Ny faecesdiagnostik med PCR
Arne Kötz
Klinisk mikrobiologi och vårdhygien
Region Halland
2010-04-22
Prover Halland 2010
Allmän bakterieodling
Odling-Pinnprov
6 000 prover/år
Parasit
Mikroskopi-Behandlad faeces
1 000 prover/år
Clostridium difficile
Antigen-Faeces
2 000 prover/år
2010-04-22
Calicivirus
PCR-Faeces
1 000 prover/år
Rota/Adenovirus
Antigen-Faeces
200 prover/år
Mål
Enhetlig diagnostik:
• skapa ett gemensamt flöde för alla prover med diarréfrågeställning (Bakterier, parasiter och virus).
• ge möjlighet att kombinera analyser utifrån klinisk bild
samt att gå vidare med samma prov om primär
frågeställning blir negativ.
Bakterier
Virus
Parasiter
2010-04-22
Metodval - PCR
• Finns metoder för alla smittämnen
• Bra sensitivitet/specificitet
• Automatisering
• Rimlig kostnad
• Kort analystid
2010-04-22
FaecesPCR 2011/2012
100 faecesprover med Baktfrågeställning per månad under ett år
PCR-metoder mot 16 olika smittämnen; bakterier, virus och
parasiter
Upparbeta samtliga prover med gemensamt protokoll
Påvisade mikroorganismer
Bakterier
Virus
Parasiter
EAEC
ETEC
EHEC
Shigella/EIEC
Salmonella enterica/bongori
Campylobacter jejuni/coli
Yersinia enterocolitica
Clostridium difficile
Norovirus G1
Norovirus G2
Sapovirus
Rotavirus
Astrovirus
Cryptosporidium parvum/homini
Dientamöba fragilis
Giardia intestinalis
16 targets + IAK och 1 136 prover -> 19 312 datapunkter
Andel positiva analyser
• 548 av 1136 positiva för minst ett smittämne (48 %)
• 23 % av positiva prover multipelpositiva
• 1.1 % inhibition primärt, 0.3 % inhib efter spädning
12,0%
10,0%
8,0%
6,0%
4,0%
2,0%
0,0%
Smittämnen utland
323 utland
153 ej utland
660 ingen information
30%
25%
20%
15%
•
Utlandsassocierade
•
•
•
•
•
•
EAEC
CAMP
ETEC
SALM
GIA
SHIG
•
Ej utlands-associerade
•
•
•
•
•
DIE
NOR2
CDF
SAP
ROT
10%
5%
0%
Utland
Ej utland och "vet ej"
Diarrédiagnostik
• Hälsokontroll
Campylobacter, Salmonella, Shigella/EIEC, EHEC, Yersinia,
• Inhemsk smitta
Hälsokontroll plus Dientamöba, Cryptosporidium, Giardia.
• Utlandssmitta
Inhemsk smitta plus EAEC, ETEC och Entamöba histolytica.
1
2
3
4
Salm
Camp
IAK
Crypto
Dient
Giardia
EHEC
Yersinia
Shig/EIEC
E. hist
EAEC
ETEC
Virus och Clostridium
• Upparbetas med samma protokoll men
separata beställningar på remiss
• Annan epidemiologi:
– Virus vårdrelaterad spridning
– Clostridium antibiotika-associerad
2010-04-22
Sedan började diskussionerna…
• Alldeles för mycket att hantera för kliniska kollegor?
Vill man veta det här? Gör man patienterna oroliga?
• Merarbete för infektionsläkare? ”Ska man behandla
den här?”
• Klinisk relevans av vissa agens? Tveksamhet efter
Dientamoeba-”utbrottet” i Jönköping.
• Bärarskap eller missat tidigare?
• Rätt att anmäla PCR-fynd enligt SmL?
2010-04-22
Klinisk relevans av vissa agens? Tveksamhet efter
Dientamoeba-”utbrottet” i Jönköping.
Vår sammanfattning av litteraturgenomgången:
•
”…if Dientamoeba is detected in a symptomatic patient
in the absence of any other pathogen, Dientamoeba
must be regarded as the cause of illness and the
patient should undergo appropriate treatment.”
Barett et al. Review i Gut Microbes feb 2011
2010-04-22
Bärarskap eller missat tidigare?
PCR mot odling
9,0%
8,0%
Andel pos
7,0%
6,0%
5,0%
4,0%
3,0%
2,0%
1,0%
0,0%
PCR%
Odling%
CAMP
7,9%
6,4%
SALM
3,1%
2,6%
EHEC
1,6%
0,6%
SHIG/EIEC
1,3%
0,4%
YER
0,5%
0,2%
Dessutom:
undersökningar från olika ställen från faeces: mycket olika kvantiteter av organismer
Sedan började diskussionerna…
• Alldeles för mycket att hantera för kliniska kollegor?
