speciell del - Mikrobiologi.net

SPECIELL DEL
117
118
Provtagning-allmänt
Märkning av prov och remiss
Stor noggrannhet krävs vid märkning av prov och remiss. Socialstyrelsen har för att
förhindra förväxlingar utarbetat nedanstående författningar:
SOSFS 1989:1 Åtgärder för att förhindra förväxlingar inom hälso- och sjukvården
Från denna författning har nedanstående citat hämtats (vår kursivering):
-”Väsentligt för säkerheten är också tillfredsställande rutiner för märkning av röntgenfilmer, laboratorieprov och i förekommande fall läkemedel.”
-”För att minimera säkerhetsrisker av ovan nämnd karaktär föreskriver Socialstyrelsen, att föreskrifter i dessa avseenden skall finnas vid sjukvårdsinrättningarna.
Då i övrigt betydande skillnader i lokal organisation kan föreligga är det av vikt att
föreskrifterna utfärdas lokalt av vederbörande ansvarig klinikchef/motsvarande.
Dessa bör dock i möjligaste mån utformas enhetligt inom ett sjukvårdsområde. De
bör därför fastställas av sjukvårdsstyrelse eller direktion såvida de inte avser ett
begränsat verksamhetsområde.”
-”Lokala föreskrifter av angivet slag skall upprättas med iakttagande av Socialstyrelsens nedanstående föreskrifter. Dessa behandlar dock inte kliniskt kemisk och
bakteriologisk verksamhet m.m. Provtagning och provhantering måste givetvis
även inom dessa områden ske på sådant sätt att risk för förväxling elimineras så
långt som möjligt. Vid utformningen av lokala rutiner och föreskrifter härför skall i
tillämpliga delar beaktas Socialstyrelsens föreskrifter (1984:27) om blodgivning,
blodtransfusion m.m.”
-”Oidentifierad patient. Vid intagning av patient, vars identitet inte kan fastställas
eller i fråga om vilken erhållna uppgifter är osäkra eller ofullständiga, skall namn
och personnummer ersättas med löpnummer. Nummerbeteckningen måste anges i
samtliga patientens handlingar samt på etiketter till provrör och annat materiel som
är hänförligt till patienten”.
-”Även objektglas bör märkas med så fullständiga identitetshandlingar som möjligt.
Det kan emellertid av utrymmesskäl vara nödvändigt att utelämna vissa markeringar. Ett minimikrav bör dock vara att glasen förses med patientens födelsenummer och initialer.”
-”Vid provets ankomst till det laboratorium som skall utföra undersökningen skall
provkärlens/objektglasens märkning och antal kontrolleras mot remissen.”
-”Efter förlossningen kommer modern att vara försedd med ett band för egen iden119
titet och ett band för varje levande barn. Det nyfödda barnets identitetsnummer
skall finnas angivet i samtliga handlingar som rör barnet under dess vistelse på
förlossnings- och BB-avdelning.”
SOSFS 1989:38 Blodgivning, blodtransfusion (ersätter 1984:27)
Från denna författning har nedanstående citat hämtats (vår kursivering):
- ”Det är av största vikt att betryggande rutiner utarbetas för identifiering av patienten vid provtagning.”
-”Etikettering får inte ske efter provtagningen. Lossnar etiketten från provtagningsröret sedan provet tagits, skall provet kasseras.”
-”I direkt samband med provtagningen kontrolleras att provtagningsrörets etikett
och remissen innehåller korrekta identitetsuppgifter.”
-”Gällande föreskrifter för kontroll av patientens identitet i samband med provtagning måste noggrant följas även i dessa situationer. Beträffande oidentifierade
patienter gäller särskilda föreskrifter (SOSFS 1989:1).”
Analysbeställning/remiss
Remissen bör innefatta information om:
• relevant anamnes, diagnos och uppkomstmekanism till infektionen, antingen i
form av klartext eller som ICD-10 kod.
• eventuell antimikrobiell behandling (genomgången, pågående, planerad).
• specificerat anatomiskt provtagningsställe (enbart sår räcker t.ex. inte).
• typ av provmaterial (pus, biopsier etc.).
• önskad analys inklusive speciella analyser alternativt konsultation/frågeställning till den kliniske bakteriologen.
• provtagningstidpunkt.
• beställare av analysen (läkare, klinik och adress).
• spårbara patientdata.
Förutsättningar
Prov ska tas enligt laboratoriets anvisningar av personal med adekvat kunskap.
Val av provtagningsmateriel
Se Provtagning, klinisk del.
Val av komponent vid analysbeställning
Remissen till det bakteriologiska laboratoriet ska utformas så att remitterande
läkare kan välja:
120
•
•
önskad analys inklusive speciella analyser alternativt
konsultation/frågeställning till den kliniske bakteriologen.
Förberedelser
Ta fram provtagnings-/transportmaterial och remiss. Observera att remiss och
provtagnings-/transportmaterial endast får finnas framdukat för den patient som
provtagningen gäller!
Märkning
Fyll i remissen med uppgifter enligt Märkning av prov och remiss, samt Analysbeställning/remiss.
Märk provtagnings-/transportmaterial med data spårbara mot remiss.
Godkända undantag:
•
•
•
•
Objektglas. Av utrymmesskäl godkänns märkning med patientens födelsenummer och initialer på objektglas.
Okänt personnummer. Remisser ska märkas med födelseår, mån, dag samt
namn. Märk provtagnings-/transportmaterial med data spårbara mot remiss.
Nyfödda. Remisser ska märkas med efternamn, kön, födelseår, mån, dag samt
ID-nummer enligt ID-band. Märk provtagnings-/transportmaterial med data
spårbara mot remiss.
Oidentifierad patient. Remisser ska märkas med löpnummer samt ID-nummer enligt ID-band. Märk provtagnings-/transport-material med data spårbara
mot remiss.
Utförande
Märkning och provtagning ska ske i en seans.
• Ta fram och märk remiss samt rekommenderat provtagnings-/transportmaterial
(se Provtagning, praktiskt utförande).
• Kontrollera patientens identitet.
• Ta prov. Kontrollera att uppgifterna på remiss och provtagnings-/transportmaterial överensstämmer i anslutning till provtagningen.
• Förslut provtagnings-/transportmaterial och placera detta och remissen så att
sammanblandning inte kan ske med andra prov.
• Ange provtagningstidpunkt och datum på remissen.
• Provtagaren ska signera remissen.
• Packa prov enligt gällande föreskrifter, se SMIs hemsida.
• Transportera prov till laboratoriet. Alla prov ska transporteras så snart som
möjligt till laboratoriet. Om det inte kan ske ska nedanstående riktlinjer användas för förvaring och transport. Prov för bakteriologisk odling bör nå labo121
ratoriet inom 24 timmar.
Provtagning-klinisk del
Provtagning
Slutna infektioner. För provtagning av infektionsfokus utan direkt kontakt med
slemhinna eller hud, t.ex. flegmone eller abscess, rekommenderas aspiration med
spruta eller ultraljudsledd punktion. Det infektiösa materialet sprutas ned i en steril
membranförsedd syrefri transportbehållare utan transportmedium om
polymikrobiell flora misstänks annars i blododlingsflaskor.
Öppna sår. Provtagning av öppna sår kan ske med ytprov eller biopsi/vävnadsprov.
En mängd olika verktyg och tekniker finns beskrivna för att provta sårytor:
fiberarmerade pinnar (ofta bomull eller dacron), velvet pad och andra textila
materiel, agar imprint (tryckplatta) och membranfilterteknik är s.k. torra metoder.
Metoderna är behäftade med en inbyggd motsättning: i provtagningsögonblicket
eftersträvas en stark adhesiv funktion hos provtagningsverktyget medan denna
funktion motverkar avskiljningsförmågan vid utodling på fasta medier. Väsentligt
högre bakterieandel kan dock utvinnas ur provet om provtagningsverktyget
vortexas i ett flytande medium före utodling. Ett alternativ till bomull och dacron är
alginat som löses upp i flytande medium före provsättning.
Idealt bör provtagning dessutom ske av hela såret under standardiserade tryckförhållanden. Detta kan utföras endast med irrigationsteknik, vilket är en för
omständlig metod för rutinbruk.
Vid biopsi/vävnadsprovtagning desinficeras sårytan först med sprit. Därefter tas en
biopsi som flamberas och vägs före homogenisering i standardiserad mängd vätska
och utodling på fasta medier efter seriespädning. Metoden betecknas som ”gold
standard” och har använts för att att kvantifiera bakteriemängd före delhuds-transplantation vid brännskador. Metodens omständlighet och traumatiska potential vid
kroniska sår utesluter rutinmässigt bruk.
Våra nuvarande provtagningsrutiner för misstänkt infekterade sår med olika varianter av ”bomullspinne” i geltransportrör bygger på en cirka 50-årig tradition.
Vetenskaplig utvärdering av denna standardmetod är bristfällig och delvis motsägelsefull. Från reproducerbarhetsstudier i öppna sår har variationen beräknats till
1,5-1,7 log10 CFU (95 % c.f.) medan motsvarande siffra för vävnadsbiopsiteknik är
1,3 log10 CFU. Vid kontamination av operationssår ligger bakterierna till synes
slumpvis fördelade i områden med hög bakterietäthet respektive områden med låg
bakterietäthet. Sådan ojämn fördelning tycks också förekomma vid etablerade
122
infektioner, vilket förutom initialt ojämn kontamination kan ha med lokala sårfaktorer under kolonisationsfasen att göra. Vid en vetenskaplig utvärdering brukar
därför provtagningen omfatta hela såret för att fånga alla förekommande mikrober,
d.v.s. hög sensitivitet eftersträvas. Provtagningen i kliniken är mer inriktad på att
hitta etiologiskt agens, d.v.s. hög specificitet eftersträvas. Prov tas då i lesionskanten, d.v.s. på gränsen mellan frisk och infekterad vävnad.
Trots brister med fiberarmerad pinne kan konstateras:
att detta är referensmetoden för rutinprovtagning av öppna sår,
att metoden kan optimeras med omsorgsfull provtagning,
att högre sensitivitet erhålles med eluering av bakterier i vätska före utodling på
fasta medier.
Den ständigt återkommande frågan hur ytodlingen återspeglar vad som pågår djupare i vävnaden saknar ett entydigt svar. Inom svensk mikrobiologi är direktmikroskopi av pus och vävnadsbiopsi ej den självklara rutin som återfinns i det anglosaxiska området. De kliniska kollegornas intresse för detta har dock ökat i takt med
den ökade frekvensen av fasciiter.
Laboratorierna har standardiserade och validerade metoder för analys av prov.
Dessa metoder förutsätter att prov tas på rätt indikation samt att provtagning och
transport utförs korrekt. Om den preanalytiska delen av vårdkedjan inte fungerar
tillfredställande, kan inte laboratoriet trots hög kvalitet på analysarbetet producera
adekvata resultat som är till nytta för vården av patienten.
Kommunikationen mellan laboratoriet och kliniken är viktig för analysresultatet.
Laboratoriet måste få viktiga upplysningar om patientens kliniska tillstånd och
eventuell antimikrobiell behandling. Laboratoriet måste också få uppgifter om
provmaterial och om någon särskild undersökning önskas utförd. Ju mindre information som lämnas desto svårare blir det för laboratoriet att korrekt tolka analysresultatet och relatera detta till vården av patienten.
Det kliniska laboratoriet ska därför upprätta och tillhandahålla provtagningsföreskrifter för sina uppdragsgivare. Både den behandlande läkaren och den
provtagande personalen måste få kunskaper om indikationer för och begränsningar i
analysen samt korrekt provtagnings- och transportmetod för en optimalt utnyttjad
laboratorieanalys.
Prov för allmän bakteriologisk odling innehåller oftast levande mikroorganismer
med mindre eller större sjukdomsframkallande förmåga. Det är därför av yttersta
vikt att nedanstående punkter beaktas vid remisskrivandet och provtagningen:
Kliniska remissuppgifter. Den stora variationen vad gäller den transienta/residenta floran och mikroorganismernas sjukdomsframkallande förmåga på
123
olika delar av kroppen och vid olika sjukdomstillstånd, gör att det kliniskt mikrobiologiska laboratoriet behöver stringenta kliniska uppgifter (se
analysbeställning/remiss) på remissen för att kunna utföra analysen och tolka
analysresultatet.
Prov ska tas vid misstänkt infektionsfokus där koncentrationen av sjukdomsframkallande mikroorganismer sannolikt är störst. Vad gäller provtagning från
andra lokaler har exempelvis blododling ett högt prediktivt värde och kan ge
vägledning om var infektionen finns.
Prov ska tas så att det inte förorenas av ovidkommande bakterier och så att tillräcklig känslighet (d.v.s. bakterierna ska kunna fångas) i undersökningen uppnås.
Prov ska transporteras så att överlevnaden av de infektionsorsakande mikroorganismerna gynnas, överväxt av någon annan i provet förekommande art förhindras, samt så att läckage av potentiellt smittsamt material förhindras.
Transportsubstrat för bakteriologiska prov
a) Pinnprov
Olika typer av transportsubstrat avsedda för kliniskt bakteriologiska prov tagna
med fiberarmerad provtagningspinne finns kommersiellt tillgängliga. Dessa baseras
huvudsakligen på Stuarts medium från 1940-talet, vilket senare modifierats för
bättre överlevnad av bland annat gonokocker, men också för att bättre bibehålla
balansen mellan olika bakteriearter när provet innehåller blandflora. Amies
modifiering av Stuarts medium är idag det mest använda. Stuarts medium innehåller
glycerofosfat, vilket kan metaboliseras av vissa koliforma bakterier med risk för
tillväxt under transporten. Glycerofosfat har ersatts av oorganiskt fosfat i Amies
medium. Koltillsats (charcoal), vilken neutraliserar toxiska fettsyror och absorberar
fria radikaler och på så sätt förbättrar överlevnaden av olika mikrober, innebär att
man slipper använda kolade provtagningspinnar vid provtagningen. Koltillsats i
själva mediet är fortfarande kontroversiellt, och enligt en ny svensk studie där man
studerat överlevnaden av olika bakteriearter i olika transportsubstrat tycks kolade
pinnar vara att föredra framför kolat medium. I dag används dock oftast Amies
kolade transportmedium vid våra laboratorier. Trots koltillsats i medium eller på
pinnen är överlevnadstiden av vissa bakteriearter som pneumokocker och
gonokocker vid förvaring i rumstemperatur begränsad, och prov bör därför inte stå
längre tid än 24 timmar före utodling.
Amies kolade transportmedium (fabrikat Copan, Brescia, Italien) anges som referenssubstrat. Provtagningspinnarna är försedda med rayon-tops (spunnen cellulosa)
och finns i olika grovlekar för olika provlokaler. I certifierad batchprövning ingår
ett flertal bakteriearter med angiven överlevnadstid i mediet på minst 24 timmar.
124
Recept, se under Bilaga 1 substrat, 13. transportsubstrat.
b) Transportkärl för anaerobodling
Vid misstanke om infektion med anaeroba bakterier är det ofta lämpligt att använda
särskilda transportkärl. Visserligen överlever många anaeroba bakterier som
Clostridium perfringens och Bacteroides fragilis under åtskilliga timmar i pus,
särskilt om mängden överstiger 2 mL, och i större vävnadsbitar samt i pinnprov
sända i Copan-rör. Prov bör dock vara utodlade samma dag det är taget. Mer
krävande anaerober som fusobakterier kan också i många fall överleva flera timmar
i pus. Om man vid provtagningen erhåller mindre provvolymer motsvarande <1 mL
aspirat bör utodlingen på laboratoriet ske inom 30 minuter. Om detta ej är möjligt
rekommenderas transport i anaerobt transportkärl i form av "gasad" flaska eller rör.
Dock gäller även vid sådan transport att provet helst bör utodlas samma dag det är
taget. Olika varianter av anaeroba transportkärl finns kommersiellt tillgängliga. I
första hand rekommenderas "Anaerobflaska 20 mL, art.nr 9562360, Boule
Diagnostik AB", vilken är en membranförsedd transportflaska gasad med kväve
och utan medium. Vid misstanke på polymikrobiella infektioner bör inte
anrikningsbuljong komma ifråga som transportmedium p.g.a. risk för överväxt av
snabbväxande bakterier. Vid ortopediska och andra infektioner då man inte förväntar sig polymikrobiell flora används ofta FAB eller thioglykollatbuljong för
transport av fast material; dock saknas entydig dokumentation för denna rutin.
125
Tabell 5. Transportmateriel för olika provmaterial
sekret
Aspirat ej möjligt
(X)
X
X
X
(X)
X
X
(2x50mL)
CAPD (PD)-vätska
Fast vävnad och
ej kroppseget
material
Blod odlingsFlaskor
(X)
Sterilt rör, behållare
FAB
Anaerob transportflaska
Provmaterial resp.
Förväntad floratyp (mono/polymikrobiell)
Monomikrobiell
Aspirat
Polymikrobiell
Flytande material,
Provtagningsset med kolat
transportmedium
Transportmateriel
Monomikrobiell
X
Polymikrobiell
Fotnot: X= Rekommenderat provtagnings- och transportmateriel.
(X) = Möjligt andrahandsalternativ.
126
(X)
X
(X)
Provtagning-praktiskt utförande
I Allmän odling
Sekret från öppen provlokal
Analysprincip
Aerob och anaerob odling (undantag se Anmärkningar).
Provtagningsmateriel. Transportkärl
Anaerob transportflaska,
Provtagningsset med kolat transportmedium,
Sterilt rör.
Provtagning, utförande
Sår: Prov ska tas från lesionskanten och inte ytligt eller från exsudatet eftersom det innehåller en tillblandning av den normala floran vilket försvårar
diagnostiken på laboratoriet och kan ge missvisande resultat. Tvätta bort
exsudat med sterilt vatten. Pinnprov kan användas. Snurra
provtagningspinnen i botten av skadan. Stoppa ner pinnen i transportmediet.
Fistlar: Tvätta bort exsudat med sterilt vatten. Prov ska tas från djupet,
helst aspirerat prov via kateter, vilket sätts till anaerob transportflaska. Om
detta inte är möjligt, kan pinnprov användas med reservation enligt ovan.
Förvaring/ Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
Anmärkningar
Normalt odlas ej anaerobt från: Follikulit, Furunklar/karbunklar, Impetigo,
Bullös impetigo, Ritters sjukdom (SSSS), Ektyma, Erysipelas, Erysipeloid,
Puerperal mastit, Dakrocystit, Toxic shock syndrome (TSS), Infektioner i
penis, prostatit, epididymit, bakteriell orkit, vagina, venösa bensår,
brännskador , Okänd/Ingen diagnos samt sår utan närmare specifikation på
remissen.
Sekret från sluten provlokal med förväntad polymikrobiell floratyp; abscess,
cellulit, pilonidalcysta, ”pus i buk”, galla, peritonealvätska, pleuravätska
Analysprincip
Aerob och anaerob odling.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
Anaerob transportflaska.
