Dako
EnVision+ System- HRP
Märkt polymer
Anti-mus
Kod K4000 115 mL
Kod K4001 110 mL
Avsedd användning
För diagnostisk användning in vitro.
Dessa instruktioner avser Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP).
Denna produkt är avsedd för användning med primära antikroppar från mus som är försedda av användaren
för kvalitativ identifikation av antigener genom ljusmikroskopi av normal och patologisk paraffininbäddad
vävnad, kryostatvävnad eller cellberedningar. Vävnad som behandlats i olika fixativ inklusive etanol, B-5,
Bouins zinkformalin, och neutralt buffrad formalin kan användas.
Se “Allmänna instruktioner för immunohistokemisk färgning” eller “Instruktioner” för detektionssystemets IHCprocedurer för: (1) Procedurens principer, (2) Erforderligt material som ej ingår, (3) Förvaring,
(4) Provberedning, (5) Färgningsprocedur, (6) Kvalitetskontroll, (7) Felsökning, (8) Tolkning av färgning,
(9) Allmänna begränsningar
Sammanfattning
och förklaring
EnVision+ System, HRP är en IHC-färgningsmetod i två steg. Detta system är baserat på en HRP-märkt
polymer som är konjugerad med sekundära antikroppar. Den märkta polymern innehåller inte avidin eller
biotin. Följaktligen elimineras, eller reduceras märkbart, specifika färgningsresultat från endogen avidin-biotinaktivitet i lever, njure, lymfoid vävnad och kryostatsnitt. Reagensen i Dako EnVision+, HRP är bruksfärdig.
Systemet är en extremt känslig metod och således är optimala spädningar av den primära antikroppen upp till
20 gånger högre än de som används med den traditionella PAP-metoden, och ett antal gånger större än de
som används med traditionella ABC- eller LSAB-metoder. Detta protokoll erbjuder ett förstärkt signalbildande
system för detektion av antigener som finns i låga koncentrationer eller för primära antikroppar med låg titer.
Primära antikroppar som produceras i mus reagerar väl med den märkta polymern. Tolkning av all positiv
färgning eller dess frånvaro ska kompletteras med morfologiska och histologiska studier med korrekta
kontroller.
Procedurens
principer
All endogen peroxidasaktivitet släcks genom att inkubera prov med en lämplig endogen peroxidasblockerande
reagens. Proven inkuberas sedan med en lämpligt karakteriserad och utspädd primär musantikropp, efterföljt
av inkubation med den märkta polymern med två efter varandra följande 30-minuters inkubationer. Det bör
uppmärksammas att för antikroppar som kräver enzymdigestion eller target retrieval kan det vara
nödvändigt att öka inkubationstiderna för den primära antikroppen och den märkta polymern med 5 till
10 minuter. Färgning är fullbordad efter en 5–30 minuters inkubation med en lämplig substratkromogen.
Ingående reagenser
Kod K4000: Följande material räcker till 150 vävnadssnitt, baserat på 100 µL per snitt:
Kvantitet
1x15 mL
Beskrivning
Märkt polymer
Peroxidasmärkt polymer konjugerad med get anti-mus immunoglobuliner i tris-HCL buffert
innehållande stabiliserande protein och ett antimikrobiellt medel.
Kod K4001: Följande material räcker till 1100 vävnadssnitt, baserat på 100 µL per snitt:
Kvantitet
1x110 mL
Ytterligare
erforderligt material
som ej ingår
(107510-004)
Beskrivning
Märkt polymer
Peroxidasmärkt polymer konjugerad med get anti-mus immunoglobuliner i tris-HCL buffert
innehållande stabiliserande protein och ett antimikrobiellt medel.
