NOVA Lite® Rat Liver, Kidney Stomach
704170
För in vitro diagnostik
Produktkod:
704170, 704180
504170.10, 504180.25
CLIA-komplexitet: Hög
Användningsområde
Denna produkt är avsedd att användas för screening och titrering av cirkulerande autoantikroppar i
humant serum som ett hjälpmedel vid diagnos och behandling av olika autoimmuna sjukdomar. De
fyra främsta autoantikropparna som detekteras är antinukleära antikroppar (ANA),
antimitokondriella antikroppar (AMA), antikroppar mot glatt muskulatur (ASMA) och antigastriska
parietalcellsantikroppar (AGPCA)
Sammanfattning och förklaring av analysen
Indirekt immunofluorescens är referensmetoden för screening och titrering av cirkulerande
autoantikroppar i humant serum. Snitt av djurvävnad, t.ex. från råtta, är generellt att föredra före
andra vanliga substrat, inklusive snitt av human vävnad och cellpreparat. Detta beror främst på
frånvaron av interferens från HLA och/eller andra blodgruppsantikroppar. Användning av tre olika
vävnader (lever, njure och mage) gör det möjligt att lättare identifiera autoantikroppar genom att
jämföra de resultat som erhålls med varje vävnad.
Specifika autoantikroppar associeras med ett antal olika sjukdomar. ANA uppträder nästan alltid
vid systemisk lupus erythematosus (SLE), men är även vanliga hos patienter med
bindvävssjukdomar och reumatoida sjukdomar. AMA finns främst vid primär biliär cirros, men kan
även påvisas hos patienter med andra leversjukdomar. ASMA är ofta associerat med kronisk aktiv
hepatit och primär biliär cirrhos, men kan även påvisas i låga koncentrationer vid flera andra
tillstånd. AGPCA uppträder i serum hos de flesta patienter med perniciös anemi. En mer ingående
beskrivning av vilka autoantikroppar som associeras med vilken sjukdom finns i avsnittet Resultat.1-9
Princip för metoden
En indirekt immunofluorescensteknik används, där patientprover och lämpliga kontroller inkuberas
med substratobjektglasen.10 De antikroppar som inte reagerat tvättas bort och sedan tillsätts ett
lämpligt fluoresceinmärkt konjugat. Obundet konjugat tvättas bort och objektglasen granskas i ett
fluorescens-mikroskop. Positiva prover ger en äppelgrön fluorescens, som överensstämmer med
de områden på preparatet, där autoantikroppar har bundit.
Reagens
1.
Preparat av råttlever, -njure och -mage på 5- eller 10-brunnars objektglas med desickant.
Reagenser som endast medföljer kit:
2.
3.
4.
Homogent ANA-mönster, positivt kontrollserum som innehåller 0,09 % natriumazid.
Färdigspätt, klart att användas.
IFA-system negativt kontrollserum som innehåller 0,09 % natriumazid. Färdigspätt, klart
att användas.
Affinitetsrenat får anti-humant IgG (H+L) fluorescein isotiocyanat (FITC) konjugat som
innehåller 0,09 % natriumazid Färdigspätt, klart att användas.
1
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Mitokondriellt AMA-mönster, positivt kontrollserum som innehåller 0,09 % natriumazid.
Färdigspätt, klart att användas.
Glatt muskulärt (ASMA)-mönster, positivt kontrollserum som innehåller 0,09 % natriumazid.
Färdigspätt, klart att användas.
1 % Evans Blue, valfri kontrastfärg
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS II), ett 40 gångers koncentrat i vätskeform
Läskpapper för att torka objektglasen efter tvättning
Monteringsmedium som innehåller ett antiblekningsagens (DABCO) 1, 4 diazabicyklo-[2.2.2]
oktan
Täckglas
Varning
Alla givare av humant serum (gäller endast kit) har testats och befunnits vara negativa för hepatit B
ytantigen, för antikroppar mot hepatit C virus och humant och immunbristvirus (HIV1 och HIV2).
Dessa test kan emellertid inte garantera frånvaron av smittämnen. Korrekt hantering och rutiner
för avfallshantering bör fastställas för alla potentiellt smittsamma material och endast personal med
fullgod utbildning i sådana metoder skall tillåtas utföra dessa procedurer.