Provtagningsset med kolat transportmedium.
Sterilt rör.
127
Provtagning, utförande
Anaerob transportflaska: Desinficera huden. Aspirera material och sätt detta
till transportflaskan.
Provtagningsset med kolat transportmedium (kan användas om provet tas
under sterila förhållanden): Desinficera huden. Incidera skadan. Snurra
provtagningspinnen i botten av skadan. Stoppa ner pinnen i
transportmediet.
Sterilt rör: Desinficera huden. Aspirera material och sätt detta till
transportkärlet.
Förvaring/Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
Normalt sterila kroppsvätskor med förväntad monomikrobiell floratyp:
amnionvätska, ascites, ledvätska, perikardvätska, synovialvätska (bursa)
Analysprincip
Aerob och anaerob odling.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
Aerob + Anaerob blododlingsflaska.
Sterilt rör utan tillsatser, om direktmikroskopi önskas.
Provtagning, utförande
Desinficera huden om perkutan provtagning.
Aspirera eller incidera och ta material och sätt detta till transportkärlet.
Förvaring/Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
Fast vävnad, biopsi; ej kroppseget material (kärlkatetrar, skruvar, implantat),
förväntad monomikrobiell flora
Analysprincip
Aerob och anaerob odling.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
FA- buljong.
Sterilt rör utan tillsatser.
Provtagning, utförande
Desinficera huden. Ta material och sätt detta till buljongröret under sterila
betingelser.
Förvaring/Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
128
Fast vävnad, obduktionsmaterial; ej kroppseget material (spiral, dränage),
förväntad polymikrobiell flora
Analysprincip
Aerob och anaerob odling, dessutom förlängd odling vid spiral.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
Sterilt rör, behållare.
Provtagning, utförande
Placera materialet i röret/behållaren.
Förvaring/Transport
Förvaras och transporteras kylt, 2 – 8 °C. Provet får ej frysas.
CAPD (PD)- dialysvätska
Analysprincip
Aerob, anaerob odling, svampodling.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
2 st 50 mL centrifugrör.
Aerob + Anaerob blododlingsflaska.
Provtagning, utförande
Desinficera påsen. Aspirera material och sätt detta till var sitt centrifugrör.
Förvaring/Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
Anmärkning
Aerob samt anaerob blododlingsflaska används med gott resultat vid
bakteriologiska laboratorier. Sammanlagt har 2x10 mL prov tagits vid
varje provtagningstillfälle.
Sekret från cervix, vulva, vagina
Analysprincip
Aerob odling.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
Provtagningsset med kolat transportmedium.
Provtagning, utförande
Cervix: Snurra provtagningspinnen i cervixkanalen. Stoppa ner pinnen i
transportmediet.
Vulva, vagina: Snurra försiktigt provtagningspinnen på slemhinnan.
Stoppa ner pinnen i transportmediet.
Förvaring/ Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
129
Anmärkningar
Speciell provtagning för N. gonorrhoeae, C. trachomatis.
Odling på prov från vagina eller vulva kan vara indicerat hos prepubertala
flickor samt vid svampfrågeställning.
II Speciell odling
GBS-odling-övervakningsodling
Provtyp
Sekret vagina (introitus) och rektum.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
Provtagningsset med kolat transportmedium x 2.
Provtagning, utförande
Ta prov från introitus vaginae respektive rectum med var sitt pinnprov.
Stoppa ner pinnen i var sitt transportmedium. Begär GBS-odling på
remissen.
Förvaring/Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
Specifik odling
Actinomyces spp, Bartonella spp, Borrelia spp, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Leptospira spp, Nocardia spp, Streptobacillus moniliformis, Bacillus anthracis, Brucella spp, Burkholderia mallei och pseudomallei,
Francisella tularensis, Rickettsia spp, Yersinia pestis,
Provtyp.
Provtagningsmateriel.
Transportkärl.
Varierande, se Agens associerade med specifika
Provtagning, utförande. sjukdomstillstånd respektive Klass 3 organismer.
Förvaring/Transport.
130
Specifik odling
MRSA, VRE, multiresistenta gramnegativa stavar
Provtyp.
Provtagningsmateriel.
Transportkärl.
Varierande, se www.srga.org
Provtagning, utförande.
Förvaring/Transport.
Specifik odling;
Sexuellt överförbara sjukdomar
Provtyp.
Provtagningsmateriel.
Transportkärl.
Varierande, se referensmetodik I 6.
Provtagning, utförande.
Förvaring/Transport.
III Mikroskopi
Direktmikroskopi; Gramfärgning, Acridinorangefärgning
Provtyp
Sekret,Vävnad.
Provtagningsmateriel. Transportkärl
Objektglas.
Anaerobt transportkärl.
Steril behållare utan tillsatser.
Provtagning, utförande
Ta prov enligt respektive provlokal och applicera materialet på
objektsglaset. Alternativt kan materialet skickas till laboratoriet i
transportmedium eller sterilbehållare.
Förvaring/Transport
Förvaras och transporteras i rumstemperatur. Provet får ej frysas.
Besträffande diagnostik av bakteriell vaginos inklusive gramfärgning av
vaginalutstryk se I 6.
131
Transport
För transportanvisningar hänvisas till Packa Provet Rätt, som återfinns i ny upplaga på SMIs hemsida:
www.smittskyddsinstitutet.se . Sök under Publikationer –övriga trycksaker.
132
Ankomstkontroll på laboratoriet
Kontrollera;
att provkärlens/objektglasens märkning och antal överensstämmer med remiss.
att beställare finns angivet.
att rekommenderat provmaterial tagits till undersökningen.
att rekommenderad transporttid ej överskridits.
Avvikelser från ovanstående bör föranleda diskussion med beställaren. Om behandlande läkare anser nytt prov inte kan tas och att analysen ska utföras och rapporteras trots felaktigheter på det inkommande provet, ska felkällorna kommenteras
i laboratorierapporten.
133
Provsättning
Allmän odling, referensmetodik
1. Aerob odling
Alla typer av prov, definierade i tabell 6, odlas primärt på blodagar, hematinagar
och CLED-agar. I förekommande fall sätts prov också till anrikningsbuljong, FAB.
Prov som anländer till laboratoriet i blododlingsflaskor, inkuberas upp till 10 dygn
och sekundärsprids närhelst indikation till växt föreligger. Sådana prov som utgörs
av fast vävnad etc., vilka överförs till anrikningsbuljong, sekundärsprids på
agarplattor av samma sort. Buljongen inkuberas totalt 10 dygn.
2. Anaerob odling, rutinnivå
Metoden avser miniminivå för anaerob odling som i förekommande fall
kompletterar aerob odling, se också tabell 6, fotnot 4. Prov inokuleras på anaeroba
blodplattor, FAA (se nedan), som görs semiselektiva genom applikation av
aminoglykosid- och metronidazollappar i primärstryket (se tabell 6, fotnot 5).
Inokulera även anaerob buljong (FAB) som inkuberas aerobt eller anaerobt.
De anaeroba blodplattorna bör vara prereducerade eller färska. Inokulering sker i
anaerobbox (referensmetod), men aerob provsättning med sekundär inkubering i
klocka med gasgenererande kuvert som t.ex. Anaerogen (OXOID) eller i klocka
med evakueringssystem är accepterad alternativ metodik. Med kuvert erhålls god
anaerobios tillräcklig för flertalet kliniskt relevanta anaeroba bakterier. Med
resazurin som indikator garanteras redoxförhållanden ≤ 110 mV. Avläs dag 2 eller
efter medicinsk bedömning. Observera att anaerobt inkuberade plattor inte bör
exponeras för luft under de första 48 timmarna. Vissa långsamväxande arter, hit hör
peptostreptokocker och svartpigmenterade gramnegativa stavar som
Porphyromonas, Prevotella, och Bilophila kan behöva inkuberas ytterligare en eller
flera dagar för detekterbara kolonier. Andra anaeroba bakterier, t.ex. Actinomyces
kan behöva 7-10 dagars inkubationstid. FAB granskas för växt dagligen upp till 10
dygn.
Den förenklade anaeroba odlingen är med beskrivna förbehåll fullt acceptabel i
rutindiagnostiken. Det enskilda laboratoriet definierar utifrån denna miniminivå
eventuell modifiering av anaerobdiagnostiken, innefattande förlängd inkuberingstid, bruk av selektiva medier (se nedan), särskilt i de fall anaerob odling speciellt
begärts.
3. Anaerob odling, jämförelsenivå
Metoden bör användas vid studier men kan även användas i rutinen efter särskild
medicinsk bedömning. Prov inokuleras på prereducerade eller färska anaeroba
134
blodagarplattor, d.v.s. FAA, samt två typer av selektiva FAA; kana-vanko-agar och
neomycinagar (enligt bilaga 1). Inokulera även anaerob buljong (FAB) i förekommande fall och inkubera denna anaerobt.
För anaerob miljö används anaerobbox i vilken all hantering av provet sker (miljö
10 % H2, 5-10% CO2, 80-85 % N2. Alternativ är inkubering i någon typ av klocka
(se under punkt 2).
Inkubera anaeroba plattor och eventuell buljong 10 dygn. Daglig avläsning.
Speciell odling, referensmetodik
Val av medier, atmosfär, temperatur och inkubationstid beskrivs i tabell 7.
135
Tabell 6. Allmän aerob och anaerob odling, referensmetodik
Inkubationsatmosfär (35-37 °C), tid (dygn)
Ae/A BlodBlod- agar4
odl.flaska Luft
Hematin
agar4
CLEDagar4
Luft
Anaerob
Blodagar 4, 5, 6
Anaerobt
FAB
Ae/An
CO2
Sekret från öppen provlokal;
sår1, fistel
Sekret från sluten provlokal
med förväntad polymikrobiell
floratyp;+ abscess, cellulit,
pilonidalcysta, ”pus i buk”, galla,
peritonealvätska, pleuravätska
Normalt sterila kroppsvätskor
med förväntad monomikrobiell
floratyp; amnionvätska , ascites,
ledvätska , perikardvätska,
synovialvätska, (bursa)
Subkultivering vid växt i blododlingsflaskor
Fast vävnad, biopsi, ej
kroppseget material
(kärlkatetrar, skruvar,
implantat) med förväntad
monomikrobiell floratyp;
Vävnad, biopsi samt ej
kroppseget material.
Subkultivering av FA-buljong
Fast vävnad,
obduktionsmaterial, ej
kroppseget material (dränage)
med förväntad polymikrobiell
floratyp.
Ej kroppseget material med
förväntad polymikrobiell
floratyp;
Spiral
CAPD-vätska
Sekret, vulva, vagina2
Sekret cervix3
2
2
2
2/10
2
2
2
2/10
2
2
2
2/10
10
10
10
2
2
2
2/10
2
2
2
2/10
10
2
2
2
2/10
10
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2/10
10
136
2/10
Fotnot till Tabell 6:
1.
Anrikning i buljong av pinnprov anses ej indicerat.
2.
Sexuellt överförbara sjukdomar, se referensmetodik I 6. Prediktivitet kan inte
anges för patogenicitet för prov från nedre genitalia förutom vissa specifika
frågeställningar (t.ex. Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis) samt för
prov från prepubertala flickor med avseende på vanliga övre luftvägspatogener
(t.ex. Haemophilus influenzae, S. pyogenes). Odling på prov från vagina kan vara
indicerat hos prepubertala flickor samt vid svampfrågeställning. Se även speciell
odling, GBS-odling.
3.
Cervixodling kan spegla etiologier vid PID men har låg specificitet, se avsnitt
infektioner i inre genitalia. Med tanke på normalflorans sammansättning och
dominansen av anaerober vid rubbad normalflora torde även negativa svar av
typen ”Ordinär flora” kräva anaerob odling.
4.
Vid följande kliniska remissuppgifter är det acceptabelt att enbart inkubera i luft
samt CO2-miljö: Follikulit, Furunklar/karbunklar, Impetigo, Bullös impetigo,
Ritters sjukdom (SSSS), Ektyma, Erysipelas, Erysipeloid, Puerperal mastit, Dakrocystit, Toxic shock syndrome (TSS), Infektioner i penis, Prostatit, Epididymit,
Bakteriell orkit, Vagina, Venösa bensår, Brännskador, Okänd/Ingen diagnos.
Övriga kliniska diagnoser inkuberas enligt ovan.
5.
Lägg gentamicin (30 µg) - och metronidazol (10 µg) - lappar i primärstryket.
Anaeroba bakterier växer oftast in i gentamicinzonen men ej i
metronidazolzonen.
6.
Selektiva anaeroba odlingsmedia inkuberas 10 dygn.
Tabell 7. Speciell odling, referensmetodik
Inkubationsatmosfär (35-37 °C), tid (dygn)
Fårblod- GBSMSA
VRECLEDagar
buljong
buljong agar
CO2
CO2
Luft
Luft
Luft
GBS
2
1
Multiresistenta bakterier (MRSA, VRE,
2
1
1
multiresistenta gramnegativa stavar)
Actinomyces spp, Bartonella spp, Borrelia
spp, Clostridium tetani, Corynebacterium
diphtheriae, Leptospira spp, Nocardia spp,
Se Agens associerade med specifika
Streptobacillus moniliformis, Bacillus
sjukdomstillstånd respektive Klass 3 organismer
anthracis, Brucella spp, Burkholderia
mallei och pseudomallei, Francisella
tularensis, Rickettsia spp, Yersinia pestis
137
Inokulering av medier
Allmänt
Inokulera alltid medier i en bestämd ordning med det minst selektiva mediet
först. Provmaterialet kan kastas en vecka efter att provet primärodlats, eller
efter medicinsk bedömning. Lämpliga metoder för provapplikation på
agarplattor beskrivs i figur 7 och 8. Märk först agarplattorna med Labnr och
inokuleringsdatum. Primärstryk i förekommande fall med provtagningspinne
(fig 7) eller applicera ca 100 µL material på plattan (fig 8).
Applikationsställen för
eventuella gentamicin- och
metronidazol-lappar
Figur 7. Inokulering av agarplattor med provtagningspinne.
Gör först ett rakt primärstryk. Stryk sedan vinkelrätt mot detta första stryk.
Rotera pinnen under hela stryket. Återställ provtagningspinnen i transportröret.
Sekundärstryk med plastinös enligt 2 och 3.
Figur 8. Inokulering av agarplattor med flytande material. Primärstryk
agarplattorna med plastinös enligt 1. Stryk först ett rakt stryk. Stryk sedan
vinkelrätt mot detta första stryk. Sekundärstryk med plastinös enligt 2 och 3.
138
Inokulering av flytande medier
Märk buljongrör med Labnr och inokuleringsdatum.
Ta provmaterial med engångs plastpipett/sterila instrument och inokulera
mediet.
Direktmikroskopi
Märk objektglas med Labnr.
Ta provmaterial med engångs plastpipett/sterila instrument och stryk på objektglaset.
Provmaterialrelaterad beskrivning
Allmän odling
Sekret pinnprov i transportrör
Öppna transportröret och ta ut provtagningspinnen.
Inokulera och inkubera medier.
Sekret i anaerob transportflaska eller sterilt rör/kärl
Homogenisera innehållet genom att vortexa eller vända det förslutna röret
några gånger.
Öppna röret och ta material med engångs plastpipett. Förslut röret.
Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först.
Vävnad i sterilt rör/kärl
Öppna röret och ta material.
Placera materialet i steril mortel.
Homogenisera materialet i steril mortel. Tillsätt lite FA-buljong om provet
är torrt.
Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först.
Vävnad i FA-buljong med tecken på växt vid ankomst
Vortexa eller vänd det förslutna röret några gånger.
Öppna röret och ta material med engångs plastpipett. Förslut röret.
Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först.
Vävnad i FA-buljong utan tecken på växt vid ankomst
Inkubera röret.
Inokulera och inkubera medier vid tecken på växt. Vid tveksamhet om växt
är det lämpligt att gramfärga buljongen samt subkultivera till agarplattor.
139
Ej kroppseget material i FA-buljong
Inkubera i 10 dygn i 35 ° - 37 °C.
Inokulera och inkubera medier vid tecken på växt. Vid tveksamhet om växt
är det lämpligt att gramfärga buljongen samt subkultivera till agarplattor.
Ej kroppseget material i sterilt rör/kärl med förväntad monomikrobiell
floratyp
Öppna röret och placera materialet i FA-buljong.
Inkubera i 10 dygn i 35 ° - 37 °C.
Vid växt ta material från buljongröret. Inokulera och inkubera medier.
Ej kroppseget material i sterilt rör/kärl med förväntad polymikrobiell floratyp (spiral, dränage)
Placera under anaeroba och sterila betingelser.
• spiralen i steril petriskål och tillsätt FA-buljong. Skaka försiktigt.
• alternativt i FA-buljongrör och vortexa.
Inokulera medier med hjälp av plastpasteurpipett. Gör anaerob odling först.
Blododlingsflaskor med tecken på växt vid ankomst
Odla ut vid ankomsten.
Inokulera och inkubera medier.
Tillsätt näringssubstrat enligt tillverkarens anvisningar.
Inkubera flaskorna ett dygn i 36 °C innan eventuell ny utodling (eller tills
blododlingssystemet signalerar).
Om det växer rikligt på direktutodlade medier behöver provet inte odlas ut
igen.
Blododlingsflaskor utan tecken på växt vid ankomst
Tillsätt näringssubstrat enligt tillverkarens anvisningar.
Inkubera flaskorna i 36 °C och avläs i fem dygn (eller tills
blododlingssystemet signalerar) innan eventuell utodling.
Inokulera och inkubera medier.
CAPD (PD), dialysvätska
Desinficera dialyspåsen.
Aspirera 100 mL dialysvätska och sätt till 2st 50 mL centrifugrör.
Centrifugera båda rören i 2000 x g, 10 min.
Sug av ovanvätskan med steril engångspipett av plast. Kasta ovanvätskan.
Om endast liten mängd sediment, lämna kvar totalt ca 2 mL i röret för
utodling.
Inokulera från sedimentet: 0,1 mL/agarplatta samt 0,5 mL till
140
anrikningsbuljong.
Lägg ev. material på ett märkt objektsglas för direktmikroskopi.
Om blododlingsflaskor eventuellt använts, åtgärdas de enligt ovan.
Speciell odling
GBS-odling
Inokulera provtagningspinnarna från vagina respektive rektum
tillsammans i anrikningsbuljong för grupp B streptokocker, ”GBSbuljong”.
Inkubera buljongen i 1 dygn 35 °-37 °C.
Inokulera en fårblodagarplatta med den inkuberade buljongen.
Inkubera plattan i 35 °-37 °C. Avläs efter 1 dygn. Om ingen växt av GBS,
reinkubera agarplattan 1 dygn .