Vill man veta det här? Gör man patienterna oroliga?
• Merarbete för infektionsläkare? ”Ska man behandla
den här?”
• Klinisk relevans av vissa agens? Tveksamhet efter
Dientamoeba-”utbrottet” i Jönköping.
• Bärarskap eller missat tidigare?
• Rätt att anmäla PCR-fynd enligt SmL?
2010-04-22
Och den gamla hederliga parasitmikroskopin
(”cystor och maskägg”)?
• behövs inte för cystor längre:
de relevanta finns med i PCR-diagnostiken
• behövs knappt för maskägg:
i genomsnitt 1 positivt fynd per år!
2010-04-22
FLÖDE
• DAG 0: Provsättning
• DAG 1: Extraktion, PCR och svar
• DAG 2-4: Odling, serotypning, RES
Provupparbetning
•
•
•
•
•
•
2010-04-22
Slamma faeces i E-svab transportmedium (1 mL)
Vortex 1 minut
95°C 10 minuter
100 µL till easyMag Lysbuffert (BioMerieux)
10 µL Salmonella anrikningsbuljong
Extraktion Generic Protocol easyMag
QiaSymphony
Klarar komplex pipettering till PCR
Mindre ”hands on”
Mål tvåvägs kommunikation med LIS
(arbetslista och resultatrapportering)
2010-04-22
QiaSymphony protokoll
•
•
•
•
•
•
•
2010-04-22
Slamma Faeces i 1.2 mL Lysbuffert (BioMerieux)
Vortex 15 minut
-20°C över natt
50 µL Salmonella anrikningsbuljong
Centrifugera 3500 rpm 10 minuter
Extraktion/pipettering QiaSymphony
PCR RotorGeneQ
PCR-styrd odling
•
•
•
•
•
Inhemska Salmonella
Shigella/EIEC
EHEC
Yersinia
Inneliggande Campar
Targets
Referens
Target
Kommentar
Salmonella
Malorny et al. App Env Mic. 2004. 70:7046
ttrBCA (k)
Väl validerat. Täcker S. enterica och S. bongori.
Shigella/EIEC
Väl validerad. Täcker alla fyra arter av Shigella samt EIEC.
Campylobacter jejuni
Thiem et al. J Clin Mic. 2004. 42:2031
ipaH (p)
Best. FEMS let. 2003. 229:237. de Boer et al. J Clin Mic. 2010.
48:4140
mapA
Campylobacter coli
Best. FEMS let. 2003. 229:237.
ceuE
Väl validerat av Best.
EHEC
Chui et al. J Mol Diag. 2010. 12:469
stx1 och stx2 (k)
Väl validerad. Jämfört olika PCR-metoder.
Yersinia enterocolitica
Lambertz et al. App Env Mic. 2008. 74:6060
ail (k)
Väl validerad. Täcker Y. enterocolitica associerad med human sjukdom.
EAEC
Hardegen et al. Clin Mic and Antimic. 2010. 9:5
aatA på pCVD432 (p) pCVD bästa markör men inte så många studier. Påvisar "typical" EAEC.
ETEC
Hardegen et al. Clin Mic and Antimic. 2010. 9:5
ST och LT (?)
Väl etablerade markörer.
Cryptosporidium
Bruijnesteijn van Coppenraet et al. CMI. 2009. 15:869
452 bp fragment
Etablerad markör. Validerad mot TFT (triple faecal test), bättre än mikroskopi men få positiva
Entamoeba histolytica
Verweij et al. J Clin Mic. 2004. 42:1220
ssu rDNA
Etablerad markör. OK validerad. Amplifierar histolytica och dispar, proben histolytica-specifik.
Dientamoeba fragilis
Verweij et al. Mol Cell Probes. 2007. 21:400
5.8s rDNA
Etablerad markör. Väl validerad mot TFT (triple faecal test) av Bruijnesteijn 2009.
Giardia intestinalis
Verweij et al. J Clin Mic. 2004. 42:1220
ssu rDNA
Väl validerat av Verweij 2004 och deBoer 2010.
2010-04-22
Väl validerat av Best framför allt. Proben från de Boer.
PCR-reaktioner
2010-04-22
1
2
3
4
5
C. diff
Salm
Crypt
EHEC
ETEC
Camp
Dient
Yers
EHI
EAEC
IAK
Giard
Shig
IAK
6
7
8
Rota
NorG1
Astro
NorG2
Sapo
PCR-styrd odling
Salmonella 36/36
PCR-styrd odling
EHEC 9/15
Yersinia 3/5
Shigell/EIEC 5/19