Evans Blue och kitets kontroller innehåller 0,09 % natriumazid som konserveringsmedel och måste
hanteras med försiktighet – får inte sväljas eller komma i beröring med huden eller slemhinnor.
Skölj ordentligt med stora volymer vatten vid kontakt och uppsök läkare. Explosiva metallazider
kan bildas med bly och kopparrör; när reagens hälls ut, spola med stora volymer vatten för att
förebygga anhopning av azid. Denna produkt bör endast användas av personal med lämplig
utbildning för angivet ändamål. Det rekommenderas att metodbeskrivningen följs.
Förvaringsförhållanden
Oöppnade kit/objektglas bör förvaras vid 2-8°C och kan användas fram till angivet utgångsdatum.
DJUPFRYS INTE. När objektglasen har tagits ur folieförpackningen bör de användas omedelbart.
Utspädd PBS II-buffert kan förvaras i upp till en månad vid 2-8°C. Alla reagenser bör förvaras vid
2-8°C.
Provtagning
Blodprover bör tas i rör utan tillsatser genom venpunktion. Efter koaguleringen bör serumet
separeras snarast möjligt för att undvika hemolys. Serumet kan förvaras vid 2-8°C upp till 7 dagar
före analys11 eller vid längre förvaring, alikvoteras och förvaras vid -20°C eller lägre. Serumen får
INTE frysas och upptinas mer än en gång. Undvik att använda lipemiska, hemolyserade eller
mikrobiellt kontaminerade serumer, eftersom minskade titrar eller otydliga färgningsmönster kan
uppstå.
Metod
Material som medföljer
704170
1.
2.
3.
4.
10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (Objektglas med råttlever, -njure och råttmage,
5-brunnars)
1 x 1 mL ANA Homogeneous Pattern (prediluted) (ANA-homogent mönster, färdigspätt)
1 x 1 mL IFA System Negative Control (prediluted) (IFA-system negative kontroll,
färdigspädd)
1 x 1 mL Mitochondrial (AMA) Pattern (prediluted) (Mitokondriellt (AMA) mönster,
färdigspätt)
2
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
1 x 1 mL Smooth Muscle (ASMA) Pattern (prediluted) (Glattmuskel (ASMA) mönster,
färdigspädd)
1 x 7 mL FITC IgG (H&L) Conjugate (FITC IgC (H+L) konjugat)
1 x 3 mL 1% Evans Blue kontrastfärg
2 x 25 mL PBS II Buffert (x40 konc.)
1 x 3 mL Mounting Medium (monteringsmedium)
20 x Blotters (läskpapper)
10 x täckglas
1 x instruktionsblad
704180
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (Objektglas med råttlever, -njure och råttmage,
10-brunnars)
1 x 1 mL ANA Homogeneous Pattern (prediluted) (ANA-homogent mönster, färdigspätt)
1 x 1 mL IFA System Negative Control (prediluted) (IFA-system negative kontroll,
färdigspädd)
1 x 1 mL Mitochondrial (AMA) Pattern (prediluted) (Mitokondriellt (AMA) mönster, färdigspätt)
1 x 1 mL Smooth Muscle (ASMA) Pattern (prediluted) (Glattmuskel (ASMA) mönster,
färdigspädd)
1 x 15 mL FITC IgG (H&L) Conjugate (FITC IgC (H+L) konjugat)
1 x 3 mL 1% Evans Blue kontrastfärg
2 x 25 PBS II Buffert (x40 konc.)
1 x 10 mL Mounting Medium (monteringsmedium)
50 x Blotters (läskpapper)
25 x täckglas
1 x instruktionsblad
Material som medföljer (objektglas)
1.
504170.10 10 x Rat liver, kidney, stomach slide (5-well) (Objektglas med råttlever, -njure
och råttmage, 5-brunnars)
Eller
2.
3.