141
Identifiering av bakterier i rutindiagnostik
Allmänt
Korrekt identifiering av mikroorganismer i ett prov är av största betydelse för
bedömningen av den kliniska och epidemiologiska relevansen samt för
resistensbestämningen av fyndet. Ett flertal tekniker, med varierande tidsåtgång och
kostnad, finns tillgängliga. Adekvat taxonomisk nivå för rutinmässig identifiering
av mikroorganismer avgörs av flera faktorer som kliniska data, provlokal och
mikroorganismens patogenicitet. Omväxlande används familj, genus, species eller
gruppbeteckningsnivå, vilket framgår av texten. I rutindiagnostiken av patientprov
har processtiden samt kostnaden en avgörande betydelse för val av identifieringsmetod. De observationer och tester som tillämpas syftar till att beskriva bakterien så att den kan jämföras med andra tidigare identifierade bakterier.
Den fenotypiska identifieringen baseras primärt på erfarenhet om de olika isolatens
morfologiska utseende och eventuella lukt. Närmare genus/speciesbestämning sker
via olika spårbara tester. För sällsynta, atypiska och speciella mikroorganismer
(t.ex. de som omfattas av smittskyddslagen) krävs ofta kompletterande tester för
korrekt identifiering.
I fall där närmare genus/speciesbestämning ej anses kliniskt nödvändig används
gruppbeteckningar baserade på växtsätt och kriterier närmare definierade under
resp. avsnitt.
För deskriptiva tolkningar av typ ”normalflora” behöver ofta inga identifieringstest
utföras.
Ställningstagande till diagnostisk nivå (gällande generellt metodval och även i det
enskilda fallet) bestäms av medicinskt ansvarig bakteriolog utifrån lokala erfarenheter och geografisk prevalens av olika mikroorganismer.
I förslaget till minimikriterier har arbetsgruppen valt identifieringstester som är allmänt förekommande i svensk praxis.
Med minimikriterier menas de fenotypiska egenskaper som är praktiskt och taxonomiskt användbara för avsedd nivå och som är adekvata för identifiering i sitt
kliniska sammanhang. De uppfyller också de krav som ställs för artrelaterad
resistensbestämning. De vanligaste patogenerna samt de bakterier som i många
stycken betraktas som föga patogena vid rutinodlingar beskrivs på de följande
sidorna. För mer ovanliga eller svåridentifierade isolat, hänvisas till särskilt avsnitt i
denna bok samt till referenslitteratur eller referenslaboratorium.
Vid validering av alternativ rutinidentifiering bör utvärderingen ske både mot här
angivna tester och mot metodik som tillåter full speciesidentifiering.
142
143
Identifieringsbegrepp
Genus/speciesbestämning
Kliniskt intressanta och vanligt förekommande isolat, angivna med objektiva (t.ex.
biokemiska tester) och subjektiva (t.ex. utseende och lukt) fenotypiska minimikriterier för rutindiagnostik. Ex. Staphylococcus aureus, Enterococcus species.
Gruppbeteckning
Icke taxonomiskt begrepp inom rutinbakteriologin. Beteckning för en, ibland homogen och ibland heterogen, grupp av bakterier med vissa gemensamma objektiva
(t.ex. mikroskopi, biokemiska tester) och/eller subjektiva (t.ex. utseende och
luktfenotypiska) egenskaper. Närmare artidentifiering anses inte nödvändig i
rutindiagnostik.
Ex. Koagulasnegativa stafylokocker (KNS), alfastreptokocker och difteroida stavar.
Växtsätt
I flera fall används begreppen aerob miljö, aerob bakterie, anaerob miljö etc.
Begreppen syftar i första hand på olika mikroorganismers växtsätt i laboratoriemiljö
i relation till syre. I aerob miljö är tillgången på syre god (>20 %) och koldioxidhalten 0,03 %. I anaerob miljö är syrehalten starkt reducerad, under 1 %, samtidigt
som koldioxid och vätgas justerats till ca 10% vardera. Anaerob miljö uppnås
effektivast i anaerobbox, där syrenivåer under 0,1 % kan erhållas. I klockor med
kommersiella gasgenererande system uppnås god anaerobios (syrenivåer på 0,5–1
%) inom någon timme. Även i nedre delen av buljongrör där mediet innehåller små
mängder agar och reducerande substanser som tioglykollat och cystein uppnås
relativt god anaerobios t.o.m. i aerob miljö. I aeroba system föreligger oxiderande
redoxförhållanden, vilket innebär att elektroner kan vandra till syre
(elektronacceptor) som sålunda fungerar oxiderande. Man säger att aerob miljö,
genom syrets egenskaper, kännetecknas av en hög redoxpotential, normalt ca +50
– 75 mV mätt med syre-väte elektroder. I frånvaro av syre föreligger reducerande
redoxförhållanden och låg redoxpotential, idealt ≤250 mV. I mikroaerofil miljö är
syrehalten reducerad jämfört med aerob miljö, med syrenivå på ca 7 % och
koldioxidnivå på ca 14 %.
Syntesen av makromolekyler kräver tillgång till energi. Denna frigörs i aerob
oxiderande miljö under elektronvandringen i den metabola elektrontransportkedjan,
aerob respiration, med syre som terminal elektronacceptor. I anaeroba system
kan energi inte frigöras i en elektrontransportkedja. I sådan miljö tillgodogör sig
mikroorganismerna energi genom anaerob fermentation som är en direkt
enzymatisk attack på socker. Denna typ av metabolism är långt mindre effektiv än
144
den aeroba elektrontransporten vad avser mängden frigjord energi.
Vid aerob respiration bildas skadliga reaktiva komponenter som väteperoxid,
superoxid och hydroxylradikaler. Aeroba bakterier skyddar sig mot dessa med
olika enzymsystem som superoxid-dismutas och katalas. De flesta anaeroba
bakterier saknar sådana skyddande enzymer och dör i närvaro av syre. Vissa
aerotoleranta anaeroba bakterier skyddar sig med NADH-oxidas som med vätgas
omvandlar syre till vatten.
Definitioner
Obligat (strikt) aerob; Växer bara vid god syretillgång med oxiderande
redoxförhållanden (aerob miljö). Metabolism av typ aerob respiration, d.v.s. syre
fungerar som terminal elektronacceptor. Exempel på sådana organismer är
Acinetobacter, Moraxella och Pseudomonas.
.
.
Obligat (strikt) anaerob; Växer bättre i frånvaro av syre under reducerande
redoxförhållanden (anaerob miljö) än i aerob miljö. Metabolism av typ anaerob
fermentation. De flesta kliniskt relevanta obligat anaeroba bakterier är relativt
toleranta mot syre och kan växa vid syrenivåer på någon eller t.o.m. några procent.
Hit hör Bacteroides, Prevotella, Veillonella och Clostridium perfringens. Vissa
arter, t.ex. Clostridium haemolyticum, vissa isolat av Prevotella melaninogenica är
intoleranta även mot små restmängder syre på nivåer från 0,1 %.
Propionibacterium acnes kan växa vid endast lätt reducerad syrehalt i 5-10 %
koldioxid. Vissa streptokockarter som metaboliserar med anaerob fermentation kan
likväl växa också i aerob miljö. Dessa kallas ”aerotoleranta anaerober”.
Fakultativt anaerob; Kan växa i aerob och anaerob miljö och växlar därvid mellan
aerob respiration och anaerob fermentation. Exempel är stafylokocker,
enterokocker, många streptokocker, Enterobacteriacae, Vibrio och Haemophilus.
Mikroaerofil; Växer bara i miljöer med reducerad syrehalt där de dock använder
aerob respiration. Exempel är Campylobacter species.
(För fullständig definition av begreppen se Bergey´s manual, 9th ed, 1994. Se också
bilaga 2).
145
Grampositiva kocker
Stafylokocker
Karakteristiskt koloniutseende. Växer både i aerob och anaerob miljö.
Grampositiva kocker i klasar, diplo- eller tetradställning. Katalaspositiva.
Speciesbestämning, minimikriterier
Staphylococcus aureus
Typisk kolonimorfologi. Dnas-positiv eller positiv agglutinationstest
(clumping faktor, protein A) eller rörkoagulas (med steril EDTA
kaninplasma) avläst efter 4 tim. Enstaka S.aureus blir positiva i rörkoagulas
först efter ytterligare 20 tim i rumstemperatur som är referensnivå och bör
användas bl.a. vid tveksamhet samt vid misstanke om MRSA.
Anm. S. lugdunensis, S. saprophyticus och S. schleiferi kan ge positiv agglutinationstest; S. intermedius och S. hyicus som huvudsakligen förekommer
hos djur kan ge positiv rörkoagulas efter 12 till 24 tim.
Staphylococcus lugdunensis
Typiskt gulaktigt koloniutseende på blodagar. Ofta karakteristisk lukt. Dnas
ger en karakteristiskt liten diffus uppklarning. Ornitindekarboxylaspositiv.
Anm. Kan uppvisa positiv agglutinationstest för S. aureus. Rörkoagulasnegativ.
Staphylococcus intermedius
Dnas-positiv. Koagulaspositiv. Positiv för pyrrolydonylarylamidas (PYR).
Till skillnad från S. aureus är S. intermedius VP-negativ. Intressant vid
djurbett.
Gruppbestämning
Koagulasnegativa stafylokocker (KNS)
Dnas-negativ. Innefattar ett flertal arter såsom Staphylococcus capitis,
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus
saprophyticus, Staphylococcus warneri, Micrococcus species.
Övrigt
MRSA: Isolatet verifieras med avseende på nuc- och mec-A-gen samt typas
epidemiologiskt.
146
Dnas
Clumping faktor
Ornitin- dekarboxylas
PYR
VP
Staphylococcus aureus
Staphylococcus lugdunensis
Staphylococcus intermedius
Koagulas
Tabell 8. Sammanfattande tabell för speciesbestämning av stafylokocker
+
+
+
±
+
+
±
±
+
-
+
+
+
+
-
Enterokocker och Streptokocker
Karakteristiskt koloniutseende.Växer både i aerob och anaerob miljö.
Grampositiva kocker i kedjor eller i diploställning. Katalasnegativa.
Speciesbestämning, minimikriterier
Enterococcus faecalis
Typisk kolonimorfologi. Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv för
pyrrolydonylarylamidas. Galla-eskulinpositiv. Tellurit (konc. 0,04 %)
positiv. Arabinosnegativ.
Anm. Även Grupp D streptokocker blir positiva i galla-eskulin.
Enterococcus casseliflavus kan vara positiva för tellurit (<3 %).
Enterococcus faecium
Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv för pyrrolydonylarylamidas. Gallaeskulinpositiv. Tellurit ( konc. 0,04 %) negativ. Arabinospositiv.
Anm. Även Grupp D streptokocker blir positiva i galla-eskulin.
Streptococcus pneumoniae, pneumokocker
Mukoida eller navlade kolonier med alfahemolys. Optochinkänslig
(gränsvärde enligt tillverkaren).
Anm. Gall-löslighetstest (2 % eller 10 %) positiv, vilket kan användas som
kompletterande undersökning, speciellt hos pneumokocker med nedsatt
penicillinkänslighet eller vid svårbedömd optochinzon.
Streptococcus pyogenes, grupp A Streptokocker (GAS)
147
Betahemolys på blodagar. Stora kolonier med påvisbart Lancefieldantigen
A.
Streptococcus agalactiae, grupp B Streptokocker (GBS)
Varierande hemolys (alfa, beta eller ingen) på blodagar. Lancefield-antigen
B påvisbart eller positiv CAMP-test.
Gruppbestämning
Enterokocker
Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv agglutinationstest för Lancefield D. Gallaeskulinpositiv (observera att även grupp D streptokocker blir positiva).
Grupp C Streptokocker (GCS)
Stora betahemolyserande kolonier med positivt agglutinationstest för
Lancefieldantigen C.
Anm. VP-negativ.
Grupp G Streptokocker (GGS)
Stora betahemolyserande kolonier med positivt agglutinationstest för
Lancefieldantigen G.
Anm. VP-negativ.
Streptokocker tillhörande Streptococcus milleri-gruppen
Typisk kolonimorfologi ofta nålspetsstora (pinpoint).
Växer bäst i CO2-miljö.Varierande hemolys (alfa, beta eller ingen) på blodagar. Påvisbar agglutination för Lancefieldantigen A, C, G, H eller F. VPpositiv. Innefattar Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus,
Streptococcus intermedius. Typas till speciesnivå (kommersiella kits) vid
kliniskt intresse.
Anm. Stor variation i koloniutseende och hemolys. Ofta typisk lukt av
smörkola.
Grupp D Streptokocker (GDS)
Ingen växt på 6,5 % NaCl-agar.
Positiv på galla-eskulinagar. Negativ PYR-test. Påvisbar agglutination för
Lancefield-D-antigen. Inkluderar exempelvis Streptococcus bovis och
Pediococcus.
Anm. Av intresse vid septikemi.
148
Alfastreptokocker
Varierande hemolys (alfa eller ingen) på blodagar.
Innefattar ett flertal arter såsom Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius,
Streptococcus sanguis, Granulicatella species, Gemella species, Aerococcus
species., Stomatococcus species, Lactococcus species.
Benämningen kräver att arterna under speciesbestämning är uteslutna via
subjektiva eller objektiva metoder.
Övrigt
VRE (vankomycinresistenta Enterococcus faecalis eller Enterococcus
faecium). VRE är orörliga. Isolatet skall verifieras, f.n. med avseende på van A
-och van B-gen samt typas epidemiologiskt.
Anm. Växer på 6,5 % NaCl-agar. Positiv pyrrolydonylarylamidas. Positiv i
agglutinationstest för Lancefield D. Galla-eskulinpositiv (observera att även
andra grupp D streptokocker blir positiva). Tellurit positiv/negativ. van C
förekommer hos vissa rörliga enterokocker (E. casseliflavus, E. Gallinarium).
149
+
-
+
VP
+
-
Rörlighet
Arabinos
+
+
-*
+
-
CAMP- test
Tellurit (0,04 %)
Enterococcus faecalis
+
+ D - Enterococcus faecium
+
+ D - Streptococcus pneumoniae
- + +
Streptococcus pyogenes
A - Streptococcus agalactiae
B - *= Vissa stammar av S. pneumoniae kan vara PYR-positiva.
PYR
Gall-löslighetstest
Optochinkänslig
Lancefieldgrupp
Växt i 6,5 % NaCl
Galla-eskulin
Tabell 9. Sammanfattande tabell för speciesbestämning av enterokocker/streptokocker
-
+
+
+
Grampositiva stavar
Speciesbestämning, minimikriterier
Bacillus species, tillhörande cereus-gruppen
Fakultativt anaeroba. Sporbildare. Katalaspositiv. Lecitinaspositiv
(äggplatta). Se även Klass 3 organismer.
Bacillus species, ej tillhörande cereus-gruppen
Aeroba. Sporbildare. Katalaspositiv. Lecitinasnegativ (äggplatta).
Listeria monocytogenes
Typisk kolonimorfologi. Betahemolys på blodagar. Katalaspositiv (finns
undantag).
Ej sporbildande ibland kockoida grampositiva stavar.
Rörlig. Eskulinpositiv. VP-positiv.
Anm. Positiv CAMP-test på fårblod (L. monocytogenes hemolys är
förstärkt nära indikatorstammen S. aureus). API är ofta av värde. Bildar
syra från ramnos men inte från xylos
Erysipelothrix rhusiopathiae
Tunna filamentösa grampositiva stavar. Ej sporbildare. Katalasnegativ.
H2S-produktion i TSI-rör. Orörlig. Eskulinnegativ.
Anm. API Coryne kan vara av värde.
Rhodococcus equi
Växer strikt aerobt. Grampositiva kockobaciller, katalaspositiv. Ej
sporbildare. Växer med laxköttsfärgade kolonier.
Gruppbestämning
Difteroida stavar
Grampositiva stavar med pleomorft utseende.
Innefattar ett flertal arter såsom Brevibacterium species. Corynebacterium
minutissimum, Corynebacterium species, Arcanobacterium species, Rothia
species, aeroba actinomyceter, Gardnerella species m.fl.
Benämningen kräver att arterna under speciesbestämning och övrigt är
uteslutna via subjektiva eller objektiva metoder.
Övrigt
Corynebacterium diphtheriae
Se Agens associerade med specifika sjukdomstillstånd.
Nocardia species
Se Agens associerade med specifika sjukdomstillstånd.
150
Gramnegativa kocker
Växer bäst i CO2- miljö. Oxidas- och katalaspositiva.
Speciesbestämning, minimikriterier
Neisseria gonorrhoeae (Gonokocker)
Se referensmetodik I 6.
Neisseria meningitidis (Meningokocker)
Se referensmetodik I 9.
Gruppbestämning
Neisseria species
Benämningen kräver att arterna under speciesbestämning är uteslutna via
subjektiva eller objektiva metoder. Innefattar N. elongata, N. flavasceus, N.
sicca, N. subflava m.fl.
Gramnegativa stavar
Enterobacteriaceae
Växer i aerob och anaerob miljö. Oxidasnegativa. Glukosfermenterande
med god växt på MacConkey agarplatta.
Gruppbestämning
Gramnegativa stavar tillhörande Enterobacteriacae
Bakterier som uppfyller grundkriterierna. Innefattar bl.a. Edwardsiella,
Enterobacter species, Klebsiella species, Proteus species, Serratia species,
Citrobacter species, Hafnia alveii.
151
OD
LD
H2S
URE
IND
ONPG
VP
LAC*
Tabell 10. Genus/speciesbestämning, minimikriterier för Enterobacteriacae
+
+
+
+
+ Enterobacter aerogenes
+
+
+
+
+ Enterobacter cloacae
++
+
+
+- Escherichia coli
+
+
+- Escherichia coli, ONPG +
+
+
+
+
+
- Klebsiella oxytoca
+
+
+
+
+
+
+ Klebsiella ornitinolytica
+
+
+
+
+
- Klebsiella pneumoniae
+
+
+ Morganella morganii
++
+
+ Proteus mirabilis**
+
+
+
- Proteus vulgaris
+
-+
- Providentia species
+
+
+ Salmonella, flera***
+ Salmonella Paratyphi A
+
+
- Salmonella Typhi
+- Shigella dysenteriae, flexneri, boydii
+
+ Shigella sonnei
+
+- ++ Yersinia enterocolitica
++
- Yersinia pseudotuberculosis
* LAC= laktosjäsning, VP=Voges-Proskauer test, ONPG=O-nitrofenyl-b-D-galactopyranosid,
IND=Indoltest, URE=Ureastest, H2S=H2S- bildning, LD=Lysindekarboxylas, OD=Ornitindekarboxylas, CIT=Citrat, ADO=Adonitol, ARA= Aranbinos, DN= Dnas.
Salmonella, Shigella och Yersina verifieras enligt referensmetodik I 1.
** Indol-negativ, OD-negativ Proteus kan misstänkas vara P. penneri. Dessa är alltid
ampicillinresistenta och maltospositiva.
