tar du 0.1 ml ur spädningsrör 2 och överför till den uppmärkta plattan.
Sprid provet över agarytan med hjälp av steril rackla genom att doppa racklan i sprit, bränn av
försiktigt och låt den svalna. Snurra sedan plattan medan du håller racklan mot agarytan. Försök att
få spridningen jämn över plattan.
INKUBERING
Ställ in alla plattor i termostat 30°, 37° eller 44° (s 5-6).
OBS! SFP-plattan skall gå anaerobt över natten, så att den kommer att samlas in och ställas i en
anaerobklocka. Se till att alla plattorna är ordentligt märkta med namn eller gruppnummer. Märk
plattorna i bottnen där agarn finns. Plattorna inkuberas upp- och nedvända.
ANVISNINGAR FÖR SPRIDNING AV LIVSMEDEL (spädningsschema)
VÄRMEBEHANDLADE PRODUKTER ex falukorv
Totalantal:
Hämolyserande:
Enterobacteriaceae:
E-coli:
Staphylococcus aureus:
Bacillus cereus:
Anaeroba sporbildare:
TGE-agar, 3 dygn +30° C
Spädningar: 3,4,5,6.
Blodagar, 2 dygn +37° c
Spädningar: 2,3,4.
VRG-G agar, 1 dygn +37° C
Spädningar: 2,3,4.
VRG-G agar, 1dygn +44° C
Spädning: 1,2.
ETGP-agar, 2 dygn +37° C
Spädning: 2.
Cereus-platta, 2 dygn +30° C.
Spädning: 2.
SFP-agar, 2 dygn +37° C (anaerobklocka).
Spädning: 3.
5
RÅA KÖTTPRODUKTER ex fläsk II, fett fläsk, nöt III
Totalantal:
TGE-agar, 3 dygn +30° C
Spädningar: 4,5,6,7.
Hämolyserande:
Blodagarplatta , 2 dygn +37° C
Spädningar: 3,4,5.
Enterobacteriaceae +37°C:
VRG-G agar, 1 dygn +37° C
Spädningar: 3,4.
E-coli +44°C:
VRG-G agar, 1 dygn +44° C
Staphylococcus aureus:
Spädningar: 2,3.
ETGP-agar, 2 dygn +37° C
Spädning: 3.
Bacillus cereus:
Cereus-platta, 2 dygn +30° C.
Spädning: 3,4.
Anaeroba sporbildare:
SFP-platta, , 2 dygn +37° C (anaerobklocka).
Spädning: 3.
MJUKGLASS
Totalantal:
TGE-agar, 3 dygn +30° C
Spädningar 2,3,4
Enterobacteriaceae:
VRG-G agar, 1 dygn +37° C
Staphylococcus aureus:
Spädningar 1,2,3
ETGP-agar, 2 dygn +37° C
Spädningar 2
Bacillus cereus:
Cereus-platta, 2 dygn +30° C.
Spädningar 2,3,4,5
6
AVLÄSNING OCH KONFIRMERING
Totalantal aeroba bakterier
Alla bakterier räknas, oberoende av färg och form. Räkna platta med koloniantal mellan 30 och 300.
Om det inte finns någon platta där antal kolonier ligger mellan 30-300 så får ni räkna på den platta
där tillväxt finns. Använd lupp.
Blodagarplatta
Ger upplysning om antal och typ av eventuellt förekommande aeroba hemolyserande (ev patogena)
bakterier samt en orientering om mikroflorans sammansättning i övrigt. Den kunnige mikrobiologen
kan skilja patogena bakterier från icke patogena och genom att avläsa blodplattan "parallellt" med de
selektiva substraten kan olika bakteriearter urskiljas, t.ex. S. aureus, B. cereus, ß-hemolyserande
streptokocker. Betrakta och begrunda plattan. Eventuellt kan "misstänkta" kolonier gramfärgas.
Enterobacteriaceae + 37° C
Alla rosa till röda kolonier räknas. Räkna platta med koloniantal mellan 15 och 150. Om det inte finns
någon platta där antal kolonier ligger mellan 15-150 så får ni räkna på den platta där tillväxt finns.
Konfirmering: Fem kolonier med ovanstående kriterier uppfyllda överförs till en blodagarplatta.