504180.25 25 x Rat liver, kidney, stomach slide (10-well) (Objektglas med råttlever, njure och råttmage, 10-brunnars)
1 - Instruktionsblad
Ytterligare material som krävs men som inte medföljer
Destillerat vatten för att späda ut PBS II-koncentratet
Behållare för PBS II-buffert
Mikropipetter och pipettspetsar för engångsbruk för att applicera patientprover
Fuktkammare för inkuberingssteg
Fluorescensmikroskop med 495 nm excitationsfilter och 515 nm barriärfilter
Sprutflaska i plast för första tvätt med PBS II
Ytterligare komponenter kan erhållas från INOVA Diagnostics: PBS II (508002), IFA System
Negative Control (508186), ANA homogeneous pattern (508101), Mitochondrial (AMA) Pattern
(504052), Smooth Muscle (ASMA) Pattern (504053), FITC IgG (H&L) Conjugate (504021, 504072),
1% Evan’s Blue (504049) and Mounting Medium (504046, 504047).
3
Analysförfarande
Kvalitetskontroll
Positiva och negativa kontroller bör användas vid varje analystillfälle.
1.
Monteringsmedium. Ta ut monteringsmediet ur kylskåpet så att det når rumstemperatur
(18-28ºC) innan det skall användas.
2.
Späd PBS II-koncentrat. Späd PBS II-koncentrat med destillerat vatten (1 del PBS IIkoncentrat + 39 delar destillerat vatten) och blanda. PBS II används för att späda patientprover
och som
en tvättbuffert.
3.
Späd patientprover.
Screening: Späd patientprover 1/20 genom att tillsätta 50µl serum till 950µl PBS II buffert.
Titrering: Gör seriespädningar av positiva prover med PBS II-buffert. (t.ex. 1/20, 1/40,
1/80, 1/160 och 1/320 osv.).
Till exempel: Ta 100µl av 1/20-spädningen, blanda med 100µl PBS II för att få en 1/40
spädning. Upprepa för ytterligare spädning.
4.
Substratobjektglas. Se till att substratobjektglasen når rumstemperatur (18-28°C) innan de
tas ur förpackningen. Märk objektglasen på lämpligt sätt, placera i fuktkammaren och tillsätt
en droppe av vardera positiv och negativ kontroll i lämpliga brunnar. Tillsätt 50µl utspädda
patientprover i de återstående brunnarna.
5.
Inkubering av objektglas. Inkubera objektglasen i 20 minuter i en fuktkammare vid
rumstemperatur (18-28°C).
6.
PBS II-tvätt. Ta ut objektglasen ur fuktkammaren och skölj hastigt med PBS II-sprutflaska
Spruta inte direkt på brunnarna. Placera objektglasen i ett ställ och sänk ned i PBS II samt
skaka eller rör om i 5-10 minuter.
7.
Tillsats av fluorescerande konjugat. Skaka bort överflödigt PBS II och torka runt
brunnarna med medföljande läskpapper. Sätt tillbaka objektglasen i fuktkammaren och
täck omedelbart varje brunn med en droppe fluorescerande konjugat. LÄMNA INTE
BRUNNARNA OTÄCKTA FÖR LÄNGRE ÄN 15 SEKUNDER. Om substratet torkar ut
påverkas resultatet kraftigt.
8.
Inkubering av objektglas. Inkubera objektglasen mörkt i 20 minuter i en fuktkammare vid
rumstemperatur (18-28°C).
9.
PBS II-tvätt. Tvätta igen som beskrivs ovan. Valbar kontrastfärg. Tillsätt 2-3 droppar 1 %
Evans Blue per 100 ml PBS II innan glasen sänks ned.
10.
Montering med täckglas. Ta ett objektglas i taget från PBS II-tvätten. Torka snabbt runt
brunnarna och tillsätt en droppe monteringsmedium i varje brunn. Sänk försiktigt ned
objektglaset på ett täckglas. Undvik luftbubblor, men försök inte ta bort dem om de uppstår.
Torka bort överflödigt medium från täckglasets kanter.
11.
Avläs objektglasen i fluorescensmikroskop. Objektglasen kan förvaras i upp till 3 dagar
vid 2-8°C i mörker utan betydelsefull fluorescensförlust.
Resultat
Kvalitetskontroll
Det ANA-homogena mönstret ska ge ett klart äppelgrönt homogent mönster i cellkärnan. Det
mitokondriella (AMA) mönstret ska ge en klart äppelgrön färgning av njurtubuli och gastriska
parietalceller. Glattmuskel- (ASMA) mönstret ske ge en klar grön färgning av magsäckens
muskellager. Den negativa kontrollen bör bara uppvisa matt grön färgning i alla vävnader, utan
tydlig fluorescens. Om kontrollerna inte ser ut som ovan skall analysen inte godkännas och bör
köras om.