*** S. Virchow (grupp C) och S. Arizona kan vara lac+.
152
LAC
VP
ONPG
IND
URE
H2S
LD
OD
CIT
ADO
ARA
DNas
Tabell 10 (fortsättning från föregående sida)
+++
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
++
+
-+
+
-
+
+
+
-+
+
+
+
+
+
-
+
Citrobacter amalonaticus
Citrobacter freundii
Citrobacter koseri LacCitrobacter koseri Lac+
+ Serratia liquefaciens
+ Serratia marcescens
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
Nonfermentativa gramnegativa stavar
Glukosnonfermenterande med god växt på MacConkey-agar.
Speciesbestämning, minimikriterier
Pseudomonas aeruginosa
Växer vanligtvis enbart i aerob miljö men undantag finns. Oxidaspositiv.
Typisk doft och typiskt utseende.
Alternativt: Oxidaspositiv med växt i 42 oC. ADH-positiv samt LDH-negativ.
Anm. Aeromonas kan uteslutas med spot-indol (positiv).
Stenotrophomonas maltophilia
Oxidasnegativ. ONPG-positiv. ADH-negativ samt LDH-positiv. Dnas-positiv.
Imipenem- och meropenemresistent.
Acinetobacter species
Kockoid gramnegativ stav. Oxidasnegativ. Orörlig. ONPG-negativ. ADHnegativ samt LDH-negativ.
Gruppbestämning
Nonfermentativa gramnegativa stavar
Bakterier som uppfyller grundkriterierna.
153
Långsamväxande gramnegativa stavar
Växer bäst i CO2-miljö.
AG
Beta-hem
+
+
-
-
±
±
±
-
+
±
+
-
+
±
+
- + + - - - -
+
+
+
+
-
-
-
-
GFER
AN
±
+
±
±
KAT
NIT
IND
URE
LD
- + +
+ - - - - - -
OX*
OD
Tabell 11. Speciesbestämning, minimikriterier för vissa långsamväxande
gramnegativa stavar
(För Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae
Se referensmetodik I 8.)
-
+ Eikenella corrodens**
Bacteroides ureolyticus
+ Cardiobacterium hominis
- Actinobacillus actinomycetemcomitans
- + Haemophilus aphrophilus
- + Capnocytophaga canimorsus
Capnocytophaga ochracea
+ - Kingella kingae
*OX=Oxidas, KAT=Katalas, NIT=Nitratreduktion, IND=Indoltest, URE=Ureastest,
LD=Lysindekarboxylas, OD=Ornitindekarboxylas, AN=Anaerob växt, AG=Agargrävare,
beta-hem=betahemolys, GFER=Glukosfermentation
+=Positiv reaktion/egenskap (95 %),- =Negativ reaktion/egenskap (95 %), (+) varierande
reaktion/egenskap.
** 6 % av Eikenella är katalaspositiva.
154
Gruppbestämning
Långsamväxande gramnegativ stav
Innefattar bl.a. Brucella species, Francisella species.
Övriga gramnegativa stavar
Speciesbestämning, minimikriterier
Pasteurella multocida
Växer i aerob och anaerob miljö. Växer ej på MacConkeyagar. Oxidas- och
katalaspositiv. Indolpositiv. Typisk lukt på blodagar.
Anm. API är av värde.
Referensmetodik I 1
Aeromonas species, Vibrio species, Plesiomonas species, Campylobacter,
Salmonella, Shigella, Yersinia.
Agens associerade med speciella sjukdomstillstånd eller
Klass 3 organismer
Bartonella, Brucella, Streptobacillus moniliformis, Burkholderia,
Francisella, Rickettsia species.
Anaeroba bakterier
Definition se under identifieringsbegrepp, växtsätt.
Identifiering, referensmetod
Identifiering av anaeroba bakterier omfattar kolonimorfologi (storlek, pigmentering,
svärmning, hemolys) gramfärgning, resistensbestämning för kliniken inkluderande
kanamycin-vankomycin i diagnostiskt syfte. Analys av fettsyror med
gaskromatografi (enligt, Jousimies Somer et al Wadsworth anaerobic Bact Manual;
2002 6th ed. Star Publishing Company. Belmont. Calif.,) är referensnivå för definitiv
artdiagnostik. Biokemiska tester och kommersiella kit kan vara av värde.
Avvikelse från referensmetodik
I rutindiagnostiken är det som regel tillräckligt att identifiera B. fragilis och
Clostridium perfingens till speciesnivå. Övriga anaerober kan identifieras till
presumtiv speciesnivå, t.ex. Bacteroides species, Prevotella species etc. Nedan
beskrivs minimikriterier för denna rutindiagnostiska nivå.
155
Anaeroba grampositiva kocker
Speciesbestämning, minimikriterier
Peptococcus niger
Ovanlig i kliniskt material. Skiljer sig från peptostreptokocker genom svag
katalaspositivitet och pigmentering synlig i plattmikroskop.
Gruppbestämning
Peptostreptokocker
Grampositiva kocker. Kanamycin och vankomycinkänsliga. Katalas- och
indolnegativa.
Anaeroba grampositiva stavar
Speciesbestämning, minimikriterier
Clostridium perfringens
Stora, lådformade grampositiva stavar. Betahemolyserande med dubbelzon.
Omvänt CAMP- positiv. Kanamycin och vankomycinkänslig.
Propionibacterium acnes
Typiska grampositiva stavar. Katalas- och indolpositiv.
Clostridium species
Grampositiva stavar. Kan ibland te sig gramnegativa. Kanamycin och
vankomycinkänsliga. Katalasnegativa. Sporbildare, sporerna kan dock vara
svåra att se vid gramfärgning. Innefattar bl.a. C. bifermentans, C. fallax, C.
histiolyticum, C. novyi, C. septicum.
Anaeroba gramnegativa kocker
Gruppbestämning
Gramnegativa kocker
Kanamycinkänsliga och vankomycinresistenta.
Anaeroba gramnegativa stavar
Gruppbestämning
Bacteroides fragilis-gruppen:
Kanamycin och vankomycinresistenta. Katalaspositiv. Indolnegativ. Eventuellt
kan colistin och oxgalla komplettera diagnostiken.
Övriga gramnegativa stavar framgår av tabell 12.
156
Övrigt
Lactobacillus species Se referensmetodik I 5.
Actinomyces species Se agens associerade med specifika sjukdomstillstånd.
Bilophila
R
-
R
S
S
-
+
R
R R/S S
-
-/+
R
S
-
+/-
R
S
S
Indol
R
Katalas
S
Oxgalla
Colistin
Bacteroides species
Kanamycin
Porphyromonas
species
Fusobacterium
species
Prevotella species
Vankomycin
Tabell 12. Anaeroba gramnegativa stavar, minimikriterier
Övrigt
Svartpigmenterade kolonier.
+
Indolpositiv.
+++ -
157
Prevotella spp är indolnegativa,
dock är P. intermedia indolpos.
Bedömning av prov
Bedömning av den mikrobiologiska undersökningen avseende misstänkt infekterade sår tillhör de mest avancerade utmaningarna för den kliniske mikrobiologen.
Förutom mikrobiologisk kompetens och kunskap omfattande merparten av de
medicinska disciplinerna krävs djupkunskap i infektionssjukdomarnas patologi. Det
krävs också ett nära samarbete med inremitterande läkare via remiss och ibland
muntlig kommunikation. IT-baserad sökmöjlighet för att snabbt orientera sig om
tidigare prover och remissfrågeställningar kan vara av avgörande informationsvärde
för bedömningen i ett enskilt fall.
Vid fynd av bakterier i öppna sår sker en bedömning av ett stort antal faktorer, bl.a.
den aktuella mikroorganismens ”rating” som primär-, sekundär- eller föga patogen
och dess prediktiva värde enligt Tabell 1 samt resultat av resistensbestämning.
Härtill görs en sammanvägning av patientfaktorer såsom historik, underliggande
sjukdom, immunstatus, lokala vävnadsfaktorer, vårdhygieniska insatser och smittskyddsaspekter. En detaljerad handlingsplan för totalbedömning av alla dessa
variabler skulle innefatta en så extensiv beskrivning att det praktiskt inte låter sig
göras.
De agens som i tabellen betraktas som primärpatogener resp. anges ha högt prediktivt värde rapporteras dock praktiskt taget alltid med artidentifiering och resistensbestämning (med undantag för förekomst i öppna ytliga sår). Samma förhållande gäller för samtliga agens isolerade från slutna infektioner (i regel abscesser)
och normalt sterila loci. Ett svar bör innehålla en beskrivning av de fynd som gjorts
samt efter individuell bedömning en kommentar av fyndets prediktiva värde baserat
på klinisk information. Det är angeläget att vårda den diagnostiska specificiteten.
Att art- och resistensbestämma samtliga fynd och överlåta åt inremitterande läkare
att bedöma fyndet är ej tillrådligt.
Indikationer för kvantitering, art- resp. resistensbestämning
För att minska överdiagnostik anser arbetsgruppen att rapporten bör begränsas till
det som är kliniskt motiverat. Ta hänsyn till skadepanoramat, patientens immunstatus samt den/de isolerade mikroorganismernas virulens och prediktivitetsvärden
(se allmän del Tabell 1). Typ av provtagning samt transport påverkar tolkningen av
resultatet. Prov på pinne från ytliga, öppna provlokaler innehåller sannolikt mer
kontaminerande bakterier och bakterier från provlokalens normalflora än
vävnadsprov eller aspirerat prov. Svaret bör alltid innehålla en beskrivning av
gjorda fynd samt efter individuell bedömning, en kommentar.
158
1.
Bedöm medierna med avseende på kvalitativ växt. Kvantitering av pinnprov är
ej reproducerbar men kan användas i särskilda fall för att markera fåtal eller
dominans. Använd gärna plattmikroskop.
2.
Verifiera och resistensbestäm (ev.) följande isolat:
•
•
•
•
•
•
•
3.
Primärpatogena bakterier enligt klinisk del.
Bakteriearter med hög prediktivitet med undantag för vissa isolat från
öppna sår enligt Tabell 1 och 4.
Samtliga isolat associerade med främmande kroppar, implantat, katetrar
etc. och från normalt sterila lokaler.
Samtliga isolat som omfattas av smittskyddslagen.
Upprepade fynd av sekundärpatogena eller föga patogena arter.
Fynd av sekundärpatogena eller föga patogena arter som på kliniska
grunder bedöms ha betydelse för sjukdomsförloppet.
Specifik frågeställning från den kliniskt ansvarige läkaren.
Karakterisera till gruppbeteckningsnivå eller beskriv makroskopiskt, resistensbestäm inte:
•
•
•
•
Isolat vilka sannolikt tillhör den ordinära floran. Besvara som vanligen
förekommande flora för provlokalen.
Mer än tre isolat från den intestinala floran i prov från ytliga sår och
genitalt. Besvara som blandflora.
Andra fynd än primärpatogener från venösa bensår.
Exempel på beskrivning av ej vidare karakteriserade fynd; anaeroba
bakterier, anaeroba bakterier från munhålan, anaerober från vaginal och
fecesflora, blandflora, blandflora av aeroba och anaeroba bakterier,
blandflora med Enterobacteriacae och nonfermentativa gramnegativa
stavbakterier, gramnegativa stavar inklusive Pseudomonas species,
blandflora av endogent ursprung. Om remissuppgifter saknas föreslås en
kommentar och åtgärder enligt I 5, urinvägsinfektioner: ”Beslut om artoch resistensbestämning baseras på typ av prov och symtomatologi.
Eftersom sådana uppgifter saknas har diagnostiken begränsats”.
159
Resistensbestämning
Beträffande val av antibiotika för resistensbestämning hänvisas till RAF:s
hemsida www.srga.org
160
Svarsrutiner
Slutsvar
Laboratoriet ska lämna svar på undersökningen skriftligt/elektroniskt.
Svarsrapporten ska innehålla:
•
•
•
•
•
•
•
•
Vilket laboratorium som utfört analysen.
Spårbara patientdata.
Remitterande klinik/läkare.
Provlokal.
Provspecifikation (t.ex. sår, pus).
Utförd analys, inkluderande metod (t.ex. odling, mikroskopi efter
gramfärgning).
Resultat av undersökningen.
Ev. tolkningskommentar rörande fyndets relevans eller förbehåll relaterade till
lång transporttid etc.
Preliminärsvar
Telefonsvar bör lämnas vid verifierat eller stark misstänkt fynd av:
•
Primärpatogener med hög prediktivitet.
•
Vid relevanta fynd från normalt sterila kroppsvätskor eller
•
I övrigt efter medicinskt ansvarigs omdöme.
Preliminärsvar av annan typ är också ofta av stort värde för behandlande läkare.
Rutiner för hantering av sådana preliminärsvar bör utarbetas vid laboratoriet. Som
exempel kan anges:
•
Delsvar avseende organismer som bedömts relevanta och som uppfyller
specificerade minimikriterier, t.ex. fynd av S. aureus och där endast
resistensbestämning återstår.
•
Negativ odling efter 1 eller flera dygn och där odlingen fortsätter.
•
I övrigt efter medicinskt ansvarigs omdöme.
I de fall givna minimikriterier ej är uppfyllda bör återhållsamhet iakttas och
slutligt ställningstagande alltid göras av medicinskt ansvarig. Svar som senare
måste återkallas stärker i längden inte förtroendet för laboratoriet.
161
REFERENSER:
A guide to Specimen management in clinical microbiology. Second edition. J. Michael
Miller. 1999. American Society for Microbiology. ISBN 1-55581-138-8.
Clinical Microbiological Procedures Handbook, Ed. Isenberg, ASM-Press 1992.
Cowan and Steel's Manual for the identification of medical bacteria, 3rd ed. Ed. Barrow,
Feltham. Cambridge University Press. 1993.
Enterobacteriacae. Remisshandling Björn Osterman 1991.
Ickejäsande Gramnegativa stavar. Remisshandling Falsen E, Ursing J, Wretlind B. 1991.
Manual of clinical microbiology, 7th ed. Ed. Murray. ASM press 1999.
MMWR Recommendations & Reports, May 31, 1996; 45: 1-24.
Multiresistenta bakterier i svensk hälso- & sjukvård - en nationell handlingsplan.
www.srga.org/MRB/index.html
Referensmetodik för laboratoriediagnostik vid kliniskt bakteriologiska laboratorier,
Infektionsdiagnostik, I 6 Sexuellt överförbara infektioner (STD) SMI-tryck nr 101-1994.
SOSFS 1989:1 Åtgärder för att förhindra förväxlingar inom hälso- och sjukvården.
SOSFS 1989:38 Blodgivning, blodtransfusion (ersätter 1984:27).
162
Övervakningsodlingar
Infektionskänsliga patienter: Många patienter har nedsatt infektionsförsvar på
grund av sjukdom eller behandling. Detta gäller t.ex. vid intensivvård, vård av
brännskadade och cancervård. Det var tidigare vanligt att regelbundet, ofta flera
gånger per vecka utföra så kallade övervakningsodlingar enligt särskilda scheman.
Numera görs detta i allt mindre omfattning eftersom vetenskapliga bevis oftast
saknas för korrelation mellan fynd vid preinfektiös övervakningsodling och etiologi
till senare uppkommen sepsis. Studier har visat att generella övervakningsodlingar
är kopplade till hög antibiotikaförbrukning. Risker har också påtalats att återkommande perifera odlingsfynd i stället för att förutsäga etiologi till senare febril infektion snarare kan missleda behandlande läkare till ett felaktigt initialt antibiotikaval.
Det är därför vanskligt att ange riktlinjer för hur svarsrutiner vid eventuella övervakningsodlingar rörande den enskilda infektionskänsliga patienten bör utformas
och tolkas. En nyare studie har visserligen visat korrelation mellan perifera screeningsfynd av jästsvamp och risk för senare utveckling av svampsepsis. Det har
dock ej bedömts kostnadseffektivt att rekommendera generella övervakningsodlingar ens på sådana patienter som befinner sig i riskzonen för utvecklandet av
djupa svampinfektioner. I stället rekommenderas idag för denna patientgrupp och
övriga patienter med nedsatt infektionsförsvar utförlig genomodling enligt fastställt
program vid uppkommen infektion eller misstanke om sådan i omedelbar
anslutning till initiering av empirisk antibiotikaterapi. Härvid ökar möjligheten att
erhålla ett stabilt beslutsunderlag till att styra behandlingen under den febrila perioden. Andra fall där genomodlingar kan vara motiverade är hos svårt sjuka patienter med flertal drän, särskilt CVK, sår etc., där lokala infektionstecken, om än ringa
föreligger.
Klinisk misstanke på infektion: Provtagning vid misstanke på infektion bör ske
enligt i förväg fastställt program, vari ingår blododling, urinodling, ev. odling från
sår, infarter och vid misstanke på pneumoni odling från bronksekret med bronkiallavage eller skyddad borste.
Odling från svalg med frågeställning betastreptokocker och från nasofarynx med
frågeställning sedvanliga luftvägspatogener görs vid symtom på övre luftvägsinfektion och vid oklar feber.
Odling från lokaler med riklig förekomst av normalflora såsom sputum, trakealsekret, hud eller feces ger ingen vägledning för behandlingsval.
Neonatalvård: Vid prematur vattenavgång före vecka 37 föreligger ökad risk för
intrauterin kolonisering av fostret eller infektion vilken kan leda till fosterdöd.
163
Odling från introitus vaginae (ibland kompletterad med urin/fecesprov) på blivande
mödrar görs därför på flera håll rutinmässigt i sådana fall. Varje avvikelse från
normalfloran bör rapporteras. Övervakningsodlingar är också aktuella vid ny
graviditet hos mödrar till barn som drabbats av neonatal sepsis. Det råder ingen
fullständig konsensus avseende behandling av koloniserade mödrar, men
antibiotikaparaply med bensyl-pc eller makrolid vid förlossningen är vanligt.
Övervakningsodlingar tas också från prematurer, andra nyfödda med riskfaktorer
för infektion eller i de fall där infektionsscreening ingivit misstanke om infektion.
Inför empirisk antibiotikaterapi tas därvid odlingsprov från nasofarynx, öra, navel
och blod.
Epidemiologisk övervakning: Riktade övervakningsodlingar utan konstaterad
infektion kan ordineras av epidemiologiska skäl. Exempel på detta är misstanke om
eller konstaterad smittspridning med MRSA, VRE eller multiresistenta
gramnegativa stavar. Provtagningsanvisningar finns tillgängliga på
www.srga.org/MRB. Inom IVA-STRAMA har man identifierat fyra resistensproblem som också utgör skäl för epidemiologisk provtagning: E. cloacae
resistenta mot tredje generationens cefalosporiner, ökad förekomst av E. faecium,
multiresistenta isolat av P. aeruginosa och meticillinresistenta KNS.
Resistensbestämning av isolat från lokaler med riklig förekomst av normalflora kan
ha epidemiologiskt värde om den görs enligt i förväg fastställda kriterier. Resistenta
isolat bör då också frysas för senare epidemiologisk typning i syfte att utreda
smittvägar. Följande bakterier resistensbestäms alltid: betastreptokocker, pneumokocker, enterokocker och S. aureus. Vid förekomst av vankomycinresistenta enterokocker kan kartläggning av förekomst från feces vara av värde.