Absorberande torkar,
Kontrollvävnad, positiv och negativ,
Kontrastfärgmedel, vattenbaserat, som Mayer’s Hematoxylin eller Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (kod
S3309)
Täckglas
Destillerat vatte
Etanol, absolut och 95%
Ljusmikroskop (20x – 800x)
Monteringsmedium, som Glycergel® Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting
medium, bruksfärdig (kod S3025) eller permanent monteringsmedium utan vatten, Ultramount (kod S1964)
Primära antikroppar och negativ kontrollreagens
Objektglas, belagda med Poly-L-lysin eller silaniserade objektglas (kod S3003)
Färgningsburkar eller bad
Tidtagare (kapabla till intervaller på 3–40 minuter)
302059SE_003 s. 1/6
Tvättflaskor
Tvättbuffertlösning
Xylen-, toluen- eller xylenersättande medel
För K4000 eller K4001 EnVision+, Peroxidase, krävs följande reagens utöver den ovannämnda listan:
Blockeringsreagens för endogena peroxidaser, såsom Dual Endogenous Enzyme Block (kod S2003)
Substratkromogenlösning såsom AEC+ Substrate-Chromogen, Ready-to-Use, (kod K3464, 110 mL) eller
Liquid DAB+ (kod S2002)
Ytterligare erforderligt material som ej ingår, ammoniumhydroxid, 15 mol/L utspädd till 0,037 mol/LPAP
Pen (kod S2002).
Anvisningar
och
försiktighetsåtgärder
1. För professionella användare.
2. Använd inte reagenser efter utgångsdatum för preskriberad förvaringsmetod. Om reagenserna förvaras i
annorlunda miljö än de som specificeras i produktens bipacksedel, måste de verifieras av användaren.
3. Byt inte ut reagenser mellan olika satsnummer eller från satser från andra tillverkare.
4. Enzymer och substratkromogener kan påverkas på ett ogynnsamt vis vid exponering i starka ljusnivåer.
Förvara inte satsdelar och utför inte färgning i starkt ljus, som direkt solljus.
5. Inkubationstider eller temperaturer utöver de som specificeras kan ge felaktiga resultat, och alla slags
ändringar måste valideras av användaren.
6. Som med alla produkter som kommer från biologiska källor måste korrekta procedurer användas vid
hantering.
7. Använd lämplig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud.
8. Oanvänd lösning ska disponeras enligt lokala, statliga eller federala regler.
Reagensberedning
Det underlättar att förbereda följande reagenser före färgning.
Tvättbuffertlösning
TBST, 0,05 mol/L Trisbuffrad saltlösning med Tween (kod S3006) är den rekommenderade tvättbufferten för
automatisk och manuell IHC-detektion. TBS, 0,05 mol/L Trisbuffrad saltlösning (kod S1968) och PBS, 0,02
mol/L fosfatbuffrad saltlösning (kod S3024) är också lämpliga tvättbuffertlösningar för manuell färgning.
Tvättbuffertlösningar innehållande natriumazid rekommenderas ej. Natriumazid inaktiverar peroxidas (HRP)
vilket resulterar i negativ färgning. Förvara oanvänd buffert vid 2–8°C. Bortskaffa buffert om den är grumLig.
Destillerat vatten kan användas för att skölja peroxidasblock, substrat och kontrastfärgning.
Primär antikropp
NP-serie “Plus” bruksfärdiga antikroppar är optimerade och rekommenderas för användning med Dako “Plus”
detektionssystem med hög känslighet. Koncentrerade antikroppar finns också tillgängliga från Dako.
Optimering av koncentrerade antikroppar krävs av slutliga användare. Spädningar ska förberedas med hjälp
av Antibody Diluent (kod S0809), eller en spädningsvätska innehållande 0,05 mol/L tris-HCL buffert med 1%
bovint serumalbumin (BSA). Dako N-serie bruksfärdiga antikroppar är inte optimerade för användning med
Dako “Plus” detektionssystem. För de flesta primära antikroppar som används med denna sats räcker det med
en inkubationstid på 30 minuter.
Negativ Kontrollreagens
Vid användning av Dako NP-serie "Plus" bruksfärdiga antikroppar rekommenderas Universal Negative
Control+ optimerad för användning med mus (kod NP015) NP-serie "Plus” bruksfärdiga antikroppar, som en
negativ kontrollreagens.
En negativ kontrollreagens innehåller idealiskt en antikropp som inte visar någon specifik reaktivitet med
human vävnad eller normalt/ickeimmunt serum i samma matrix/lösning som den spädda primära antikroppen.
