NOVA Lite™ Skeletal Muscle (Primate) IFA Slides
För in-vitro diagnostik
För endast exportera. Inte till försäljning i USA
Produktkod: 508320, 508320.10
CLIA-komplexitet: Hög
Ansökningar
Vävnadssnitt på Skelettmuskler från apa avsedd för undersökning av humanserum på förekomst av cirkulerande
antikroppar mot tvärstrimmiga muskelceller. Används som hjälp vid diagnostik av myasthenia gravis med indirekt
immunofluorescensteknik.
Sammanfattning och förklaring
Påvisande av autoantikroppar mot tvärstrimmig muskel med indirekt immunofluorescence på fryssnitt är
standardmetod för serologisk diagnos av myasthenia gravis.
Antikroppar mot de kontraktila elementen hos tvärstrimmig muskel är karakteristiskt för och associerat med
myasthenia gravis (MG) och skiljer sig från antikroppar mot hjärtmuskel. Det finns många proteiner som är
målantigen men de har ännu inte blivit fullt kartlagda så immunofluorescens kvarstår som den bästa metoden.
Princip
Dessa objektglas används i indirekt immunofluorescensteknik, där patientprover och lämpliga kontroller inkuberas med
preparaten. De antikroppar som inte reagerat tvättas bort och ett lämpligt fluoresceinmärkt konjugat tillsätts. Obundet
konjugat tvättas bort och objektglasen granskas i ett fluorescensmikroskop. Positiva prover ger grön fluorescens på de
ställen av preparatet där autoantikroppar har bundit.1
Reagens
Vävnadssnitt på skelettmuskler från apa på 4-brunnars objektglas, individuellt förpackade i en foliepåse innehållande
fuktabsorberande medel.
Varningar /Försiktighetsåtgärder
Metoder för korrekta handhavande och avfallshantering bör utformas för alla potentiellt smittsamma prover som testats
med denna produkt; endast personal med lämplig utbildning för angivet ändamål bör tillåtas att utföra dessa procedurer.
Förvaring och stabilitet
Oöppnade objektglas ska förvaras vid 2-8°C och kan användas fram till det angivna utgångsdatumet. FÅR EJ FRYSAS.
När objektglasen har tagits ur folieförpackningen ska de användas omedelbart.
Provtagning och förberedelse
Blodprover bör tas i rör utan tillsatser genom venpunktion. Efter koaguleringen bör serum avskiljas snarast möjligt för att
förebygga hemolys. Serumet kan förvaras vid 2-8°C upp till 7 dagar före analys3, eller vid längre förvaring, alikvoteras
och förvaras vid -20°C eller lägre. Upprepad frysning och upptining bör undvikas. Mikrobiellt kontaminerade,
hemolyserade eller lipemiska serumprover bör inte användas, eftersom minskade titrar eller otydliga färgningsmönster
kan uppstå.
Metod
Material som ingår
1.
2.
1 x Skeletal Muscle (Primate) – 4 well slide (Skelettmuskler (Primate) från apa – 1 x 4 brunnars objektglas eller)
10 x Skeletal Muscle (Primate) – 4 well slide Tvärstrimmig muskel från apa – 10 x 4 brunnars objektglas
1 instruktionsblad
1
Ytterligare material som krävs men som inte medföljer
1.
2.
3.
4.
5.
6.
PBS för provspädning och tvätt.
Behållare för PBS-buffert
Mikropipetter och pipettspetsar för engångsbruk för att tillsätta patientprover.
Fuktkammare för inkuberingssteg.
Fluorescensmikroskop med 495nm excitationsfilter och 515nm barriärfilter.
Sprutflaska i plast för första tvätt med PBS.
Ytterligare tillbehör kan införskaffas från INOVA Diagnostics: PBS (508002), IFA System negativ kontroll (508186),
anti-humant IgG (H+L) ap-adsorberat konjugat (504011, 504071) IgG ap-adsorberat konjugat (508128)
monteringsmedium (508001, 508005, 508006) och 1% Evans Blue (504049), PVA monteringsmedium (504046,
504047).
Analysförfarande
Kvalitetskontroll
Positiva och negativa kontroller bör användas vid alla analystillfällen.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Monteringsmedium: Ta ut monteringsmediet ur kylskåpet så att det når rumstemperatur (18-28ºC) innan det ska
användas.
Spädning av patientprover
Screening: Späd patientprover 1/5 genom att tillsätta 20μL serum i 80 μL PBS-buffert.
Titrering: Gör flera spädningar av positiva screenade prover med PBS-buffert (t.ex. 1/10, 1/20, 1/40, 1/80
o.s.v.).
Till exempel: Tag 100μL av 1/5-spädningen och blanda med 100μL PBS för att få en 1/10-spädning (upprepa
för ytterligare spädning).