Enterobacteriacae och övriga gramnegativer resistensbestäms som vid sedvanlig
odling från sluten vård. I feces kartläggs inte förekomst av gramnegativer eller
anaerober annat än vid riktad studie, exempelvis i samband med utbrott. Svamp
typas och resistensbestäms på begäran.
REFERENSER:
Guidelines from CDC: Prevention of perinatal group B streptococcal disease. MMWR
Recommendations and Reports. 2002; 51:1-22.
164
Agens associerade med specifika
sjukdomstillstånd
165
166
Actinomyces
Smittämnet
Genus Actinomyces tillhör gruppen anaeroba icke sporbildande grampositiva stavar
och omfattar 18 species enligt uppgifter från 1998. Flera av dessa har inte isolerats
från människa. De är icke syrafasta och bildar ej endosporer eller konidier (Actinomyces betyder strålsvamp p.g.a. likheten med svampinfektioner). Majoriteten är
fakultativt anaeroba, några anaeroba, t.ex. A. israelii. Till samma grupp av anaeroba
grampositiva stavar hör följande genera: Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus och Mobiluncus.
Actinomyces spp är allmänt förekommande i munhåla hos människor och djur och
utgör en signifikant komponent i dentala plaque. Möjligen tillhör de också den
normala genitala bakteriefloran. De anses spela en viss roll i normalflorans skydd
mot kolonisering med externa patogener.
Vissa species oftast i blandkultur har speciellt associerats med infektioner hos
människa nämligen aktinomykos (A. israelii, A. gerencseriae och i mindre utsträckning A. naeslundi, A. viscosus, A. odontolyticus) och periodontit (A. viscosus och
A. naeslundi). Nyligen beskrivna arter har isolerats från blod och vid UVI.
Patogenes och patofysiologi
Infektion med aktinomyceter betraktas som klassiskt endogen med spridning från
munhålan till andra ställen i kroppen. De kan dock ej penetrera frisk slemhinna,
varför mukosaskada är en förutsättning för infektion i underliggande vävnad och
vidare spridning.
A. israelii är vanligaste orsaken till aktinomykos men infektionen är oftast polymikrobiell, vilket säkert bidrar till patogenesen.
Symtom och klinisk bild
Aktinomykos karakteriseras av kroniska granulomatösa förändringar som blir
suppurerande och bildar abscesser och djupa, fistulerande sår. De uppträder vanligen i anslutning till trauma. Pus innehåller ofta makroskopiska ”sulfurgranulae”
som kan vara vita, gula eller bruna.
Den vanligaste lokalisationen är till ansikte och hals (60 %), därefter thorax och
buk. Aktinomykos i bäckenet förekommer hos kvinnor med IUD (intrauterin
kontraceptiv spiral).
Symtom och klinisk bild kan likna andra kroniska infektioner eller tumörer.
Epidemiologi
Aktinomykos förekommer över hela världen men den verkliga incidensen är svår
att uppskatta.
167
Provtagning och transport
Misstanke om aktinomykos måste anges på remissen.
Konfirmering av diagnosen invasiv aktinomykos sker bäst genom undersökning av
vävnadsbiopsi, aspirerat pus eller purulenta exsudat och kroppsvätskor. Pus på
pinne kan också användas för odling.
Provtagning och transport bör ske efter anaeroba principer.
Laboratoriediagnostik
Allmänt Identifiering genom odling är referensmetod. Titta efter sulfurgranulaehårda, gulaktiga 0,1 till 5 mm stora oregelbundna partiklar i pus!
Referensmetodik
Mikroskopi
Gramfärgning av sulfurgranulae ger god vägledning för närvaro av aktinomyceter.
Vid förekomst av misstänkta granulae i pus pressas sådana mellan två objektglas
för optimal visualisering. Aktinomycetes är grampositiva stavar i regel tunna och
mycket långa med pleomorft utseende. Ett antal species har sanna förgreningar.
Referenssubstrat
Anaerob blodagar.
Isolering
Anaerob odling i 10 dagar. De flesta aktinomyceter är fakultativt anaeroba och
växer bäst vid 35-37 °C i närvaro av 5-10 % CO2. Många species som A. israelii
växer dock företrädesvis under anaeroba förhållanden och A. bovis och A. meyeri är
strikt anaeroba.
Flera arter är långsamväxande. A. israeli, A. bovis och A. gerencseriae kan behöva
7-14 dagar att växa ut vid primärodling. Vid subkultur växer de dock fram redan
efter inkubering i 3-4 dagar.
Identifiering och minimikriterier
Aktinomycterna växer med varierande koloniutseende. A. israelii bildar typiskt råa,
blomkålsliknade kolonier. I buljong bildas små klumpar som också ses i pus s.k.
sulfurgranulae.
I gramfärgning från blodagar bildar aktinomyceter liksom coryneforma bakterier Voch Y-formationer. Några species som A. israelii, A. bovis, A. viscosus,
A. naeslundi och A. odontolyticus visar filament med sanna förgreningar.
Identifiering till genusnivå kan ske med hjälp av gaskromatografi på slutprodukterna efter glukosfermentation. Actinomyces spp bildar signifikanta mängder succininsyra.
Bakterierna fermenterar många olika kolhydrater men bryter inte ner protein.
168
Identifiering till speciesnivå bygger på biokemiska test sådana som nitratreduktion
och hydrolys av eskulin och urea. Många standardiserade kommersiella kit är av
värde. Fenotypisk identifiering kan dock vara svår eftersom många reaktioner är
variabla.
Alternativ diagnostik
Direkt påvisande av aktinomyceter med FA i kliniskt material är av värde speciellt
vid misstänkt IUD-infektion. Det kräver dock tillgång till specifika reagens.
Bakterierna kan också påvisas i cytologpreparat med Papanicolaou färgning.
Resistensbestämning och resistensutveckling
Actinomyces spp anses generellt känsliga mot betalaktam-antibiotika, tetracykliner, makrolider och fusidinsyra men resistenta mot aminoglykosider och
metronidazol.
Epidemiologisk typning
Vid subtypning av aktinomyceter har serologi varit den klassiska metoden. Den
håller dock på att ersättas med DNA-baserad teknologi.
Kvalitetskontroll
Referensstam: Actinomyces israelii, CCUG 18307.
Svarsrutiner
Växt av/Ingen växt av Actinomyces med angivande av species vid signifikanta
sjukdomstillstånd.
Laboratorierapportering
Aktinomykos är ej anmälningspliktig.
REFERENSER:
Bowden, G.H.W. Actinomyces. Topley Wilson 1998;9(2):445-462.
Janda, W.M. Corynebacterium species and the coryneform bacteria. Part II: Current status
of the CDC coryneform groups. Clin Microbiol Newslett.1998;20:53-66.
169
Bartonella
Smittämnet
Bartonella species (tidigare Rochalimaea) är korta, pleomorfa, aeroba och långsamväxande gramnegativa stavar.
Genus Bartonella inkluderar 16 species, av vilka åtminstone fyra visats vara patogena för människa: B. henselae (cat scratch disease, bacillär angiomatos, peliosis
hepatis och endokardit), B. bacilliformis (Oroya fever), B. quintana (trench fever,
kronisk lymfadenopati, bacillary angiomatosis, endokardit och bakteriemi ) samt B.
elizabethae (endokardit). Bartonella beskrevs till en början som rickettsialiknande.
Senare har genus Bartonella förts bort från familjen Rickettsiales för att bilda en
egen familj, Bartonellacae, eftersom de inte innehåller obligat intracellulära
patogener. Taxonomiska studier har visat att Brucella torde vara närmaste
humanpatogena släkting.
Patogenes och patofysiologi
Intracellulär växt av B. bacilliformis i erytrocyter med hemolys som följd är väl
dokumenterad. Detta species har också visats adherera till och invadera humana
endotelceller. Både B. henselae och B. quintana har pili som troligen fungerar som
virulensfaktorer och möjliggör intracellulär växt i epitelceller.
Kanske den mest intressanta observationen i interaktionen mellan bakterie och värd
är proliferationen av vaskulära endotelceller. Denna nybildning av små kärl
resulterar i de lesioner som observeras hos patienter med bacillär angiomatos och
verruga peruana. Egenskapen delas av B. henselae, B. bacilliformis och B. quintana.
Symtom och klinisk bild
Sjukdomsbilden är relaterad till immunologiskt status och kan variera från mild
lymfadenopati hos immunkompetenta till septisk bild hos immundefekta.
Oroya fever och Verruga peruana: Sjukdomen som orsakas av B. bacilliformis är
bifasisk och känd sedan Columbus dagar. I det akuta febrila stadiet är den progressiv och ger allvarlig hemolytisk anemi (Oroya fever) med hög dödlighet.
Smittämnet är i detta skede påvisbart i de röda blodkropparna. I ett andra kroniskt
stadium, som utvecklas veckor eller månader senare, ses vaskulära proliferativa
hudförändringar (verruga peruana).
Cat scratch disease, CSD, eller kattklössjukan: Sjukdomen beskrevs 1950 och B.
henselae visades vara etiologiskt agens 1988. De flesta patienter är barn och
ungdom med milda allmänsymtom och lokal lymfkörtelsvullnad, som debuterar
några veckor efter det att patienten blivit riven eller biten av en katt. Association
170
med hundbett finns också. Hos ca 30 % är infektionen förenad med allmän
sjukdomskänsla och hög feber. En eller flera rödaktiga och ömma vaskulära papler
observeras ofta vid platsen för rivmärket eller bettet. Sjukdomen är självläkande på
två till fyra månader. Tömning av abscesser är ibland nödvändig. Hos AIDSpatienter förekommer septisk bild och encefalopati.
Trench fever eller skyttegravsfeber beskrevs under första världskriget som en
recidiverande feber hos tyska och allierade soldater och den orsakande organismen
B. quintana beskrevs 1961. Inkubationstiden är 15 till 25 dagar. Patienterna
insjuknar med allmänna infektionstecken och feberattacker med ca 5 dagars mellanrum (”quintane” fever). Smärtor särskilt över smalbenen har beskrivits som
typiska. Prognosen är god.
Bacillär angiomatos, BA: Sjukdomen som kan orsakas av såväl B. henselae som
B. quintana beskrevs först hos en AIDS-patient 1983. Den förekommer framför allt
hos HIV-patienter och andra immundefekta och karakteriseras av multipla
hudlesioner som kan vara omöjliga att skilja från Kaposi´s sarkom. Peliosis hepatis
betraktas som en visceral form av BA. Förekomst av lymfkörtelförstoringar är
vanligare vid infektion med B. henselae medan neurologiska symtom mer associeras till B. quintana.
Persisterande bakteriemi och endokardit
orsakade av olika Bartonella spp är relativt vanligt förekommande hos hemlösa,
alkoholister och andra grupper utsatta för ohyra.
Epidemiologi
Bartonella spp angriper olika däggdjur med stor specificitet till art och kan orsaka
kronisk bakteriemi utan symtom hos katter, hundar, gnagare, hjortar m.fl. Även hos
människa förekommer persisterande bakteriemi.
B. bacilliformis har överförts genom blodtransfusion.
Infektionen överförs till människa vanligen från infekterade insektsfekalier till
småsår.
För B. bacilliformis är människa enda reservoaren och smittan överförs med sandflugor av samma typ som sprider leishmania (Lutzomyias sp.). Sjukdomen förekommer huvudsakligen i Perus, Ecuadors och Colombias bergsområden.
B. henselae är vanligt förekommande hos katt och spridningen mellan katter upprätthålls av kattloppan (Ctenocephalides felis). Där denna är endemisk är den
potentiella risken för smitta till människa mycket stor. Bakteriemi kan påvisas hos
ca 50 % av katterna och är särskilt vanlig hos kattungar. Det har uppskattats att
24000 fall av CSD inträffar i USA varje år, av vilka ca 2000 tas in för vård på
171
sjukhus.
B. quintana sprids med klädlöss (Pediculus humanis corporis). I t.ex. Burundi har
smitta påvisats hos ca 10 % av lössen.
Seroprevalensen hos friska blodgivare har varierat mellan 2 % och 6 % i USA
medan motsvarande siffra i Sverige var 4 %.
Prevention
En aktiv bekämpning av loppor hos hund och katt torde vara den effektivaste preventiva åtgärden mot spridning.
Provtagning och transport
Önskemål om bartonelladiagnostik måste alltid anges på remissen.
Förlängd blododling är användbar för diagnostik vid misstanke på skyttegravsfeber,
Oroya fever samt vid persisterande bakteriemi och endokardit. Blod i EDTA-rör är
ett användbart alternativ till blododlingsflaskor vid systemsjukdom.
Biopsi från vävnad rekommenderas för odling och PCR-diagnostik vid verruga
peruana och bacillär angiomatos. Vid misstänkt CSD används på motsvarande sätt
material från lymfkörtlar. Vid endokardit kan bakterierna påvisas i material från
hjärtklaffar.
Parade sera för serologi kan användas vid skyttegravsfeber, kattklössjukan och
endokardit.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Bartonella växer alltför långsamt och genererar för lite CO2 för att upptäckas i
vanliga automatiserade blododlingssystem. Bra alternativ är såväl undersökning av
blod uppsamlat i EDTA-rör som lys-centrifugeringsmetodik.
Material från vävnad kan odlas och ev. bakterier identifieras med PCR. Bakterier
kan också påvisas direkt med PCR i vävnad.
Indirekt FA rekommenderas för serologisk undersökning. I praktiken har serologi
blivit huvudmetod eftersom den är väl så snabb som övriga alternativ.
Referensmetodik
Blododling
Vid förlängd odling kan bakterier påvisas med akridinfärgning efter 8 dygn. Odlingen bör fortgå upp till 4-6 veckor. Misstänkta bakterier måste subkultiveras för
identifiering.
Ett bra alternativ är direkt inokulering på fast substrat av blod tappat i EDTA-rör.
Referenssubstrat
172
Columbia blod agar med 5 % -10 % blod från häst, får eller kanin. Bakterierna kan
ej tillgodogöra sig kolhydrater.
Isolering
Materialet inkuberas i 5 % CO2 vid 37 °C. Kolonier kan ses efter 12 till 14 dagar
men plattorna bör granskas veckovis i upp till två månader. B. bacilliformis är ett
undantag och växer bäst vid 25 till 28 °C i luft.
Anrikning ger ökad känslighet. Odling i flytande medier baserade på RPMI 1640
supplementerade med pyruvat, hemin och aminosyror har använts framgångsrikt för
isolering av B. henselae.
Identifiering och minimikriterier
Vid primärisolering ses typiska små, vita kolonier nergrävda i agarn. Gramfärgning
visar också en typisk bild med bakterier som klumpar ihop sig (autoagglutination).
Som genus är Bartonellae negativa för katalas, oxidas, ureas och nitratreduktas. De
är generellt biokemiskt inerta. B. bacilliformis är rörlig med en polär flagell, övriga
orörliga.
Identifiering sker bäst med bredspektrum PCR. I ett första steg identifieras bakterier
med primers riktade mot höggradigt konserverade regioner på 16S-rRNA. I ett
andra steg sekvenseras amplifierat material. Eftersom många andra bakterier också
påvisas är tekniken känslig för kontaminering.
I allmänhet är typning till genusnivå tillräcklig. Citratsyntasgenen (gltA) har använts som målstruktur för identifiering även på speciesnivå.
Alternativ diagnostik
Serologi: Det finns möjlighet att diagnostisera bartonellainfektioner serologiskt.
Mest använd är IFA (indirekt immunfluorescensteknik). Eftersom bakterien
autoagglutinerar är det svårt att preparera glas med åtskilda bakterier, vilket lösts
genom att bakterierna odlas tillsammans med en cellinje. De adhererar till cellytan och resultatet blir lättare att avläsa.
Korsreaktioner förekommer med Chlamydia spp och Coxiella burnetii.
Histopatologisk undersökning av hudbiopsier kan användas för konfirmering av
BA och lymfkörtelbiopsi på motsvarande sätt vid CSD.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Hittillsvarande studier pekar mot att alla isolat är höggradigt känsliga för de flesta
betalaktamer, aminoglykosider, makrolider, tetracykliner och rifampicin. I kliniska
studier har förlängd behandling med aminoglykosider och erytromycin haft god
effekt.
173
Epidemiologisk typning
Typning till speciesnivå utgör idag ambitionsnivån för epidemiologisk typning.
Studier med PFGE har dock visat på stamvariationer inom species.
Epidemiologisk serologi försvåras av bristen på kalibrerande referenssera.
Kvalitetskontroll
Referensstammar: Bartonella quintana, CCUG 45777.
Svarsrutiner
Växt av/Ingen växt av Bartonella sp.
Laboratorierapportering
Infektioner med Bartonella är ej anmälningspliktiga.
REFERENSER:
Anderson, B.E., Neuman, M.A. Bartonella spp. as emerging human pathogens. Clin Microbiol Rev. 1997;10:203-219.
Breitschwerdt, E.B., Kordick, D.L. Bartonella infection in animals: carriership, reservoir,
potential, pathogenicity, and zoonotic potential for human infection. Clin Microbiol Rev.
2000;13:428-438.
Engstrand L. Mikroorganism röjer kattklössjukan. Läkartidningen. 1994;91:28-29.
Holmberg, M., et al. Evaluation of human seroreactivity to Bartonella species in Sweden. J
Clin Microbiol. 1999;37:1381-1384.
Jacomo V. Human infections caused by Bartonella spp. Clin Microbiol Newslett.
2000;22:1-13 (two parts).
174
Borrelia – återfallsfeber
Smittämnet
Bakterier tillhörande genus Borrelia är ett artrikt spiroketsläkte där flertalet arter
finns representerade som normalflora i exempelvis munhålan och tarmkanalen hos
människa men även som parasiter hos olika djurarter och artropoder, såsom fästingar och löss. Bakterien är mellan 5 – 30 µm lång och är ca 0,2 - 0,5 µm tjock.
Två grupper av Borrelia-arter är av stor humanmedicinsk betydelse: Borreliaspiroketer som orsakar återfallsfeber och Borrelia burgdorferi sensu lato gruppen
som orsakar Lymes borrelios. Den klassiska återfallsfebern orsakas antingen av
lusburna B. recurrentis-spiroketer eller olika fästingburna arter. Den senare
gruppen brukar särskiljas i den nya världens och den gamla världens återfallsfeber.
En sammanställning av de ingående arterna och vektorerna ges nedan i Tabell 13.
Patogenes och patofysiologi
Den mest kända virulensmekanismen hos Borrelia-arter som ger återfallsfeger är
förmåga till antigenvariation av ytlokaliserade variabla membranproteiner (Vmps).
En Borrelia-cell kan uttrycka en av ett flertal olika immunogena ytantigen och
genom att periodiskt uttrycka nya ytantigen kan en Borrelia-population undkomma
värdens försvar under lång tid. De serotypspecifika vmp-generna är belägna på en
unik typ av extrakromosomala element, linjära plasmider, eller minikromosomer.