Den negativa kontrollreagensen ska vara av samma subklass och djurart som den primära antikroppen, spädd
till samma immunoglobulin- eller proteinkoncentration som den utspädda primära antikroppen med samma
spädningsvätska. Inkubationsperioden för den negativa kontrollreagensen ska motsvara den primära
antikroppen.
Kontrastfärgmedel
Den färgade slutprodukten av färgningsreaktionen är löslig i alkohol och ska endast användas med
vattenbaserat kontrastfärgmedel som Mayer’s hematoxylin eller Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (kod
S3309). Följ kontrastfärgningen av hematoxylin med en ordentlig sköljning i destillerat vatten, blötlägg sedan
objektglas med vävnad i ett bad med 0,037 mol/L ammoniak eller liknande blåelsemedel. 0,037 mol/L
ammoniakvatten förbereds genom att blanda 2,5 mL av 15 mol/L (koncentrerad) ammoniumhydroxid med 1
liter vatten.
Oanvänd 0,037 mol/L ammoniak kan förvaras i rumstemperatur (20–25°C) i ett tätt kapsylerad flaska i up p till
12 månader.
Rådgör med tillverkarens riktlinjer för alternativa konstrastfärgningsprocedurer.
(107510-004)
302059SE_003 s. 2/6
Monteringsmedium
Glycergel Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount, Aqueous Mounting Medium, bruksfärdig (kod
S3025) rekommenderas för vattenmontering. Glycergel måste värmas till minst 50°C precis före användnin g.
Permanent monteringsmedium utan vatten, Ultramount (kod S1964) kan också användas.
Förvaring
EnVision+, HRP ska förvaras vid 2–8°C. Får ej frysa s. Använd inte efter utgångsdatum som står på
reagensflaskor och produktetiketter.
En reagens med ändrat utseende, t.ex. fällning, kan ange instabilitet eller nedbrytning. I dessa fall ska
reagensen/reagenserna inte användas.
Det finns inga tydliga tecken som indikerar instabilitet hos dessa produkter. Därför bör positiva och negativa
kontroller köras samtidigt med patientprover. Kontakta Dakos tekniska support om oväntad färgning
observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och det misstänks vara något
problem med satserna.
Provpreparation
Paraffininbäddad vävnad
Före IHC-färgning måste vävnader vara fixerade och behandlade. Fixering förebygger autolys och röta av
exciderad vävnad, bevarar antigenitet, förhöjer brytningsindex av vävnaders beståndsdelar och ökar
motståndet av cellulära element mot vävnadens behandling. Behandling av vävnad inkluderar dehydrering,
klarning av dehydrerade medel, infiltrering av inbäddningsmedium, inbäddning och snitt av vävnader. De mest
vanliga fixativen för IHC-vävnadsberedningar beskrivs i ”Allmänna instruktioner för immunokemisk färgning”.
Detta är endast riktlinjer. Optimala procedurer måste bestämmas och verifieras av användaren. (För specifik
information om hur vävnad fixeras och behandlas, se referenser 1 och 2.)
Färgningsprocedur
Anmärkningar om proceduren
Användaren bör läsa instruktionerna noggrant och bekanta sig med produktens innehåll före användning.
Den försedda reagensen och instruktionerna har utformats för optimal prestanda. Ytterligare spädning av
produktreagensen eller ändrade inkubationstider eller temperaturer kan ge felaktiga resultat.
Alla reagenser ska nå rumstemperatur (20–25°C) före immunofärgning. Dessutom ska alla inkubationer utföras
vid rumstemperatur.
Låt inte vävnadssnitten torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan visa ökad ospecifik
färgning. Täck objektglas som utsätts för drag. Om långvariga inkubationer används ska vävnader placeras i
en fuktig miljö.
Känsligheten av EnVision+, HRP kan ökas ytterligare genom att förlänga inkubationstiden för steg 2 och 3 med
5–10 minuter.
Färgningsprotokoll
STEG 1 PEROXIDASBLOCK
Slå lätt bort överflödig buffert. Med hjälp av en luddfri duk (som exempelvis Kimwipe eller förband av
gasväv), torka försiktigt runt provet för att avlägsna kvarvarande vätska och håll reagensen inom
preskriberat område.
