Dako GenPoint™ HPV Biotinylated DNA Probe för in situ hybridisering Kod Y1443 Avsedd användning För in vitro-diagnostik. GenPoint™ HPV Biotinylated DNA Probe är avsedd för användning vid in situ hybridisering färgningsprocedur med användning av Dako GenPoint™ Detection System (kod K0620) för detektion av humant papillomvirus (HPV). Sammanfattning och förklaring HPV har påträffats i epitelialceller i flera olika organ, inklusive hud och könsorgan.1 HPV finns i kärnan och kan vara i antingen episomal (fria virus) eller integrerad form.2 Medföljande reagens GenPoint™ HPV Probe innehåller HPV genomiska kloner i formen av dubbelsträngiga fragment med 500 baspar eller mindre (biotinylerade* och omärkta), och multipla biotinylerade oligonukleotider från 25 till 40 baser i längd. Proben är bruksfärdig och tillhandahålls i 1,0 mL in situ hybridiseringslösning (0,3 mol/L NaCl, 50% formamid i buffert). Proben är optimerad med GenPoint™ Detection System (kod K0620). *U.S. Patent 4,599,303, beviljad underlicens från Schleicher & Schuell, Inc. Material som behövs, men inte ingår Se instruktionerna för GenPoint™ detektionssystem. Specificitet GenPoint™ HPV Biotinylated DNA Probe har befunnits reagera med HPV-typ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, och 68 på formalinfixerade, paraffininbäddade, cervikala vävnader och/eller celler genom in situ hybridisering. Försiktighetsåtgärder 1. För yrkesmässigt bruk. 2. Minimera mikrobiell kontaminering av reagenser eftersom en ökning av icke-specifik färgning annars kan inträffa. 3. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 4. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste noggrant instrueras om lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsanvisningar. 5. Använd lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögonen och huden. 6. Oanvänd lösning måste kasseras i enlighet med lokala och statliga föreskrifter. 7. Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. Fara Probe containing Formamide: ≥25-<50% Formamid, ≥1-<3% Natriumklorid H360D Kan skada det ofödda barnet. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P308 + P313 Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. P405 Förvaras inlåst. P501 Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Förvaring Förvaras vid 2–8 °C. Får inte användas efter det utgångsdatum som anges på flaskan. Om reagenser förvaras under andra förhållanden än dem som specificerats måste förhållandena kontrolleras av användaren. 3 Det finns inga tydliga tecken som visar att denna produkt är instabil. Därför bör positiva och negativa kontroller testas samtidigt med patientprover. Kontakta Dako Technical Support om oväntad färgning observeras, som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara något problem med satsen. (128080-001) P04075SE_01/Y1443/2015.07 s. 1/2 Provpreparation Paraffinsnitt GenPoint™ HPV Biotinylerad DNA-prob kan användas på formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt. För bättre vidhäftning av vävnadssnitten till objektglasen rekommenderas användning av Silanized Slides (kod S3003). De avparaffinerade vävnadssnitten kräver förbehandling för att ge proben tillgång till målnukleinsyrasekvenser. Detta kan uppnås med en inkubering av vävnadssnitten i 0,8% Pepsin (kod S3002, lös upp paketet i 250 mL 0,2N saltsyra) vid 37 °C i 5–10 minuter. Efter digestion skall vävnadssnitten sköljas i flera byten med avjoniserat vatten, och därefter nedsänkas i 0,3% H2O2 i metanol i 20 minuter, och sköljas i flera byten med avjoniserat vatten. Cytologprover GenPoint™ HPV Biotinylated DNA Probe kan även användas på cytologprover. Objektglasen lufttorkas i 30–60 minuter. Objektglasen genomdränks sedan med 50% alkohol i 30 minuter följt av postfixering i 10% Neutral Buffer Formalin i 30 minuter. Objektglasen sköljs därefter i flera byten med avjoniserat vatten och inkuberas med Proteolytic Enzyme (kod S3007) vid rumstemperatur i 3 minuter. Efter digestion skall vävnadssnitten sköljas i flera byten med avjoniserat vatten, och därefter nedsänkas i 0,3% H2O2 i metanol i 5 minuter, och sköljas i flera byten med avjoniserat vatten. Färgningsprocedur Efter provberedning får objektglasen lufttorka en kort stund och en droppe från GenPoint™HPV Biotinylated DNA Probe tillsätts och täckglas appliceras. Proben och mål-DNA denatureras genom att objektglasen placeras på en platt värmeblockyta vid 92 °C i 5 minuter. Efter denaturering överförs objektglasen till en förvärmd fuktkammare för hybridisering vid 37 °C i 16 till 18 timmar. Efter hybridisering avlägsnas täckglasen genom att objektglasen nedsänks i rumstempererat 1x TBST (kod S3306 för 10X TBST). Objektglasen tvättas sedan först i ett färskt bad med TBST och sedan i stringenttvätt. Späd först GenPoint™ Detection System-stringenttvätt enligt instruktionerna för K0620 och utför sedan stringenttvätten vid 48 °C i 30 minuter . Skölj sedan objektglasen i tre separata färska bad med 1x TBST. Detektion av hybridiserad prob utförs sedan med användning av GenPoint™ Detection System (kod K0620) enligt satsens instruktioner och med användning av en 1:100 spädning av Primary Streptavidin-HRP i 30 minuter. Färgningsmönster Brun DAB-färgning i kärnan indikerar detektion av HPV. Begränsningar Olika fixeringstider och fixeringsreagenser kan påverka signalintensitet och även bakgrundsfärgning. Förbehandling av olika prover bör optimeras i testlaboratorierna. Referenser 1. Viral Carcinogenesis. Mendelsohn J (eds.). The Molecular Basis of Cancer. W.B. Saunders Company. 2001:Chapter 5 2. Evans MF, et al. Biotinyl-tyramide-based in situ hybridization signal patterns distinguish human papilloma virus type and grade of cervical intraepithelial neoplasia. Mod Pathol 2002; 15(12):1339 Edition 07/15 (128080-001) P04075SE_01/Y1443/2015.07 s. 2/2