Vid varje återfall av feber har bakterien förändrat sig så att den uttrycker ett nytt
Vmp-protein. Denna antigena variation gör det möjligt för bakterien att överleva
kroppens immunförsvar vilket sker med en frekvens som är tusenfalt högre (10-4
per generation) än vanliga punktmutationer. Den variationsmekanism som dessa
Borrelia kan genomgå sker genom en genetisk omlagring där en vmp-genkopia från
ett icke uttryckt locus förflyttas till ett uttryckt vmp-locus via homolog
rekombinering. Under denna process byts den gamla vmp-genen ut mot den nya
inkommande vmp-genen. Den gamla vmp-genen försvinner och finns endast kvar i
en kopia i ett tyst locus. Därmed uttrycks ett helt nytt Vmp-protein och en helt ny
Borrelia serotyp uppkommer. Förutom denna egenskap att genomgå
antigenvariation kan vissa av de Borrelia-arter som återfinns i den gamla världen
(Afrika och Sydeuropa), nämligen B. duttonii, B. crocidurae och B. hispanica
uppvisa ytterligare en viktig patogenesegenskap. Dessa arter kan binda till och
aggregera röda blodkroppar vilket i djurmodellsystem visat sig kunna påverka
blodflödet i olika organ. Dessa arter har också visat sig ha stor förmåga att invadera
olika immunologiskt inaktiva vävnader såsom hjärna och testiklar.
175
Tabell 13. Humanpatogena Borrelia-arter som ger återfallsfeber, deras vektorer
och geografiska spridningsområden
Borrelia art
Atropod /vektor
Geografisk utbredning
B. recurrentis
Pediculus humanus
Hela världen
B. hispanica
Ornithodoros erraticus
Spanien, Portugal, Grekland, Cypern, Norra
Afrika
B. crocidurae
O. sonrai
Från Västafrika till Nordöstra Afrika, Mellanöstern till Iran
B. persica
O. tholozani
Mellanöstern
B. duttonii
O. moubata
Östra och Centrala Afrika
B. hermsii
O. hermsii
Västra USA, British Columbia
B. turicatae
O. turicata
Mexiko, Kansas, Texas
B. parkeri
O. parkeri
Västra USA
O. papillipes
Tadjikistan, Uzbekistan
B. venezuelensis
O. rudis
Centralamerika och Norra Sydamerika
B. anserina
Argas persicus
Hela Världen
B. coriaceae
O. coriaceus
USA
B. lonestari1
Amblyomma
Södra USA
B. uzbekistani
a
americanum
B. miyamotoi1)
Ixodes persulcatus
Japan
Spanskt isolat2)
Okänd
Spanien
1)
Ej så välkarakteriserade och med okänd patogenicitet.
2) Okänd
patogenicitet
176
Symtom och klinisk bild
Efter en inkubationstid om 2 till 15 dagar tillstöter vid infektion en snabbt insättande feber. Febern håller i sig i 3 till 7 dagar. Därefter följer en afebril period som
kan vara mellan 2 dagar och upp till flera veckor. Obehandlad infektion kan därefter enligt litteraturen följas av upp till 13 återfall av akut febril sjukdom. Under den
febrila fasen är infektionen septisk och spiroketer finns i riklig mängd i blod. Febern åtföljs ofta av frossbrytningar, huvudvärk, muskel- och ledvärk samt illamående och kräkningar. Sjukdomsförloppet vid återfallsfeber orsakad av andra Borrelia-arter än Borrelia recurrentis är mindre studerat men de arter som kan aggregera röda blodkroppar uppvisar ibland symtom som kan kopplas till detta fenomen.
Detta ses ofta som mer eller mindre allvarliga blödningssymtom såsom hemoptys,
blodiga diarréer, hematuri, samt blödningar från hjärna och mjälte. Mer eller
mindre allvarliga neurologiska symtom har också rapporterats från fall av återfallsfeber. Dessa är lyckligtvis oftast reversibla. Vid graviditet är återfallsfeber ett
stort problem där missfall och för tidig födsel oftast uppkommer med hög mortalitet.
Epidemiologi
Av arterna som ger återfallsfeber har B. recurrentis bara människa som värd och
överförs från människa till människa via vägglöss. Enligt uppgift finns bakterien
inte i spottkörtlarna hos lusen och för att bli infekterad krävs att man klämmer
sönder lusen varefter bakterien kan ta sig in i kroppen. Fram till 50-talet var utbrott
vanliga men med bättre hygieniska förhållanden finns nu B. recurrentis bara i vissa
delar av Afrika. I Östafrika finns en annan art av Borrelia, B. duttonii, som bara
smittar människa men som överförs av fästingar. Borrelia crocidurae orsakar
återfallsfeber i Västra Afrika och enligt WHO är återfallsfeber endemisk enbart i
Västafrika. I Amerika och Asien finns arter av Borrelia som zoonoser vilka endast i
ett fåtal fall infekterar människa.
Prevention
Eliminering av vektorerna är den bästa preventiva metoden. Klädlöss bör vara
relativt lätt att eliminera i vissa delar av världen. Att eliminera Ornithodorosfästingen torde vara mycket svårt. Vanlig försiktighet och daglig inspektion av
fästing- och lusförekomst när man besöker riskområden är rekommendabelt.
Återfallsfeber är mycket känslig för tetracykliner och betalaktamantibiotika.
Provtagning och transport
Lämpligt provmaterial för direktpåvisning med mikroskopi är blod (t.ex. buffy coat
från citratblod centrifugerat i mikrohematokritrör) taget i början av en feberperiod
då koncentrationen av spiroketer är som högst.
177
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Vissa av dessa Borrelia-arter kan odlas i syntetiska substrat. Känsligheten är dock
så låg att förfarandet inte är lämpligt för diagnostik. Ingen rutinmässig serologisk
diagnostik finns ännu. Emellertid kan påvisande av glycerol-fosfodiester-fosfodiesterase (GlpQ) antigenet användas för att särskilja återfallsfeber från Lymes
borrelios.
Referensmetodik
Referensmetodik är mikroskopiskt påvisande av typiska spiroketer i blod. Med
tanke på den begränsade erfarenhet de flesta svenska bakteriologer har av detta
förfaringssätt måste för slutgiltig diagnos DNA specifikt för återfallsfeber Borrelia
påvisas med en känslig metod som t.ex. PCR. I detta sammanhang torde glpQgenen vara användbar.
Alternativ diagnostik
Serologi
Antikroppar mot konserverade antigena determinanter kan vid infektion påvisas
med t.ex. ELISA. Se ovan för GlpQ.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Resistensbestämning görs inte rutinmässigt. Någon resistensutveckling är inte
känd.
Kvalitetskontroll
Referensstammar: Borrelia burgdorferi, CCUG 44922.
Svarsrutiner
Vid påvisande i direktmikroskopi svaras:
Spiroketer påvisade vid mikroskopi. Fortsatt undersökning med avseende på
borrelia pågår.
Laboratorierapportering
Återfallsfeber är anmälningspliktigt enligt smittskyddslagen samhällsfarliga
sjukdomar 1.1.
REFERENSER:
Nordstrand A, Barbour A. G., and Bergström S. Borrelia pathogenesis research in the
post-genomic and post-vaccine era. Curr Opinion Microbiol. 2000;3: 86-92.
Porcella SF, Raffel SJ, Schrumpf ME, Schriefer ME, Dennis DT, Schwan TG.
Serodiagnosis of Louse-Borne relapsing fever with glycerophosphodiester
phosphodiesterase (GlpQ) from Borrelia recurrentis. J Clin Microbiol. 2000;10:356171.
178
Schwan TG, Schrumpf ME, Hinnebusch BJ, Anderson DE Jr, Konkel ME. GlpQ: an
antigen for serological discrimination between relapsing fever and Lyme borreliosis. J
Clin Microbiol. 1996;34:2483-92.
179
Clostridium tetani
Smittämnet
Clostridium tetani är strikt anaeroba, grampositiva, sporbildande stavar.
Stelkrampsbakterien producerar efter autolys ett neurotoxiskt protein
(tetanospasmin) som i sin struktur liknar botulinustoxinet. Det syntetiseras som en
enkelpeptid (150 000 Da). Genom proteolytisk aktivitet övergår denna i en
dubbelkedja (A+B-struktur). Endast en antigen typ är beskriven.
Patogenes och patofysiologi
Toxinets B-enhet binder till gangliosider på de motoriska nervcellernas neuron och
A-enheten transporteras via axonet till ryggmärgen. Det blockerar liksom botulinumtoxinet utsöndringen av acetylkolin men binder till synapser i CNS till skillnad
från botlinustoxinet som binder perifert. De inhibitoriska impulserna till de
motoriska neuronerna resulterar i muskelspasm som kan pågå i veckor.
Symtom och klinisk bild
Stelkramp är ofta associerad med sticksår som initialt kan te sig oskyldiga.
Sjukdomen uppträder fr.a. hos ovaccinerade. Patognomont är överkänslighet för
ljus och ljud. Den kliniska sjukdomsbilden är dramatisk med muskelspasm och
kramper till skillnad från botulism där pareserna är slappa.
Epidemiologi
Bakterien och dess sporer kan isoleras från jord och tarminnehåll hos ett stort antal
djurarter.
Under 5-årsperioden 1997 - 2001 rapporterades åtta fall till SMI enligt smittskyddslagen.
Prevention
Vaccination med tetanustoxoid ingår i det allmänna vaccinationsprogrammet.
Boosterdoser ges i samband med djupa förorenade sårskador.
Provtagning och transport
Provtagning är sällan motiverad då den kliniska bilden är typisk. Infektionsfokus
kan också vara svårt att identifiera. I övrigt gäller samma rekommendationer som
för annan anaerob odling.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Stelkramp är i huvudsak en klinisk diagnos varför frågeställningen är ovanlig på det
kliniskt mikrobiologiska laboratoriet. Odling är referensmetodik. Mikroskopi är
oftast för okänslig för att påvisa det vanligen låga antalet bakterier.
Referensmetodik:
180
Referenssubstrat:
Stelkrampsbakterierna växer på blodagar och vanliga anaerobsubstrat vilka anses
vara referenssubstrat (se bilaga 1).
Isolering
Provmaterialet, oftast från sår, inokuleras på en begränsad del av substratet. Härigenom utnyttjas den kraftiga svärmningen.
Cl. tetani odlas anaerobt i två dygn. Redan efter inkubering över natt kan Cl. tetani
renspridas från svärmningskanten.
Identifiering och minimikriterier
I direktpreparat karakteriseras Cl. tetani av terminala runda sporer (drumstick).
Slutlig verifiering kan ske med 16S-rRNA-teknik.
Toxinbildningen kan behöva verifieras. Referensmetod är musneutralisationstest.
Alternativ diagnostik
ELISA-teknik finns etablerad för påvisande av tetanusantitoxin. Denna används
företrädesvis i seroepidemiologiska studier och vid vaccinprövningar.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Resistensbestämning är sällan aktuell.
Epidemiologisk typning
Epidemiologisk typning utförs ej.
Kvalitetskontroll
Referensstammar:
Cl. tetani, toxinpositiv: ATCC 19406, NCTC 279, CCUG 4220,
Cl. tetani, toxinnegativ: NCTC 6336.
Svarsrutiner
Växt av/Ingen växt av Clostridium tetani.
Laboratorierapportering
Stelkramp är anmälningspliktig enligt smittskyddslagen Grupp A.1 Andra anmälningspliktiga sjukdomar.
181
Corynebacterium diphtheriae – huddifteri
Smittämnet
Corynebacterium diphtheriae är en grampositiv stav som orsakar difteri. I smittskyddslagens mening omfattas endast toxinbildande isolat. Toxinet bildas av
stammar infekterade med vissa fager. Den klassiska indelningen i C. diphtheriae
gravis, intermedius och mitis återspeglar inte en fallande klinisk svårighetsgrad.
Eftersom jäsningsmönstren för intermedius och mitis dessutom är identiska har
dessa sammanförts som nongravis.
Toxinbildning förekommer också hos Corynebacterium pseudotuberculosis och
Corynebacterium ulcerans. Sådana stammar kan ge en difteriliknande sjukdomsbild
men några större epidemiska utbrott har dock inte beskrivits hos människa.
Patogenes och patofysiologi
Difteribakterien förekommer endast hos människa. Den är icke vävnadsinvasiv utan
förblir lokaliserad till slemhinnor vanligen i de övre luftvägarna, ibland i
konjunktiva och urogenitalia. Patogeniciteten är knuten till förmågan att bilda
exotoxin ett ADP-ribosyltransferas. Toxinet adsorberas snabbt till cellmembranerna. Efter cellpenetration blockeras proteinsyntesen, vilket resulterar i irreversibel
cellskada och celldöd. Affiniteten tycks vara störst till hjärta, njurar, och nervsystem. I slemhinnan utvecklas inom ett par dagar typiska membraner vilka kan
sprida sig över stora områden.
Symtom och klinisk bild
Efter en inkubationstid på vanligen 2-5 dagar debuterar sjukdomen oftast som en
faryngit som i vaccinerade populationer kan vara mycket lindrig. I mer uttalade fall
tillstöter feber, ömmande halslymfkörtlar och membranbildning. Vid spridning till
larynx, trakea och bronker kan obstruktion av luftvägarna uppstå (äkta krupp).
I svåra fall ses kraftig toxisk påverkan och hjärtkomplikationer med myokardit,
neurologiska komplikationer i form av polyneuriter samt tubulär njurskada med
proteinuri.
Huddifteri är vanlig i tropiska och subtropiska klimat. Vid den primära formen ses
på extremiteterna rundade ofta multipla sår som täcks av en fast membran eller
krusta som när den lossnar blottlägger ett urstansat sår med dålig läkningsförmåga.
Organkomplikationer av samma typ som vid svalgdifteri förekommer men är
ovanliga.
Epidemiologi
Fram till 1940-talet var difteri en vanlig och fruktad sjukdom med en morbiditet på
ca 5 % och en mortalitet kring 5-10 % av dessa. Den senaste difteriepidemin i
182
Sverige inträffade 1984-1986. Fram till 1988 anmäldes 38 kliniska fall varav 6
dödsfall och 70 friska bärare med toxinbildande stammar och 19 personer med
toxinnegativa isolat. Därefter finns endast något enstaka importfall registrerat.
I tidigare Sovjetunionen inträffade en uppmärksammad epidemi med kulmen 199495 omfattande mer än 150 000 registrerade fall och 5 200 dödsfall. Biotyp gravis
var dominerande men också mitis var vanlig.
Prevention
Sedan vaccination med toxoid infördes i ett allmänt vaccinationsprogram på 1950talet har sjukdomen difteri så gott som försvunnit hos fullvaccinerade. Enligt internationella rekommendationer har gränsen för immunitet lagts vid 0,1 IU/mL i seroepidemiologiska studier och partiell immunitet vid 0,01 IU. Dessa gränser uppnås
ej med nuvarande vaccinationsprogram för majoriteten äldre och förskolebarn i
Sverige.
Provtagning och transport
Önskemål om difteriodling måste särskilt anges på remissen. Vid misstanke om
difteri bör laboratoriet dessutom varskos per telefon eftersom substraten måste
specialberedas.
Vid misstänkt huddifteri rengörs misstänkt sårområde med steril koksalt, ev. krustor
avlägsnas och provtagningspinnen rullas med kraft i såret.
Materialet transporteras i transportsubstrat av samma typ som vid andra sårodlingar
och bör vara laboratoriet tillhanda inom 24 tim. I väntan på transport förvaras
provet i kylskåpstemperatur.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Referensmetod är odling på särskilda selektiva och differentierande medier.
Difteribakterier växer också bra på vanliga odlingsmedier.
Referensmetodik
Referenssubstrat
a) MTM (Modified Tinsdale´s medium)
b) Cystin/Tellurit blodagar
För substratrecept se I 8 referensmetodik vid övre luftvägsinfektioner sid 141142.
C. diphtheriae har förmåga att reducera cystin varvid bildas H2S som med
tellurit ger en mörk telluriumförening. På blodfri agar uppträder denna som en
mörkbrun halo kring kolonierna. Det är viktigt med positiva kontroller eftersom
MTM-agarn kan vara nyckfull.
Fosfomycinlappar (50 µg) kan också användas för selektion.
183
Isolering
Inkubering i 37 °C aerobt helst med tillskott av 5 % CO2, 3 dygn.
Avläsning sker efter 1, 2 och 3 dygn.
Identifiering och minimikriterier
På telluritblodagar är typiska kolonier gråbruna till svarta.
På MTM-agar ses inom 2 dygn en mörkbrun halo runt misstänkta kolonier. Sådana
kan emellertid också bildas av C. ulcerans, C. pseudotuberculosis samt vissa
streptokockstammar.
Difteribakterier är generellt resistenta mot fosfomycin och växer intill lappen.
Slutlig verifiering sker med biokemiska kriterier (se I 8 sid 96 och 143).
Kommersiella kits kan också användas.
Påvisande av toxinbildning.
Alla isolat av C. diphtheriae skall undersökas med avseende på toxinbildning.
Använd material från ca 10 kolonier.
Referensmetod är subkutan injektion på marsvin efter 24 timmars inkubering i
BHI-buljong. Som kontroll används marsvin som samtidigt fått antitoxin
intraperitonealt.
I vana händer utgör gel-diffusion enligt Elek-Ouchterlony ett fullgott alternativ (se I
8 sid 151) liksom PCR med primers riktade mot toxingenen.
Enstaka isolat utan epidemiologisk bakgrund bör sändas för verifiering.
Alternativ diagnostik
En PCR-baserad snabbmetod för diagnosen difteri finns beskriven från CDC. Här
användes två primerset mot toxingenens subenheter för A och B.
Direktmikroskopi är ofta svårbedömd även med specialfärgningar.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Isolerade difteribakterier är i regel känsliga för penicillin och erytromycin varför
resistensbestämning sällan blir aktuell.
Epidemiologisk typning
Epidemiologisk typning är värdefull som underlag för bedömning av ev. smittspridning.
Tidigare använd fagtypning har nu ersatts av molekylär karakterisering. Under
den senaste ryska epidemien utvecklades dels ribotypning dels MEE (multilocus
enzyme electrophoresis). För att underlätta monitorering av cirkulerande kloner
har en databas för ribotyper etablerats vid Institut Pasteur.
Kvalitetskontroll
Referensstammar: Corynebacterium diphtheriae nongravis tox+, CCUG 16574,
184
Corynebacterium diphtheriae gravis tox+, CCUG 5864.
Svarsrutiner
Stam som visar biokemi typisk för Corynebacterium diphtheriae och är toxinbildande svaras Corynebacterium diphtheriae gravis/nongravis, toxinbildande.
Motsvarande stam som ej bildar toxin svaras Corynebacterium diphtheriae, ej
toxinbildande.