Applicera tillräckligt med Peroxidase Block för att täcka provet.
Inkubera i 5 (+1) minuter.
Skölj försiktigt med destillerat vatten eller buffertlösning från en tvättflaska (fokusera inte flödet direkt
på vävnaden) och placera i ett färskt buffertbad.
STEG 2 PRIMÄR ANTIKROPP ELLER NEGATIV KONTROLLREAGENS
Slå lätt bort överflödig buffert och torka objektglasen enligt ovan.
Applicera tillräckligt med optimalt utspädd primär antikropp eller negativ kontrollreagens för att täcka
provet.
Inkubera i 30 (+1) minuter.
Skölj försiktigt med buffertlösning från en tvättflaska (fokusera inte flödet direkt på vävnaden) och
placera i ett färskt buffertbad.
Om färgningsproceduren måsta avbrytas kan objektglas hållas i ett buffertbad efter inkubation av den
primära antikroppen (Steg 2) i upp till en timme vid rumstemperatur (20–25°C) utan att påverka
färgningsproceduren.
STEG 3 MÄRKT POLYMER-HRP ANTI-MUS
Slå lätt bort överflödig buffert och torka objektglasen enligt ovan.
Applicera tillräckligt med Märkt Polymer för att täcka provet.
Inkubera i 30 (+1) minuter.
Skölj objektglasen som i Steg 2.
STEG 4 SUBSTRATKROMOGEN
Torka objektglasen som tidigare.
Applicera tillräckligt med substratkromogen för att täcka provet.
Inkubera i 5–30 minuter.
(107510-004)
302059SE_003 s. 3/6
Skölj försiktigt med destillerat vatten från en tvättflaska (fokusera inte flödet direkt på vävnaden)
SamLa avfall med substratkromogen i en behållare för riskmaterial för korrekt bortskaffning.
STEG 5 HEMATOXYLIN KONTRASTFÄRGMEDEL (valfritt)
Blötlägg objektglasen i ett bad av hematoxylin i vatten (kod S3309). Inkubationens längd beror på
styrkan av använd hematoxylin.
Skölj försiktigt i ett destillerat vattenbad.
Doppa objektglasen 10 gånger i ett bad med 0,037 mol/L ammoniak eller liknande blåelsemedel.
Skölj objektglasen i ett bad med destillerat eller avjoniserat vatten i 2–5 minuter.
STEG 6 MONTERING
Prov kan monteras och täckas med glas med ett vattenbaserat monteringsmedium som exempelvis
Glycergel Mounting Medium (kod C0563) eller Faramount (kod S3025) eller permanent (utan vatten)
monteringsmedium, Ultramount (kod S1964).
OBSERVERA: Objektglas kan läsas av då det passar. En viss blekning kan dock förekomma om objektglasen
utsätts för starkt ljus under en veckas tid. Minimera blekning genom att förvara objektivglasen mörkt i
rumstemperatur (20–25°C).
Kvalitetskontroll
Olika vävnadsbehandlingar och tekniska procedurer i användarens laboratorium kan orsaka signifikant
varierande resultat, vilket nödvändiggör att regelbundna interna kontroller görs utöver följande procedurer. Se
kvalitetskontrollriktlinjerna enligt CAP:s (College of American Pathologists) godkännandeprogram för
immunohistokemi och referenser 3 till 5 för ytterligare information. Se specifikationsbladet för varje använd
primär antikropp för detaljer om känslighet och immunoreaktivitet.
Se “Allmänna instruktioner för immunohistokemisk färgning” för ytterligare information om positiva och negativa
kontroller:
Färgningstolkning
Se “Allmänna instruktioner för immunohistokemisk färgning” för riktlinjer om tolkning.
Begränsningar
Se “Allmänna instruktioner för immunohistokemisk färgning” för allmänna begränsningar.
Bruk av gamLa eller obuffrade fixativ, eller exponering av vävnad till stark värme (varmare än 60°C) u nder
behandlingen kan orsaka nedsatt färgningskänslighet.