Substratobjektglas. Se till att objektglasen når rumstemperatur
(18-28°C) innan de tas ur förpackningen.
Märk objektglasen på lämpligt sätt, placera dem i fuktkammaren och tillsätt positiva och negativa kontroller i
lämpliga brunnar.
Tillsätt 50–100μL spätt patientprov till de återstående brunnarna.
Inkubering av objektglas. Inkubera objektglasen i 30 minuter i en fuktkammare vid rumstemperatur (18-28°C).
PBS-tvätt. Ta ut objektglasen ur fuktkammaren och skölj dem hastigt med PBS-sprutflaskan. Spruta inte direkt
på brunnarna. Placera objektglasen i ett ställ och sänk ned i PBS och skaka eller rör om i 5-10 minuter.
Tillsats av fluorescerande konjugat. Skaka av överflödigt PBS och torka runt brunnarna. Sätt tillbaka
objektglasen i fuktkammaren och TILLSÄTT SNARAST EN DROPPE FLUORESCERANDE KONJUGAT (inom
15 sekunder). Om substratet torkar ut påverkas resultatet markant. Genom användning av ap-adsorberat
konjugat förbättras resultaten avsevärt (t.ex. 504011).
Inkubering av objektglas. Inkubera objektglasen i 30 minuter i en fuktkammare vid rumstemperatur (18-28°C) i
mörker.
PBS-tvätt. Tvätta igen enligt beskrivningen i steg 5. Önskas kontrastfärgning tillsätts 2-3 droppar 1% Evans Blue
per 100mL PBS innan glasen sätts ned.
Montering med täckglas. Tag ett objektglas i taget från PBS-tvätten. Torka snabbt runt brunnarna och tillsätt en
droppe monteringsmedium i varje brunn. Sänk försiktigt ned objektglaset på ett täckglas. Undvik luftbubblor,
men försök inte ta bort dem om de uppstår. Torka bort överflödigt medium från täckglasets kanter.
Avläs objektglasen i fluorescensmikroskop. Objektglasen kan förvaras i upp till 3 dagar i mörker vid 2-8°C utan
någon fluorescensförlust av betydelse.
Resultat
Kvalitetskontroll
Ett serumprov som innehåller autoantikroppar mot tvärstrimmig muskel ger en klart grön fluorescens i tvärstrimmiga
muskelfibrer. Den negativa kontrollen bör bara uppvisa en diffus grön färgning i alla vävnader, utan tydlig fluorescens.
Om kontrollerna inte ser ut som ovan skall analysen inte godkännas och bör köras om.
Tolkning av resultat
Se referens 2 för färgfotografier med exempel på detta mönster. Resultaten rapporteras som positiva eller negativa.Obs!
Varje laboratorium bör fastställa egna värden för när ett positivt resultat ska anses vara kliniskt signifikant.
2
Metodens begränsningar
1.
2.
3.
Ljuskälla, filter och optik i olika sorters fluorescensmikroskop påverkar kitets sensitivitet. Mikroskopets prestanda
påverkas markant av korrekt underhåll, särskilt centrering av kvicksilverlampan och byte av lampan med
rekommenderat tidsintervall.
Reagenserna kan vara lämpliga att använda tillsammans med andra tillverkares IFA-reagens men detta har inte
utvärderats.
En diagnos får inte ställas endast utifrån denna analys. Andra faktorer, som patientens anamnes och andra
serologiska resultat eller biopsiresultat, måste också vägas in.
Sammanfattning av metod
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Se till att monteringsmediet uppnår rumstemperatur.
Späd PBS med destillerat vatten.
Späd patientserum 1/5 med PBS.
Se till att substratobjektglasen uppnår rumstemperatur (18-28°C).
Tillsätt 50μL av positiva och negativa kontroller och spätt patientserum i lämpliga brunnar.
Inkubera i fuktkammare i 30 minuter.
Tvätta i 5-10 minuter i PBS.
Torka runt varje brunn och täck omedelbart med en droppe konjugat.
Inkubera som i steg 6.
Tvätta som i steg 7.
Montera.
Avläs objektglasen i fluorescensmikroskop.
Referenser
1.
2.
3.
Weller T. H. & Coons A. H. (1954). Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster
propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
Bradwell A.R. et al (2008). Atlas of Tissue Autoantibodies (Third Edition). Publ. The Binding Site Ltd.,
Birmingham, UK
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A. Milford Ward, G.D. Wild. Publ. PRU
Publications, Sheffield. 14.
NOVA Liteär ett varumärke som tillhör
INOVA Diagnostics, Inc.
3
Tillverkad av:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
Technical Service (Outside the U.S.) :
00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Auktoriserad representant inom EU:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Germany
Tel.: +49-6894-581020
Fax.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628320SWE
September 2010
Revision 0
4