Laboratorierapportering
Toxinbildande C. diphtheriae är anmälningspliktiga enl. Smittskyddslagen samhällsfarliga sjukdomar Grupp 1.1.
REFERENSER:
Golaz, A., Popovic, T., Wharton, M. Epidemiology of Diphtheria in the 1990s. Clin Microbiol Newslett. 2001;23:33-37.
Mikhailovich, V., M., Melnikov, V., G., Mazurova, I., K., Wachsmuth, I., K., Wenger, J.,
D., Wharton, M.,Nakao, H., Popovic, T. Application of PCR for detection of toxigenic
Corynebacterium diphtheriae strains isolated during the Russian diphtheria epidemic. J Clin
Microbiol. 1995;33:3061-3063.
Nakao, H., Popovic, T. Development of a direct PCR assay for detection of the
diphtheria toxin gene. J Clin Microbiol. 1997;35:1651-1655.
Referensmetodik. Infektionsdiagnostik: I 8 Övre luftvägsinfektioner. SMI-tryck nr 1031994.
185
Leptospira
Smittämnet
Leptospira är en spiroket med karakteristiskt utseende som bäst studeras i mörkfälteller faskontrastmikroskop. Bakterien är bara ca 0,1 µm tjock och passerar därför
lätt genom vanliga sterilfilter. Den är vanligen 6 - 20 µm lång, spiralformad med
upp till 18 varv i spiralen och avslutas oftast med en ”metkrok” i bägge ändar. Den
liknar därvid ofta ett frågetecken som även givit den sitt artnamn interrogans.
Bakterien är rörlig med två flageller vilka återfinns i det periplasmatiska rummet.
Flagellernas placering i det yttre membranet är avgörande för bakteriens spiralform.
Bakterien är för sin växt beroende av externa fettsyror som enda kolkälla.
Lepotospira är en bakterie med än så länge ej fullständigt kartlagd taxonomi. Genus
Leptospira indelas traditionellt i två arter med utgångspunkt från patogenicitet,
L. biflexa som är apatogen och L. interrogans som är patogen. L. interrogans
indelas vidare i >200 olika serotyper baserat på skillnader i lipopolysackaridens
struktur. Dessa serotyper kan vidare indelas i ett antal serogrupper (idag 19
stycken) baserat på inbördes korsreaktivitet. Den mest kända serotypen är L.
Icterohaemorrhagiae. Modern taxonomi baserad på DNA-homologi visar att
Leptospira kan indelas i sexton olika arter där man inom flertalet finner både
patogener och saprofyter. Varje art uppvisar ett flertal olika serotyper och samma
serotyp kan förekomma i flera arter. Då det inte är lätt att studera vare sig
patogenicitet eller att i rutindiagnostik idag göra DNA-homologistudier används i
praktiken serotyper fortfarande som artnamn.
Patogenes och patofysiologi
Många djur koloniseras av bakterien utan synbara symtom och blir därefter smittbärare under hela sin livstid. Hos andra djur, inklusive människa, kan samma bakterie ge upphov till sjukdom. Den huvudsakliga effekten vid en infektion är skador
på kärlens epitelceller. Symtomen kommer därför främst från organsystem med rik
vaskulering som njurar, lungor, muskler och lever. Virulensmekanismerna är än så
länge dåligt kartlagda.
Leptospira adhererar i laboratorieförsök till endotelceller. Leptospira har som andra
gramnegativa bakterier ett endotoxin som dock i biologiska tester är väsentligt
mindre toxiskt än det från enterobakterier. Flera serotyper producerar ett hemolysin.
Toxinernas betydelse för uppkomst av kärlskador är oklar, då de även produceras
av avirulenta stammar. Virulenta bakterier, till skillnad från avirulenta, avdödas inte
av neutrofila granulocyter. Allvarlig sjukdom kan orsakas av flera olika serotyper
av Leptospira, inte bara av Leptospira serotyp Icterohæmorrhagiae.
186
Symtom och klinisk bild
Inkubationstiden för leptospiros är mellan en dag och fyra veckor. Sjukdomen är
bifasisk med en septisk första fas och därefter en ”immunfas” under vilken de flesta
komplikationerna inträffar. Symtombilden vid human leptospiros är extremt
mångfacetterad. Flertalet infektioner, uppskattningsvis 90 %, är sannolikt subkliniska då seroprevalensen i endemiska områden är hög. I de fall symtom uppkommer är den klassiska sjukdomsbilden Weils sjukdom, karakteriserad av feber,
ikterus (gulsot), inre blödningar och njurinsufficiens med en mortalitet om ca 10 %.
Hos dem som överlever brukar organfunktionerna återställas helt efter avslutad
sjukdom. Många allvarliga infektioner med Leptospira förlöper dock utan ikterus.
Vid icke ikterisk sjukdom är symtomen som nämnts varierande. Lungpåverkan,
som först beskrivits under senare tid, kan variera från hosta till fatala lungblödningar. I ett utbrott i Korea 1987 var andningsinsufficiens p.g.a. lungblödning den
dominerande dödsorsaken. I dessa fall var njurpåverkan inte speciellt uttalad.
Aseptisk meningit kan förekomma i upp till 25 % av fallen. Intensiv huvudvärk,
fotofobi, synstörningar, neurologiska störningar etc. är andra vanliga symtom som
talar för engagemang av hjärnan. Påverkan på ögat i form av konjunktiviter och
iriter är även vanligt. Muskelvärk är vanligt och vid obduktion kan man se muskler
med omfattande blödningar. Av någon anledning verkar män vara känsligare för
infektion än kvinnor. I ett italienskt material omfattande 312 serologiskt diagnostiserade fall var 93 % män. Barn verkar inte insjukna lika ofta och har då i allmänhet
mildare symtom.
Epidemiologi
Leptospiros är enligt många bedömare världens vanligaste zoonos. I vissa endemiska områden är seroprevalensen upp till 50 %. Människa smittas genom att
komma i kontakt med infekterat vatten. Bakterien kan smitta genom småsår, genom
konjunktiva, genom inhalation av aerosol eller genom infekterad föda. Smittkälla är
vanligen kroniskt infekterade djur, främst råttor och andra gnagare, som utsöndrar
bakterier i urinen. I tempererat sötvatten kan bakterien överleva i månader.
Traditionellt har sjukdomen drabbat människor som arbetar och lever i tropiska
områden med mycket sötvatten. Typiskt är lantarbetare som arbetar på risfält.
Andra utsatta grupper är personer som hanterar avlopp. De många översvämningskatastroferna runt om i världen de senaste åren, med både mycket vatten och
sönderfallande infrastruktur, gör att förutsättningarna för smittspridning ökat
dramatiskt och gör leptospiros till en viktig ”emerging infection”. Speciellt i Sydamerika har effekterna av El Nino bäddat för en massiv smittspridning.
Leptospiros förekommer mest i tropiska områden, men i USA har man sett en
ökning av antalet fall sammanfallande med olika ”vattenaktiviteter”. Flera deltagare
i ett triathlonlopp i Illinois 1998 insjuknade i leptospiros. Hur den epidemiologiska
187
situationen ser ut i Europa och speciellt i Sverige är oklart.
Prevention
Vaccination av människa i större skala sker bara i Japan och Kina. Tetracyklin har
även använts med framgång som profylax.
Provtagning och transport
Lämpligt provmaterial för odling är blod eller urin. Bägge provtyperna måste omgående omhändertas och inokuleras i lämpliga substrat. För serologisk diagnostik
rekommenderas blod utan tillsatser.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Leptospira kan odlas på syntetiska substrat och kulturer växer då vanligen ut efter
två veckor. Vid primärisolering kan det ta betydligt längre tid. Blododlingar blir
oftast bara positiva de första dagarna innan symtom uppkommit. Urinodlingar kan
vara positiva under längre tid, i veckor, men man måste vänta i upp till 13 veckor
innan provet anses negativt. Direktmikroskopi på blod är möjligt men kräver 104
bakterier/mL. Fibrin och annat är dessutom för en otränad svårt att skilja från spiroketer. Flertalet diagnoser ställs därför med serologisk metodik. Odling är dock
nödvändig om man ska kunna identifiera vilken serotyp som orsakat infektionen.
Referensmetodik
Referenssubstrat
EHMJ – medium 5 mL i skruvkorksförseglat rör (se vidare ASM-Manual 7th ed.
sid 741).
Isolering
Blododling
Ett antal semisolida EHMJ-rör inokuleras med 2 – 4 droppar blod. Vid sidan av
ökad sensitivitet bör detta av praktiska skäl göras innan blodet koagulerat. Dokumentation saknas om huruvida Leptospira växer i konventionella blododlingsmedier.
Urinodling
Överlevnaden av Leptospira i human, vanligen sur urin, är dålig och urinprov
måste därför processas snarast möjligt. På grund av stor sannolikhet för kontaminerande bakterier skall en spädningsserie till 10-4 göras på urinprovet. Från varje
spädning tas 2 – 4 droppar och inokuleras på ett antal EHMJ-rör. För att förhindra
växt av kontaminerande flora kan 5-fluorouracil (200 µg/mL) eller neomycin (30
µg disk) tillsättas mediet.
EHMJ-rören inkuberas i mörker i 30 °C under 12 veckor. En gång i veckan skall
rören inspekteras för växt av leptospira. Under sterilitet tas någon droppe 1 – 3 cm
188
ned i röret och undersöks på förekomst av typiska spiroketer i mörkfält- eller faskontrastmikroskop. Kontaminerande flora kan elimineras om några droppar från det
kontaminerade röret sterilfiltreras genom ett 0,45 µm filter varefter filtratet överförs
till ett nytt EHMJ-rör.
Identifiering och minimikriterier
En preliminär identifiering kan göras genom det typiska mikroskopiska utseendet.
För konfirmerande identifiering är referensmetoden serotypning med en agglutinationstest som avläses i mikroskop (MAT). Denna teknik finns bara uppsatt på ett
handfull laboratorier i världen. PCR kan användas för identifiering men ger då inte
serotypen (se alternativ metodik).
Alternativ diagnostik
Påvisande av bakterier
PCR har använts med framgång för att påvisa förekomst av bakterier i patientprov.
Identifiering
Sekvenering av 16S-rRNA genen kan tjäna som identifiering av isolat.
Serologi
Då odlingsförfarandet är ganska omständligt ställs diagnosen vanligen med serologi. Referensmetoden är även här MAT där man använder levande eller formaliniserade bakterier som antigen. Då denna metod, som tidigare påpekats, bara finns
uppsatt på ett handfull laboratorier används oftast annan metodik. Ett antal serologiska tester baserade på bl.a. ELISA och agglutination finns kommersiellt tillgängliga.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Resistensutveckling finns inte beskriven för Leptospira och resistensbestämning
rekommenderas inte i Sverige. Behandling är, i förekommande fall, enligt litteraturen penicillin i.v. eller tetracyklin.
Epidemiologisk typning
Referensmetoden för epidemiologisk typning är serotypning med MAT-metoden.
Då denna är komplicerad och bara finns på ett begränsat antal laboratorier pågår arbete med DNA-baserad teknik.
Kvalitetskontroll
Referensstam: Leptospira interrogans, CCUG 5517.
Svarsrutiner
Fynd av typiska bakterier i odling kan preliminärbesvaras. Slutsvar lämnas efter
serotypning eller DNA-identifiering.
Laboratorierapportering
189
Infektioner med Leptospira är inte anmälningspliktiga enligt smittskyddslagen.
REFERENSER:
Doern, G.V. Detection of Selected Fastidious Bacteria. Clin Infect Dis. 2000;30:166-173.
Levett, P. Leptospirosis. Clin Microbiol Rev. 2001;14: 296–326.
Plank, R. Dean, D. Overview of the epidemiology, microbiology, and pathogenesis of Leptospira spp. in humans. Microbes Infection. 2000;2:1265-1276.
190
Listeria monocytogenes
Smittämnet
Listeria monocytogenes ger som enda species i genus Listeria infektion hos människa. Den beskrevs sannolikt första gången 1911 av veterinären professor Gustav
Hülphers i Stockholm som isolerade den från kanin. Dessa uppvisar vid infektion
en kraftig ökning av antalet monocyter, varav namnet.
Listeria är grampositiva, icke sporbildande, icke förgrenade, fakultativt anaeroba
små stavar.
Typiska egenskaper är rörlighet vid 20-25 °C och tillväxt i kylskåpstemperatur.
Patogenes och patofysiologi
Trots att risken för listeriasmitta är stor inträffar invasiv listerios sällan. L. monocytogenes är en invasiv intracellulär patogen. Överföring via livsmedel kräver
penetration av tarmslemhinnan. Bakterien kan replikeras i fagocyter och i Peyer´s
plaque. Resistens mot listeriainfektion är mycket beroende av cellmedierad immunitet. Detta förklarar också varför risken är störst hos immunsupprimerade och
under graviditet. AIDS-patienter utgör en substantiell riskgrupp. Intrauterin infektion sker sannolikt genom placentär transmission. Även immunkompetenta personer
kan insjukna i listerios.
Symtom och klinisk bild
Listerios är en allvarlig sjukdom som kan ge septikemi eller meningit främst hos
nyfödda och immunsupprimerade vuxna. Begränsade hudinfektioner har iakttagits
hos veterinärer och bönder som hanterat aborterade kalvar och fjäderfä. Nyligen har
L. monocytogenes identifierats som orsak till livsmedelsburen febril gastroenterit.
Inkubationstiden kan variera från 1 till 90 dygn.
En genomgång av listerios på Island under en 23-årsperiod visade en incidens på
6,9 per million. Mortaliteten var 33 % vid invasiv sjukdom.
En analys av 144 fall anmälda till SMI under perioden 1992-1996 gav vid handen
att 57 personer hade kroniska underliggande sjukdomar såsom malignitet, genomgången njurtransplantation, diabetes eller hjärt- kärlsjukdomar. Etylmissbruk uppgavs för 8. Trettioåtta patienter anmäldes avlidna i samband med sin listeriainfektion samtliga med någon underliggande grundsjukdom. Tjugotvå tillfällen av infektion under graviditet och/eller neonatal listerios anmäldes under perioden. Det
framgick att 4 infektioner hade lett till intrauterin fosterdöd. Många gravidae erfar
sannolikt endast en övergående influensaliknande bild som tidsmässigt hänger
samman med bakteriemin. Vid neonatal listerios brukar man skilja på tidig infektion där infektionen ofta skett intauterint och sen neonatal listerios som debuterar
flera dagar upp till veckor efter förlossningen ofta som meningit och kan orsakas av
191
smitta vid passagen genom förlossningskanalen. Även nosokomial smitta finns
beskriven.
Diarre´symtom har förekommit. Den långa inkubationstiden upp till 30 dagar tillsammans med förekomst av Listeria hos asymtomatiska bärare komplicerar tolkningen av ev. fecesdiagnostik. I en studie från 1972 återfanns Listeria i odling från
feces hos 4,8 % friska slakteriarbetare, 1,2 % vuxna sjukhuspatienter, 1 % av
patienter med diarre´ och hos 26 % av kontakter till listeriospatienter.
Penicillin och ampicillin ev. i kombination med gentamicin ger god sjukdomsläkning. Full utläkning kan också ske vid intrauterin infektion.
Epidemiologi
L. monocytogenes kan betraktas som en zoonos och har isolerats från jord, vatten
och även ur feces från många djurslag.
Under femårsperioden 1992-1996 anmäldes 187 personer och under följande
femårsperiod 226 fall till SMI.
Listeria är en betydelsefull livsmedelsburen patogen. Överföring via livsmedel
beskrevs första gången 1981 i Kanada med cole slaw (hackad vitkålsallad), sannolikt smittad genom fekalt förorenat vatten. Den mesta smittan sker via produkter
gjorda på opasteuriserad mjölk. Färskost har beskrivits som källa i många epidemier: Kalifornien 1985 (142 fall med 48 döda varav 30 foster/nyfödda), Vaud i
Schweiz 1983-87 (ca 100 fall). I Finland 1998-99 spreds smittan med smör (18 fall
varav 4 döda). Även köttprodukter som pate´ (Storbritannien 1989-1990 med ca
300 fall) och gristunga i gele´ (1992 Frankrike och 279 fall) har beskrivits liksom
vacuumförpackad regnbågslax från Värmland med 9 insjuknade.
Gemensamt för dessa födoämnen är att de förtärs utan vidare värmebehandling.
Provtagning och transport
Provtagning sker enligt tidigare beskrivna rutiner.
Vid septisk sjukdomsbild tas prov från blod och likvor.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
L. monocytogenes isoleras vanligen från blod, likvor och amnionvätska. Provtagning kan också övervägas från obduktionsmaterial och cervix. Vanlig fecesodling
är suboptimal för isolering av L. monocytogenes.
Referensmetodik
Referensubstrat
Vanlig blodagar.
Isolering från livsmedel och icke sterila lokaler kräver selektiva substrat och ev.
192
anrikning vid kylskåpstemperatur. Detta förfarande behandlas inte i denna bok.
Isolering
L. monocytogenes växer ut vid 37 °C i luft inom 2 dagar.
Identifiering och minimikriterier
L. monocytogenes ger betahemolys på blodagar. CAMP-test är positiv på fårblod.
Misstänkta isolat identifieras enligt de kriterier som ges under avsnittet om identifiering av grampositiva stavar i rutindiagnostik.
Listeria är eskulinpositiva vilket tillsammans med den mikroskopiska likheten kan
förorsaka förväxling med enterokocker.
Alternativ diagnostik saknas.
Resistensbestämning och resistensutveckling
Penicillin-binding protein 3 är måltavla för betalaktamantibiotika hos Listeria vilket
förklarar att penicilliner och imipenem är särskilt verksamma vid listerios medan
monobaktamer och cefalosporiner binder dåligt och följaktligen är mindre aktiva.
Epidemiologisk typning
För att fastställa samband mellan livsmedel och sjukdom är det av vikt att isolerade
stammar kommer till typning. Karakterisering omfattar molekylärbiologisk typning
och serotypning. Under 1970- och 80-talen dominerade serogrupp 4 medan serogrupp ½ och 4 fördelade sig ungefär lika under 90-talet. Elva serotyper har beskrivits. Endast ett fåtal har dock beskrivits vid epidemier varför serotypning har begränsat värde.
Kvalitetskontroll
Referensstam: Listeria monocytogenes, ATCC 15313.
Svarsrutiner
Växt av/Ingen växt av Listeria monocytogenes.
Laboratorierapportering
Listerios är anmälningspliktig under Övriga anmälningspliktiga sjukdomar, Grupp
A.2.
REFERENSER:
Arneborn Malin. Listerios i Sverige 1992-1996. Smittskydd. 1997;3:91-92.
Ekelund H., Laurell G., Melander S., Olding L., and Vahlquist B. Listeria infection in the
foetus and the newborn. A clinical, pathological and epidemiological study. Acta Ped. 1962;
51:698-711.