Endogen peroxidas- eller pseudoperoxidasaktivitet finns hos hemoproteiner som hemoglobin, myoglobin,
cytokrom, och katalas, samt i eosinofiler. 6,7 Denna aktivitet kan förebyggas genom att inkubera prov med
Peroxidas Block i 5 minuter just före applicering av den primära antikroppen. Denna reagens kan även
behandla blod- och benmärgsutstryk och frysta vävnader. Denna procedur upphäver dock inte det rödbruna
pigmentet hos hemoproteiner. Alternativt kan en lösning med metanolkväveperoxid användas. Vissa antigen
kan denatureras med denna procedur.
Vävnad från personer som är infekterade med hepatit B-virus och som innehåller hepatit B-ytantigen (HbsAg)
kan visa ospecifik färgning med pepparrotperoxidas.8
Normalt/ickeimmunt serum från samma djurkälla som det sekundära antiserumet som användes i
blockeringssteget kan orsaka falskt negativa eller falskt positiva resultat p.g.a. auto-antikroppar eller naturliga
antikroppar.
Försedda reagenser i denna sats har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan orsaka förlust av
antigendetektion.
(107510-004)
302059SE_003 s. 4/6
Felsökning
Problem
1. Inga objektglas färgas.
2. Alla objektglas färgas svagt.
3. Kraftig bakgrundsfärgning på
alla objektglas.
Sannolik orsak
1a. Reagenser har inte använts i
korrekt följd.
1b. Natriumazid.
2a. Snitten håller kvar för mycket
lösning efter tvättbad.
2b. Objektglas har inte inkuberats
tillräckligt länge.
3a. Prov innehåller hög endogen
peroxidas-aktivitet.
3b. Paraffinet är ofullständigt
avlägsnat.
3c. Objektglas har inte sköljts
ordentligt.
3d. Snabbare än normal substratreaktion p.g.a. exempelvis för
hög rumstemperatur.
3e. Snitten torkade under
färgningsproceduren.
3f. Ickespecifik bindning av
reagenser till vävnadssnitt.
3g. Antikropp för koncentrerad.
Förslag till åtgärd
1a. Granska reagensernas
tillämpning.
1b. Använd färsk azidfri buffert.
2a. Slå lätt bort överflödig lösning
innan du torkar runt snittet.
2b. Granska rekommenderade
inkubationstider.
3a. Använd längre inkubationstid
för peroxidasblock.
3b. Använd färska xylen- eller
toluen-bad. Om flera
objektglas färgas samtidigt
ska det andra xylenbadet
innehålla färsk xylen.
3c. Använd färska lösningar i
buffert-bad och tvättflaskor.
3d. Använd kortare inkubationstid
med substratkromogenlösning.
3e. Använd en fuktig kammare.
Torka endast tre till fyra
objektglas åt gången innan
reagensen appliceras.
3f. Applicera en
blockeringslösning
innehållande ett irrelevant
protein.
3g. Använd en svagare spädning
av den primära antikroppen.
OBSERVERA: Om problemet inte kan tillskrivas något av orsakerna ovan, eller om förslag till åtgärd inte löser
problemet, ring Dako Teknisk Support för vidare assistans.
Ytterligare information om färgningsteknik och provberedning finns i Handbook -Immunochemical Staining
Methods2 (tillgänglig från Dako), Atlas of Immunohistology9 och Immunoperoxidase Techniques, A Practical
Approach to Tumor Diagnosis.10
Referenser
1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press
1981; 81
2. Naish SJ (ed). Handbook–immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989
3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836
4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and
definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24–A:4
5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control.
Biotech & Histochem 1991; 66:194
6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J
Histochem Cytochem 1987; 35:213
7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol
Press 1990; 46
8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A
possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626
9. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
10. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis.
Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
Ytterligare referenser
Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195
Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol.
Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3–8
Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a
traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad
Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl
Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
Bisgaard K. EnVision Plus–Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl
Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20–25
(107510-004)
302059SE_003 s. 5/6
Edition 11/12
(107510-004)
302059SE_003 s. 6/6