Inkubera i 37° C i 1 dygn.
Konfirmera med oxidastest. Enterobakteriaceae är oxidasnegativa.
Ingen färgförändring på stickan- oxidasenegativ
Om blå färg på stickan – oxidaspostiv- ingen enterobakteriaceae
E-coli +44° C
Alla rosa till röda kolonier räknas. Räkna platta med koloniantal mellan 15 och 150.
Om det inte finns någon platta där antal kolonier ligger mellan 15-150 så får ni räkna på den platta
där tillväxt finns.
Fem kolonier med ovanstående kriterier uppfyllda överförs till var sitt förvärmt
laktostryptofanbuljongrör (LTB) och inkuberas i 1 dygn i + 44° C.
Läs av rören: Notera alla rör med gasbildning. Konfirmera dessa rör med indoltest.
Håll till i dragskåp och använd hanskar.
Indoltest: Tillsätt 0,5 ml Kovac´s reagens till rör med gasbildning.
Om det bildas en röd ring – E-coli
7
Staphylococcus aureus
För att preliminärt bedömas som S. aureus skall kolonierna uppfylla fyra kriterier:
1.
svart färg
2.
inre grumlig zon
3.
yttre klar zon
4.
kolonierna är oljeskimrande
Konfirmering: Fem kolonier som uppfyller ovanstående kriterier stryks på en blodplatta som
inkuberas ett dygn i 37° C. Kolonierna testas sedan på koagulasbildning
(Se separat metodbeskrivning). Jämför med blodplatta.
Bacillus cereus
Stora ojämna, skära kolonier med en oregelbunden kant omgivna av en bred skär precipitationszon
bedöms som Bacillus cereus.
Konfirmering: Gramfärga samt jämför med blodplatta
Clostridium perfringens
Svarta kolonier omgivna av en grumlig utfällningszon bedöms preliminärt som Cl. perfringens.
Konfirmering: Fem kolonier konfirmeras på två blodplattor, som inkuberas aerobt respektive
anaerobt ett dygn i 44° C. Cl. perfringens växer med stora genomskinliga kolonier med oregelbunden
kant och dubbla hemolyszoner. De växer endast på den anaeroba plattan.
BEDÖMNING
Se (EG) 2073 Mikrobiologiska kriterier för livsmedel
Vägledning: Livsmedelsprovtagning i offentlig kontroll och mikrobiologisk bedömning av
livsmedelsprov.
Resultat, Bakteriologisk undersökning
Provtyp:
Ditt resultat:
Totalantal aeroba bakt. 30°C 3 dygn
log ant/g
Enterobacteriaceae 37°, 2 dygn
log ant/g
E-coli 44°C, 2 dygn
log ant/g
Staphylococcus aureus 37°C, 2 dygn
log ant/g
Bacillus cereus 30°, 2 dygn
log ant/g
Clostridium perfringens 44°C, 2 dygn
log ant/g
pH
8
SUBSTRATFÖRTECKNING
Blodagarplatta:
Innehåller BAB (Blood agar base) och 5-10 % nötblod.
Substratet används bl a för att studera hemolysformer.
alfa- hemolys: ej fullständig uppklarning i substratet,
grönskimrande
beta- hemolys: fullständig uppklarning i substratet
gamma- hemolys: ingen uppklarning i substratet
Cereus-platta:
Cereus Selective Agar by Mossel, innehåller bl a fenolrött och
mannitol. Vid gjutning tillsätts polymyxin-B-sulfat och
äggula.Specialsubstrat för Bacillus Cereus
Fenolrött - indikator, röd i basisk miljö, gul i sur
Mannitol - bryts ned av vissa bakterier till sura produkter.
Bacillus Cereus är mannitol-negativt (bryter ej ned
mannitol)
Polymixin-B-sulfat - antibiotika som hindrar växt av andra
bakterier
Äggula - medför att substratet blir ogenomskinligt. Bacillus
Cereus producerar lecitinas. Nedbrytningsprodukter av
lecitin i substratet bildar utfällningszoner runt kolonierna, s k
egg-yolk reaction.
ETGP-platta:
Baird-Parker medium, innehåller bl a glycin, litiumklorid
och pyruvat. Vid gjutning tillsätts kaliumtellurit och äggula.