4
Tolkning av resultat
Negativt resultat
Svag, diffus grön färgning i alla snitt utan något tydligt fluorescensmönster. Misstänkt svaga
reaktioner bör göras om men med en högre spädning (t.ex. 1/40). Om det upprepade resultatet är
likadant som den ursprungliga anses analysen vara negativ.
Positivt resultat
Ses som tydlig fluorescens i specifika vävnadsområden som ger ett eller flera av följande mönster:
Antinukleära antikroppar (ANA)
ANA färgar kärnan i leverceller, distala och proximala njurtubuli samt i gastriska parietal- och
huvudceller. Nästan alla SLE-patienter har ANA i serum, men ANA kan även finnas vid andra
bindvävssjukdomar såsom reumatoid artrit. ANA kan även finnas vid kronisk aktiv hepatit och
primär biliär cirrhos och som en följd av behandling med vissa läkemedel.
Ytterligare information kan fås genom att tolka de ANA-kärnmönster som uppstår (se nedan). Det
rekommenderas att alla positiva ANA-prover titreras till slutpunkt för att säkerställa att möjliga
blandade reaktioner upptäcks som annars hade missats. Ytterligare analys av sådana prov för att
påvisa autoantikroppar mot dubbelsträngat DNA och extraherbara kärnantigener (ENA)
rekommenderas.
Mönster
Homogent
Vanligt förekommande
antigen
ds DNA, histoner
Perifer
(kant)
Kornigt
Nativt/ds DNA
Nukleolärt
4-6S sRNA
Sjukdomsassociation
SLE
Reumatoid artrit (RA)
Blandad bindvävssjukdom (Mixed
connective tissue disease MCTD)
Läkemedelsinducerad lupus
SLE
Extraherbart kärnantigen,
Ribonukleoprotein,
Scl-70, SSB
Sklerodermi
Sjögrens syndrom
Blandad bindvävssjukdom (Mixed
connective tissue disease MCTD)
SLE
Sklerodermi
Sjögrens syndrom
SLE,
RA och progressiv systemisk skleros
5
Vävnadsspecifika färgningsmönster för autoantikroppar inkluderar:
Antikropp
Associerad vävnad
Cytoplasmat i distala tubuli och proximala tubuli (i mindre
utsträckning) i njurarna
Hepatisk cellcytoplasm (levern) och gastrisk
parietalcellcytoplasm (magen)
Muskellager (magsäck)
Muskellager i arterioler (andra vävnader)
Främsta
sjukdomsassociation
Primär
biliärcirros
och andra
leversjukdomar
Kronisk aktiv
hepatit
Antigastriska
parietalcellsantikro
ppar (AGPCA)
Parietalceller (magsäck)
Perniciös anemi
Antiretikulina
antikroppar (ARA)
Peritubulära fibrer & Bowmans kapslar (njure)
Hepatiska cellmembraner, sinusoidala väggar (lever)
Crohns
sjukdom
Celiaki
Dermatitis
herpetiformis
Antimitokondriella
antikroppar (AMA)
Antikroppar mot
glatt muskulatur
(ASMA)
OBS: Varje laboratorium bör fastställa egna värden för när ett positivt resultat ska anses vara
kliniskt signifikant.
Metodens begränsningar
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
En diagnos får inte ställas endast utgående från denna analys. Alla andra faktorer, som
patientens anamnes och andra serologiska resultat eller biopsiresultat, måste också vägas
in.
Färgningsmönstret ändras ibland när ett prov titreras till slutpunkt. Detta kan bero på att det
finns mer än en autoantikropp och gäller särskilt för ANA.
Ett negativt resultat kan bero på remission av sjukdomen eller på närvaro av autoantikroppar
som inte upptäcks med denna teknik.
Ljuskälla, filter och optik i olika sorters fluorescensmikroskop påverkar analysens sensitivitet.
Mikroskopets prestanda påverkas markant av korrekt underhåll, särskilt centrering av
kvicksilverlampan och byte av lampan med rekommenderat tidsintervall.
