Linnéa Larsson
Att locka på en cell - kan den hitta rätt utan PI3K?
Vid inflammation spelar de vita blodcellernas förmåga att migrera till inflammationscentret en viktig roll. Immuncellerna kan migrera åt rätt håll eftersom de känner av en
koncentrationsgradient av vissa ämnen – kemoattraktanter – som utsöndras från inflammationscentret. Denna del av migrationen kallas kemotaxi. En annan viktig del i
migrationsprocessen är adhesionen, då immuncellerna binder, adhererar, till blodkärlsväggen. Adhesionen krävs för att cellerna ska kunna ta sig ut från blodet till vävnaden.
Utvärdering av kemotaxiplattor
Ett sätt att analysera cellers förmåga till kemotaxi är att låta dem ta sig igenom ett
membran med små porer i, ner mot en brunn fylld med kemoattraktantlösning. En viss
koncentration av kemoattraktanten ger upphov till den maximala responsen, då flest
celler migrerar. Cellerna färgas in så att de fluorescerar och efter migrationsförsöket
läses plattan av med en fluorescensmätare. På så vis fås en uppskattning av mängden
celler som migrerat över membranet. Syftet med denna del av examensarbetet var att
med hjälp av två humana cellinjer utvärdera tre olika sorters kemotaxiplattor som skiljde
sig åt i sina filtersystem: NeuroProbe ChemoTx, Millipore MultiScreen MIC och BD
Falcon HTS Fluoroblok. För att se ifall själva infärgningen påverkar cellernas migrationsförmåga utvärderades även cellinfärgning efter migration och jämfördes med
cellinfärgning före migration.
NeuroProbe ChemoTx-plattorna med ett platt filtersystem gav bäst resultat, med låg
bakgrund och hög maximal respons och reproducerbarhet. Millipore MultiScreen MICoch BD Falcon Fluoroblok-plattorna gav väsentligt högre bakgrund och hade lägre
reproducerbarhet. Infärgningen verkade inte påverka cellernas kemotaxirespons, då den
maximala responsen var den samma för ofärgade och färgade celler.
Kinasers roll i kemotaxi och adhesion
Fosfoinositid-3-kinaser (PI3K:s) är enzymer som tros medverka i vita blodcellers
migration och aktivering. Särskilt en typ av PI3-kinaser, PI3Kγ, misstänks spela en
central roll i just kemotaxi. Syftet med denna del av projektet var att, med hjälp av den
humana cellinjen U937-monocyter, försöka klargöra PI3K:s och PI3Kγ:s roller i
kemotaxi- och adhesionsresponsen. Dels inhiberades PI3K med PI3K-inhibitorn
LY294002, som slår ut PI3K:s funktion, dels fördes så kallade siRNAs, short interfering
RNAs, in i cellerna för att selektivt ”tysta ner” uttrycket av PI3Kγ, så att syntetiseringen
av PI3Kγ-protein stoppades. Detta visar först ifall PI3-kinaser krävs för kemotaxi- eller
adhesionresponsen och därefter om just PI3Kγ är nödvändig för någon av responserna.
Försöken visade att PI3-kinaser spelar en partiell roll i signaleringen av kemotaxi- och
adhesionsresponser i U937 celler. Dock påverkade inte en 50 procentig minskning av
cellernas PI3Kγ-protein vare sig deras adhesions- eller kemotaxirespons. Resultaten
pekar på att även andra typer av PI3-kinaser troligen krävs för att signalera maximala
adhesions- och kemotaxiresponser hos humana monocyter. Det är i sökandet efter nya
sätt att förstå och behandla svåra inflammatoriska sjukdomar som man riktar in sig på
de proteiner och mekanismer som är inblandade i rekryteringen och aktiveringen av
inflammatoriska celler.
Handledare: Katarina Walles och Tim Stevens
Examensarbete 20 p i farmakologi. Vt 2004
Institutionen för cell- och organismbiologi, Lunds Universitet
AstraZeneca R&D, Lund
Evaluation of chemotaxis assays
Linnéa Larsson
M.Sc. diploma paper in pharmacology
Winter 2003
Supervisor Katarina Walles
Biological Sciences
AstraZeneca R&D, 221 87 Lund
Contact person Leif Bjellin
Department of Cell and Organism Biology
Lund University, 22362 Lund
Abstract
Chemotaxis is the movement of cells in response to a concentration gradient set up by a
chemoattractant. Chemotaxis assays are designed to mimic the process of chemotaxis in an in
vitro system. Thus, it is crucial that a chemotaxis assay is accurate and reproducible, but it is also
important that it is practical. Therefore, in this study I have evaluated three commercially
available chemotaxis plates- including the NeuroProbe ChemoTx plate, the Millipore
MultiScreen MIC plate and the new BD Falcon HTS Fluoroblok plate. The cell lines used for the
assays were THP-1 and AML14.3D10 cells which represent convenient cell models for the study
of human monocytes and eosinophils respectively. Experiments evaluating the effects of cell
concentration, incubation time and labelling technique were performed in order to optimise an
assay for each type of plate. Results from the evaluation of the Millipore MultiScreen MIC plate
showed that the best data was achieved when a high cell concentration was used, and that this
type of plate could be of further use. The BD Falcon HTS FluoroBlok plates also produced
promising data when using the THP-1-cells, but the best results were generated with the
NeuroProbe plate, since it was found to give good and reproducible maximal response data.
Finally, the use of a new labelling technique, where cells were labelled following instead of prior
to cell migration, was shown to be impractical since it extended the time of the assay by several
hours.