Specialsubstrat för Staphylococcus aureus
Glycin och pyruvat - stimulerar tillväxt av stafylokocker
Kaliumtellurit och litiumklorid - hämmar växt av övriga
bakterier. Tellurit reduceras av stafylokocker till tellur
som är svart
Äggula - medför att substratet blir ogenomskinligt.
Bakterier som bryter ned fett och proteiner bildar karaktäristiska utfällnings- och uppklarningszoner runt kolonierna i substratet, s k egg-yolkreaction.
SFP-platta:
Shahidi-Ferguson Perfringens agar, innehåller bl a järnammoniumcitrat och natriumdisulfit. Vid gjutning tillsätts
D-cykloserin och äggula. Specialsubstrat för Clostridium
perfringens.
D-cykloserin - antibiotika som hindrar växt av andra
bakterier
Järnammoniumcitrat - järnet reduceras och bildar järnsulfid som är svart.
Äggula - medför att substratet blir ogenomskinligt. Fettnedbrytande bakterier bildar utfällningszoner runt kolonierna
i substratet s k egg-yolk reaction
LTB-buljong:
Selektivt medium som används som presumtivt test för coliforma bakterier. Innehåller
laktose, trypton, lauryl sulfat.
o
Vid konfirmering av misstänkt e.coli odlas provet i LTB-buljong 1 dygn +37 .
Om det bildats gas i durhamröret tillsätts 0,5 ml Kovac’s indolreagens till buljongen. Om det
är positiv reaktion så färgas den överförda indolen rosaröd. Detta innebär att det är e.coli.
9
Näringsvärdesberäkning av korv
Syfte:
Bestämma vatten- och askhalt, fett och protein genom kemiska analyser. Halten kolhydrater
är den mängd som kvarstår när man har dragit bort vattenhalt, aska, fett och protein.
Samtliga värden ska redovisas och jämföras med innehållsförteckningen.
Provberedning:
•
Dela upp 250 g korv (ca 1 dm) i mindre bitar och anteckna om det är ändbit eller
mittbit.
•
Homogenisera provet i matberedare.
•
Överför homogenatet till en honungsburk.
•
1 burk/2 grupper
•
Förvara provet i kylskåp.
•
Använd samma våg för samtliga vägningar.
Schema
Dag 1
Vatten-, ask-, fett- och proteinhalt
Dag 2
Vatten-, ask-, fett- och proteinhalt
Dag 3
Fett- och kolhydrathalt
Förberedelser för laborationsredovisning
Dag 4
Redovisning av kemlaborationer
•
Fakta om näringsämnet; kemiskt, näringsförändringar vid tillagning och förvaring
samt näringsrekommendationer.
• Beskriv analysmetoden schematiskt och beskriv teorin bakom samt ange eventuella
för- och nackdelar med metoden.
• Kort om alternativa analysmetoder och deras för- och nackdelar.
• Ange max, medel, median och minvärden för näringsämnet samt ange eventuella
felkällor.
Redovisa med PP i 10 min
10
Bestämning av vattenhalt i korv
DAG 1
1. Väg en märkt, torkad aluminiumdosa med lock och anteckna vikten.
OBS! Ta inte i dosan med fingrarna. Använd tång eller papper.
2. Placera botten av dosan på vågen och nollställ.
3. Väg in ca 2-3 g korvhomogenat med 3 decimalers noggrannhet. Anteckna
korvhomogenatets vikt.
4. Bred ut provet över botten.
5. Placera aluminiumdosan med locket under dosan i värmeskåpet över natten i 100105oC.
DAG 2
6. Provet tas ut med tång/pappershandduk och locket sätts på. Låt svalna i exsickator.
7. Aluminiumdosan med lock och prov vägs.
8. Låt inte provet stå för länge iom att fettoxidation kan ske.
9. Provets vattenhalt i anges i % samt i g/100g korv med en decimals noggrannhet.
Vattenhaltsbestämning
Provslag
___________________________
Al-dosa inkl.lock väger
___________________________g
Provmängd
___________________________g
Al-dosa inkl.lock + prov efter torkning
___________________________g
Vattenhalt
___________________________g
Vatten
___________________________g/100g livsmedel
11
Bestämning av askhalt i korv
Askhalt är halten icke förbränningsbart material som mineralämnen och salter.