Autoantikroppar kan aktiveras eller induceras av ett stort antal läkemedel, inklusive orala
preventivmedel och antibiotika.
Beroende på det korta avståndet mellan brunnarna på 10-brunnars objektglas är det möjligt
att prov och kontroller korskontamineras. Därför bör försiktighet iakttas, särskilt vid tvättning,
för att säkerställa att detta inte sker.
Reagenserna kan vara lämpliga att använda tillsammans med andra tillverkares IFAreagens men detta har inte utvärderats.
Objektglas som säljs separate klassificeras som “Analysspecifika reagenser”. Analytiska och
prestandakarakteristiska har inte fastställts förutom som en komponent i satsen.
6
Förväntade värden och specifika prestandakarakteristika
Förväntade resultat
Normalt
Antikrop
p
ANA
AMA
ASMA
ARA
AGPCA
Förekomst i
procent
0-2
0-8
3
5
10-15 (hos äldre)
referens
2
7
2
8
9
Patologiska
Klinisk diagnos
ANA
SLE
Blandad
bindvävssjukdom
(Mixed connective
tissue disease MCTD)
Andra autoimmuna
sjukdomar (RA,
sklerodermi, Sjögrens
syndrom,
dermatomyosit)
AMA
Primär biliär cirros
ASMA
Kronisk hepatit
Primär biliär cirros
ARA
Crohns sjukdom
Celiaki
Dermatitis herpetiformis
AGPCA Perniciös anemi
Förekomst
i procent
99
90
referens
15-50
3,5
>95
70
50
24
38-50
22
90
3
3
3
6
3,6
6
9
4
3
Jämförande studie
En jämförande studie genomfördes på 96 kliniska prover med detta kit och en kommersiellt
tillgänglig referensmetod. 93 av de 96 proverna som analyserades gav identiska resultat med de
två metoderna. För de mönster som beskrivs resultatavsnittet var den relativa sensitiviteten från 89
till 100 %. Den relativa specificiteten var 100 % i varje fall och den relativa överensstämmelsen låg
mellan 93 och 100 %. För de prover som avvek kunde endast svag positiv ANA eller SMA färgning
påvisas i vart fall med referensmetoden, vilket antyder att dessa prover gav gränsvärden för det
specifika mönstret och/eller att det finns små skillnader i de två metodernas sensitivitet.
Sammanfattning av metodbeskrivningen
1.
2.
3.
Se till att monteringsmediet uppnår rumstemperatur.
Späd PBS II med destillerat vatten.
Späd parientserum 1/20 med PBS II.
7
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Se till att substratobjektglasen uppnår rumstemperatur (18-28°C).
Tillsätt 50µl positiv och negativ kontroll och utspätt patientserum i lämpliga brunnar.
Inkubera i en fuktkammare i 20 minuter.
Tvätta i 5-10 minuter i PBS II.
Torka runt varje brunn och täck omedelbart varje brunn med en droppe konjugat.
Inkubera som i steg 6.
Tvätta som i steg 7.
Montera.
Avläs objektglasen i fluorescensmikroskop.
Referenser
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Tan E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell
biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
Doniach, D, et al. (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic (lupoid) hepatitis,
cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm 1: 237-262.
Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel, H.
Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases, Immunology Series No. 7.
CDC, Atlanta, GA.
Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformis and adult
coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
Seah, P P et al (1973). Antireticulin antibody: Incidence and diagnostic significance. Gut 14, 311-315.
Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path, 19,
527-538.
Rizzeto, M & Doniach, D (1973). Types of reticulin antibodies detected in human sera by immunofluorescence.
J. Clin. Path. 26, 841-851.
Bird, A G (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chapel, H. Publ. IRL Press,
Oxford, UK. Pg.175-194.
Weller, TH, Coons, AH (1954). Fluorescent antibody studies with agents of Varicella and Herpes zoster
propagated in vitro. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 86, 789 – 794.
rd
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU
Publications, Sheffield. 14.
Tillverkad av:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Teknisk service (Endast USA och Kanada):
877-829-4745
Teknisk service (utanför USA): 1 858-805-7950
[email protected]
Auktoriserad representant inom EU:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Germany
Tel.: +49-6894-581020
Fax.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
624170SWE
Januari 2013
Revision 1
8