DAG 1
1. Använd alltid en tång eller papper när du tar i degeln.
2. Väg den torkade degeln, anteckna vikten och nollställ sedan vågen.
3. Väg in ca 5-6 g korvhomogenat med 3 decimalers noggrannhet. Anteckna vikten.
4. Ställ degeln på ett rutmärkt papper bredvid den elektriska ugnen.
Notera numret för er ruta. Lab.ass ställer sedan in samtliga deglar i ugnen och detta
förbränns över natt i 550oC.
DAG 2
5. Askan ska vara vit eller ljust grå när alla kolpartiklar är förbrända.
6. Degeln får svalna i exsickator i ca 30 minuter. Degel och prov vägs.
7. Provets askhalt anges i g/100g korv med en decimals noggrannhet.
Askbestämning
Provslag
____________________________
Degelns vikt
____________________________g
Provmängd
____________________________g
Degel + inaskat prov väger
____________________________g
Askmängd
____________________________g
Askhalt
____________________________g/100 g livsmedel
12
Bestämning av fetthalt i korv
DAG 1
1. Lägg en liten bit aluminiumfolie på vågskålen och nollställ vågen.
2. Väg ca 2 g korvhomogenat på aluminiumfoliet med 3 decimalers noggrannhet.
Anteckna vikten.
3. Vik ihop aluminiumfolien med korvhomogenatet och för ner den i botten på oströret, utan
att det blir smet på rörets vägg.
Arbeta i dragskåp med skyddsglasögon.
4. Överför med pipett 10 ml 7,7 M saltsyra till provet. Försiktigt, på grund av häftig reaktion
mellan syra och aluminium.
5. Märk röret och värm provet i 80-gradigt vattenbad under 1 h. Skaka provet då och då för
att påskynda reaktionen.
6. Låt provet svalna i ett par minuter.
7. Pipettera över 10 ml etanol till oströret (sänker ytspänningen).
8. Sätt på en kokad kork och blanda försiktigt.
9. Kyl oströret under rinnande vatten.
10. Använd mätglas och tillsätt 25 ml dietyleter till oströret.
11. Sätt på korken igen och vänd den upp och ner.
12. Lätta på korken och upprepa proceduren tills det slutar pysa.
13. Skaka röret kraftigt.
14. Använd mätglas och tillsätt 25 ml petroleumeter till oströret.
15. Vänd oströret upp och ner c 20 ggr.
16. Blandningen får separera över natt, så att eterskiktet blir klart. Låt stå i dragskåp.
17. Märk en 150 ml E-kolv och lägg i 5 st kokstenar och torka denna över natt vid 105 oC.
Ta inte i E-kolven med fingrarna efter torkning.
13
DAG 2
18. Väg E-kolven med 3 decimalers noggrannhet. Anteckna vikten.
19. Dietyl/petroleumskiktet häverteras ner i E-kolven tills att det återstår 3 cm av
dietyleter/petroleumeterfasen i oströret.
20. Mellan häverteringarna ställs E-kolv med dietyletern/petroleumetern på varmt
vattenbad för att dietyleter/petroleumeter ska avdunsta.
21. Använd mätglas och tillsätt 30 ml dietyleter/petroleumblandning till lösningen i oströret.
Vänd oströret 2 ggr och hävertera eterfasen efter 1 timme, så att 3 cm av
dietyleter/petroleumetern kvarstår.
22. Använd mätglas och tillsätt ytterligare 50 ml dietyleter/petroleumeterblandning till
oströret.
23. Röret skakas.
24. När dietyleter/petroleumeterfasen är klart häverteras dietyleter/petroleumskiktet
återigen på samma sätt som tidigare.
25. Då sista häverteringen gjorts, får E-kolven dietyleter/petroleumeter avdunsta till dess
att lukten är borta.
25. Kolven ställs sedan in i 105oC värmeskåp under natten. Sköts av personal.
14
DAG 3
26. Avsvalning av E-kolv, sker i exsickator.
26. E-kolven vägs och vikten antecknas.
27. Provets fetthalt beräknas och anges i g/100g korv med en decimals noggrannhet.
Fettbestämning enligt SBR
Provmängd
_____________________________g
Kolvens vikt
_____________________________g
Kolv + fett väger
_____________________________g
Fettmängd
_____________________________g
Fettmängd
_____________________________g/100 g livsmedel
Fetthalt enligt innehållsdeklaration
_____________________________g/100 g livsmedel
15
Bestämning av proteinhalt i korv
Teori för Kjeldahlmetoden:
1. Förbränning: Homogeniserad korv kokas i koncentrerad svavelsyra, då kväve bildar
en ammoniumsulfatlösning.
2. Destillation: Överskott av NaOH tillsätts för att omvandla ammoniumsulfat till
ammoniak. När ammoniak destilleras över till förlaget med indikatorer kommer det
ske en färgförändring från grått till grönt.
3. Titrering av ammoniak med saltsyra. När all ammoniak har reagerat med saltsyra
kommer indikatorn att ändra färg till grått.
DAG 1
Förbränning
1. Ta en liten bit aluminiumfolie och nollställ vågen.
2. Väg upp 1 g korvsmet med 3 decimalers noggrannhet.
Korvens vikt_________g
3. Överför det aluminiumtäckta provet till uppslutningsröret.
4. Tillför
1 Kjeltablett med pincett
5 ml 0,1 M CuSO4/kopparsulfat med pipett
16
Labbassistenten gör följande:
5. Tillsätter 15 ml konc H2SO4/svavelsyra med pipett i dragskåpet med förbränningsblocket.
6. Ställer ner rören i förbränningsblocket (c 420oC) för våtföraskning i 3 timmar.
DAG 2
Destillation
7. Uppslutningsröret sätts fast i destillationsapparaten (Kjehldahl).
8. Pipettera 25 ml av indikatorlösningen till E-kolv/förlaget.
8. E-kolv med indikatorlösningen placeras på plattan och programmet sätts igång.
9. Programmet kommer att späda provet med 80 ml vatten och tillsätta 50 ml 40% NaOH.
10. Destillationen kommer att ske under 4 minuter och förlaget kommer att skifta från grått
till grönt när ammoniak (alkalisk) destilleras över.
17
Titrering
1. Fyll byretten med 0,1 M (mol/dm3) HCl.
2. Tillför en magnetloppa till E-kolven med förlaget.
3. Titrera droppvis ned HCl i E-kolven under omröring.
4. Anteckna volymen HCl som har gått åt när lösningen fått grå färg.
5. Gör beräkningar av mängden protein i provet i procent samt protein/100 g livsmedel.
6. Beräkna sedan andel kolhydrater i g/100g eller i procent genom att dra bort vatten- ,
ask-, protein- och fetthalt från den totala vikten av korvhomogenatet.
OBS! Första gruppen titrerar ett blankprov som har genomgått våtaskning och destillation,
men saknar prov. Den volym saltsyra som åtgår vid denna titrering dras ifrån den mängd
saltsyra som åtgår vid titrering av proverna.
18
Tips för att du lättare ska kunna räkna ut proteinhalten i korven:
Tips 1: antalet mol N (kväve) = antalet mol HCl (titrerad)
n (mol) = V (dm3) x C (mol/dm3)
Tips 2: Hur många gram är x mol N? m (g) = n (mol) x Mw (g/mol)
Tips 3: 1 g kväve (N) = 6,25 g protein
Uträkning av näringsvärde enligt recept på falukorv
Råvara
Vatten/is
Nöt III
Fläsk II
Fläsk IV
Kryddor
Nitrit
Potatismjöl
Beräknad
Total mängd
Vikts %
Total energi
Energi %
Vikt
(kg)
9,1
6,0
3,7
4,7
0,17
0,4
0,9
vikt
och
24,97
_
Vatten
(vikt %)
100
60
60
25
Fett
(vikt %)
Protein
(vikt %)
23
23
67
17
16
7
Kolhydrat
(vikt %)
78
20
energi
Energiprocent (E%) = energin från ett näringsämne
x
total energimängden i livsmedlet
1 g fett = 9 kcal/ 37 KJ
1 g protein/kolhydrat = 4 kcal/ 17 KJ
80
100
19