193
Hjaltested E.KR., Gudmundsdottir S., Jonsdottir K., et al. Listeriosis in Iceland, 1978-2000:
A description of cases and molecular epidemiology. Scand J Infect Dis. 2002;34:735-741.
Schuchat A., Swaminathan B., et Broome C.V. Epidemiology of human listeriosis. Clin
Microbiol Rev. 1991; 4:169-183.
194
Nocardia
Smittämnet
Familjen Nocardiaceae är nära besläktad med Mycobacteriaceae och Corynebacteriaceae. Dessa familjer brukar sammanfattas som ”mycolic acid-containing
genera”. Genus Nocardia består av 8 species av medicinsk betydelse centrerade
kring de 3 först beskrivna representanterna: N. asteroides, N. brasiliensis och
N. otitidiscaviarum. Nocardiae är aeroba, katalaspositiva, icke rörliga, filamentösa
och förgrenade, grampositiva stavar. Dessa fragmenteras lätt till pleomorfa stavformade och kockoida element. I vissa stadier av växtcykeln är de syrafasta samt
bildar lufthyfer och konidier.
De är allmänt förekommande i miljön. Vissa arter är opportunistiskt patogena för
människa och djur.
N. asteroides-komplexet (inkluderande N. asteroides, N. farcinica och N. nova)
orsakar de flesta allvarliga invasiva tillstånden medan N. brasiliensis huvudsakligen
orsakar subkutan infektion, särskilt i länder med tropiskt klimat.
Patogenes och patofysiologi
Nokardios är opportunistisk till sin karaktär och drabbar främst personer med
nedsatt infektionsförsvar. Infektionen uppkommer efter inhalation eller i sår efter
kontamination och traumatisk implantation. Trädgårdsarbete är vanligt i anamnesen.
Själva patogenitetsmekanismerna är komplexa och i stort okända. Det är dock
bekant att virulenta stammar av N. asteroides är fakultativt intracellulära och kan
växa i många olika cellslag.
Symtom och klinisk bild
Tre kliniska huvudtyper karakteriserar nokardios: 1) Primär pneumoni med risk för
spridning 2) primär hudinfektion och 3) primär subkutan infektion.
De allvarligaste formerna med spridning till andra organ uppträder främst hos
immundefekta. Särskilt hjärnabscess utgör en allvarlig komplikation som bör uppmärksammas i det diagnostiska arbetet.
Hudmanifestationerna kan vara av olika typ: a) cellulit eller abscess b) lymfokutan
infektion som t.ex. vid cat scratch disease c) myketom se också I 10 eller d) som
metastaser efter hematogen spridning.
Symtomen kan variera från enkla pustler till kroniska ulcerationer.
Epidemiologi
De aeroba aktinomyceterna är vanligt förekommande i jord och vatten.
195
Nokardios uppfattas som en i huvudsak samhällsförvärvad infektion. Det finns
dock flera exempel på anhopning av fall inom t.ex. transplantations- och hjärtkirurgisk verksamhet.
Sjukdomen är ovanlig men den sanna incidensen är okänd då den kliniska bilden
liknar den vid andra infektioner och den mikrobiologiska rutindiagnostiken inte är
optimal för identifiering av nokardia.
Provtagning och transport
Vanliga principer för provtagning och transport gäller även nokardia.
Bronkoalveolärt lavage, biopsier och obduktionsmaterial är exempel på material
från vilket nokardia isolerats.
Om myketom misstänks är aspirat att föredra framför pinnprov.
Nocardia är känsliga för frystemperatur.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Eftersom förekomst av nokardia lätt maskeras genom överväxt av andra organismer
är direktmikroskopi av särskild vikt.
Referensmetodik
Mikroskopi
Leta efter granulae i pus eller sputum både för direkt gramfärgning och odling.
Förgreningarna är ofta tydligare än för aktinomyceter. Nokardia är ofta syrafasta i
kliniskt material, vilket är vägledande men sådana färgningar är också svårtolkade.
Referenssubstrat
Blod- och hematinagar.
Nokardia har inga särskilda tillväxtkrav. Vid isolering från kontaminerat material
kan också selektivt medium användas. Selektiv BCYE-agar som rekommenderas
för legionelladiagnostik kan t.ex. prövas.
Isolering
Plattor inkuberas som vanliga sårodlingar men eftersom nokardia växer långsamt
måste odlingen vid misstanke fortgå 1 vecka.
Identifiering och minimikriterier
Kolonierna har ett högst varierande utseende men blomkålsliknade råa kolonier är
vanliga. Bildning av ett karotinliknande pigment ger dem en gulorange färgton.
Växt i lysozym är en av de värdefullaste testerna för att skilja Nocardia från aeroba
aktinomyceter.
Vidare typning bygger på mönster av syrabildning som uppstår vid metabolism av
kolhydrater. Också nedbrytning av adenin, kasein, hypoxantin, tyrosin och xantin
196
utnyttjas.
Vidare typning bygger på sekvensering av 16 S-rRNA.
Alternativ diagnostik
Olika serologiska test har prövats men visat brist på specificitet.
Resistensbestämning och resistensutveckling
Sulfa eller numera trim/sulfa har länge varit förstahandsval vid nokardios.
Resistensbestämning utförs ej rutinmässigt men information om species kan vara
viktigt då t.ex. N. farcinica är mindre känslig för framför allt bredspektrumcefalosporiner och erytromycin. Generellt anges Nocardia vara känsliga mot amikacin
och även ciprofloxacin med N. nova som undantag.
Epidemiologisk typning
Molekylär subtypning har framgångsrikt använts vid nosokomiala utbrott.
Kvalitetskontroll
Typstammar:
Nocardia asteroides, CCUG 10073,
Nocardia farcinica, CCUG 27778.
Svarsrutiner
Diagnostiken bör drivas till speciesnivå med tanke på den olika känsligheten för
antibiotika.
Växt av/Ingen växt av Nocardia.
Laboratorierapportering
Nokardios är inte anmälningspliktig.
REFERENSER:
Brown, J.M., McNeil, M.M., Desmond, E.P. Nocardia, Rhodococcus, Gordona, Actinomadura, Streptomyces, and other actinomycetes of medical importance. Manual of Clinical
Microbiology. American Society for Microbiology. 1999;7:370-398.
Smego Jr, R.A., Gallis, H.A. The clinical spectrum of Nocardia brasiliensis infection in the
United States. Rev Inf Dis. 1984;6:164-180.
197
Streptobacillus moniliformis
Smittämnet
Streptobacillus moniliformis är ett av två smittämnen som orsakar råttbettsfeber.
Det är en icke rörlig, aerob eller fakultativt anaerob, mycket pleomorf, gramnegativ
stav som vanligen växer i långa filament med jästliknande uppdrivningar – ”string
of pearls”, varav namnet. Ibland beskrivs den som mykoplasmaliknande.
Den förekommer normalt i orofarynx hos råttor, möss och andra gnagare.
Den andra organismen som förknippas med råttbettsfeber, Spirillum minus, har inte
odlats fram. Den ger en liknande klinisk bild och behandlas inte ytterligare i denna
bok.
Patogenes och patofysiologi
Råttbettsfeber utvecklas 1-4 upp till 10 dagar efter bett eller förtäring av infekterad
föda, vanligen rå mjölk. Ofta har såret då läkt utan tecken på varbildning eller lymfkörtelförstoring.
Symtom och klinisk bild
Symtomen varierar från lokal infektion till sepsis. Förutom vanliga sjukdomstecken
förekommer ofta komplikationer i form av artriter och petekiala eller mässlingsliknande utslag.
Epidemiologi
Råttbettsfeber är ovanlig. Den orsakas i västvärlden oftast av S. moniliformis medan
infektioner med Spirillum minus är vanligare i Asien. De flesta fallen inträffar hos
barn i städer med mycket råttor och dåliga sanitära förhållanden. Laboratorieinfektioner relaterade till försöksdjursarbete med möss och råttor finns också beskrivna.
Den variant som inträffat efter förtäring av rå mjölk går under beteckningen
Haverhill fever ellet erythema arthriticum epidemicum.
Prevention
Kontroll av råttstammen torde vara den bästa preventiva åtgärden.
Provtagning och transport
Störst chans att isolera organismen erbjuder prov från blod, ledexsudat och abscesser.
Laboratoriediagnostik
Odling är gängse metod för diagnostik.
Referensmetodik
Referenssubstrat
är vanliga blododlingsmedier med tillsats av blod och 10 - 20 % serum.
198
Isolering
sker ofta primärt under anaeroba förhållanden trots att bakterierna är fakultativt
anaeroba. Optimala odlingsförhållanden består av mikroaerofil miljö med tillsats
av CO2 och fuktighet vid 37 °C.
Avläsning sker efter 1 och 2 dygn.
Identifiering och minimikriterier
Efter två dygn ses genomskinliga ej hemolyserande kolonier.
Vid mikroskopi ses gramnegativa filamentösa böjda stavar med bulbösa uppsvällningar i centrum – string of beads.
Slutlig verifiering sker med biokemiska tester. S. moniliformis är eskulinpositiv
och fermenterar flera sockerarter. Den är oxidasnegativ, katalasnegativ, indoloch ureasnegativ.
Biokemisk verifiering kan dock vara svår att genomföra eftersom bakterierna är
svårodlade. Till hjälp har varit kromatogram av fettsyror. Idag torde sekvenering
vara en framkomligare väg.
Alternativ diagnostik
Serologi:
Falskt positiv reaktion i VDRL har beskrivits i 25 % av verifierade fall.
Resistensbestämning utförs inte rutinmässigt.
Penicillin och alternativt tetracyklin har erfarenhetsmässigt god effekt på det kliniska förloppet.
Epidemiologisk typning har inte varit aktuell.
Kvalitetskontroll
Referensstam: ATCC 14647.
Svarsrutiner
Växt av/Ingen växt av Streptobacillus moniliformis.
Laboratorierapportering
Råttbettsfeber är inte anmälningspliktig.
REFERENSER:
Jenkins S.G. Rat-bite fever. Clin Microbiol Newslett. 1988;10:57-59.
199
KLASS 3 organismer
Bacillus anthracis
Smittämnet
Bacillus anthracis tillhör genus Bacillus i familjen Bacillacae som dessutom omfattar genus Clostridium. Två bacillusarter ger sjudom hos människa. B. cereus
orsakar matförgiftning och B. anthracis antrax/mjältbrand.
Bacillus anthracis är sporulerande aeroba grampositiva stavar. I naturen förekommer de huvudsakligen som sporer. Sporernas överlevnad är mycket lång, >40
år. Den vegetativa formen av Bacillus anthracis dör relativt snabbt i de flesta
miljöer. Organismen Bacillus anthracis är nära förknippad med bakteriologins
utveckling och Louis Pasteur, både vad gäller basen för Koch´s postulat och principerna för vaccinologi. Antrax är ett fruktat biologiskt stridsmedel. Arbete med
organismen måste ske i BSL3-laboratorium.
Patogenes och patofysiologi
Infektionsdosen för människa har beräknats till 8 000-50 000 sporer vid inhalation.
Infektionsdosen varierar mellan olika djurslag.
Virulensfaktorer är dels en antifagocytär kapsel bestående av poly-D-glutaminsyra
dels ett exotoxin. Isolat som saknar kapsel är relativt avirulenta. Toxinet består av
tre skilda peptidkedjor, Edema Factor (EF) ett adenylat cyklas, Protective Antigen
(PA) som binder till en receptor och Lethal Factor (LF) ett endopeptidas. Var för
sig har de ingen effekt, men tillsammans ger de ödem, nekros och gör bakterien
letal för försöksdjur. Alla tre toxinerna kodas genom en 180 kb plasmid, pXO1,
medan kapselbildning kodas av en 80-kb plasmid benämnd pXO2.
Patofysiologin är beroende av infektionsväg. Vid inhalation transporteras sporerna
till regionala lymfkörtlar där de övergår i vegetativ form, multipliceras och bildar
toxin. Tillväxten är snabb och leder till massiv bakteriemi och död om inte behandling insätts tidigt. Tillväxten fortsätter post mortem och kan resultera i bakteriekoncentrationer på 108 bakterier/mL. Karakteristiskt är att blodet inte koagulerar
post mortem.
Vid kutan antrax infekteras ett sår av sporer vilka sedan germinerar. Förloppet är
långsammare och dödligheten lägre även obehandlad men infektionen kan via
regionala lymfkörtlar sprida sig till blod och ge sepsis.
Symtom och klinisk bild
I princip förekommer tre former: en kutan, en pulmonell och en gastrointestinal
form.
200
Den kutana formen är vanligast i utvecklade länder (90 - 95 %) och ses främst på
händer, underarmar och i ansiktet. Inkubationstiden är två dagar till en vecka. Vid
denna typ uppstår först ett typiskt gelatinöst ödem (EF) följt av ett nekrotiskt sår
som blir svart och kan vara flera cm i diameter. Hudförändringarna är typiskt
oömma. Obehandlad är dödligheten ca 20 %.
Efter inhalation uppträder först ospecifika infektionssymtom vilka efter några dagar
hastigt förvärras med tecken på sepsis och meningit. På röntgen ses mediastinal
körtelförstoring. Pneumoni i egentlig mening med sputa och lungaffektion utvecklas i allmänhet ej. Dödligheten är 100 % om sjukdomen inte behandlas. Om behandlingen sätts in tidigt, före 4 - 5 dagen, kan dödligheten reduceras.
Förtäring av infekterat kött kan leda till oro-faryngeal eller intestinal antrax.
Epidemiologi
Antrax är en zoonos som i första hand drabbar gräsätare. Historiskt har antrax
orsakat enorma förluster inom boskapsnäringen. Hos människa blev sjukdomen
tidigt känd som Woolsorter´s disease (pulmonär form). Det senast kända svenska
fallet av antrax hos människa inträffade 1964. En person som arbetade på en mattfabrik insjuknade och avled under loppet av några dygn. Kutan antrax uppträder
vanligen efter arbete med ull, hudar eller infekterade djur.
Mjältbrand hos djur påvisas huvudsakligen bland växtätare, i Sverige senast 1981.
Smittämnet antas kunna spridas med flugor som förtärt icke koagulerat blod från
döda djur, ev. också genom insektsbett. Smittan anses ej spridas direkt mellan
människor.
Globalt uppskattas antalet fall per år som 2000 till ca 20 000 fr.a. i Asien och
Afrika.
Antrax har också en potential som biologiskt stridsmedel.
Vid det utbrott som började i Florida den 2 oktober 2001 och orsakades av infekterade brev inträffade 22 fall (11 pulmonella och 11 kutana), varav fem med dödlig
utgång.
Under perioden 1955 - 1991 rapporterades totalt i USA 234 fall av kutan antrax.
Prevention
Antrax hos tamboskap förhindras bäst genom vaccination. Ett vaccin för humant
bruk används på militär personal i USA fr.a. vid stationering i riskområden som
Sydkorea och Mellersta östern. Vaccinet är framställt från odlingsfiltrat efter en
avirulent stam V770-NP1-R. Den är okapslad men innehåller de tre toxinkomponenterna PA, LF, och EF. Effekten, speciellt vid inhalation av stora mängder
sporer, är av naturliga skäl ej klarlagd.
201
Ett annat attenuerat levande endosporvaccin används i de gamla sovjetstaterna.
Antibiotikaprofylax används efter exposition och bör pågå 60 dagar. Anledningen
till denna långa tid är att vid ett oavsiktligt utsläpp i Sverdlovsk 1979 inträffade ett
fall efter 42 dagar.
Provtagning och transport
Vid misstänkt inhalations- och intestinal antrax och vid sepsisbild rekommenderas
blododling. Vid meningeala symtom likvor. Vid kutan antrax tas om möjligt aspirerat prov från blåsor annars pinnprov som vid andra sårodlingar. Vid gastrointestinal antrax kan ascites vara av värde.
Näsprov rekommenderas ej som diagnostiskt prov vid sjukdom men används vid
misstänkt exposition och för epidemiologisk uppföljning.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Antrax verifieras företrädesvis genom odling och PCR.
För full hantering av antraxprov krävs BSL3-laboratorium och tillstånd från Arbetsmiljöverket.
Referensmetodik
Referenssubstrat
B. anthracis växer bra på de flesta odlingsmedier som blod- och hematinagar, vilka
anses vara referenssubstrat.
Isolering
Bakterierna som är aeroba eller fakultativt anaeroba växer ut i vanlig atmosfär efter
24 tim. Bacillus har på blodagar ett karakteristiskt utseende.
För anrikning av antraxsporer i miljöprov kan värmebehandling utföras, varefter
provet odlas ut på referenssubstrat samt selektiv PLET (polymyxin-lysozymEDTA-tallosacetat)-agar. Inget av detta är normalt nödvändigt vid diagnostik av
humana infektioner.
Kapselbildning förstärks genom odling på fast substrat innehållande 0,5 %
NaHCO3 i 5-10 % CO2.
Identifiering och minimikriterier
Fynd av aeroba långa grampositiva stavar i korta kedjor från blododling och/eller
typisk klinisk bild skall väcka misstanke om antrax. Gramfärgning kan avslöja
uppklarning kring bakterierna som tecken på kapselbildning. Bakterien är orörlig
och hemolyserar ej. Växer ej på MacConkeyagar.
B. anthracis är nära besläktad med B. cereus, B. thuringiensis och B. mycoides både
202
vad beträffar DNA-homologi, ytantigen och biokemiska reaktioner. Presumtiv diagnostik av B. anthracis kan erhållas med kommersiella analysbrickor som t.ex. API
50CHB.
Identifiering sker med PCR genom påvisande av de bägge virulensplasmiderna
samt en specifik sekvens på 16S-rRNA, Slutlig verifiering sker genom sekvenering.
Misstänkt positiva fynd sänds vidare till SMI.
Alternativ diagnostik
Serologiska metoder finns utvecklade men är inte fullt validerade.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Bakterien är känslig mot alla vanliga antibiotika utom polymyxin B och neomycin.
Efter administration av penicillin blir såret bakteriefritt efter 24 tim.
Naturlig resistensutveckling är osannolik eftersom bakterien främst förekommer
hos vilda ej antibiotikabehandlade djur. Icke verifierade uppgifter talar dock om en
modifierad stam med penicillin- och makrolidresistens. Ciprofloxacin och doxycyklin rekommenderas av CDC som alternativ.
Epidemiologisk typning
Utförs ej rutinmässigt men har varit av värde vid spårning av den stam som spreds i
USA 2001. 17 patientprov och 106 omgivningsprov visade samma molekylära
subtyp.
Kvalitetskontroll
Referensstam: Bacillus anthracis, ATCC 14578.
Svarsrutiner
Fynd av primärdiagnostiserad Bacillus anthracis meddelas insändaren per telefon.
Slutsvar lämnas efter verifiering vid annat laboratorium.
Laboratorierapportering
Mjältbrand är anmälningspliktig enligt smittskyddslagen Grupp 1.2 Samhällsfarliga
sjukdomar.
REFERENSER:
Bush LM, Abrams BH, Beall A et Johnson CC. Index case of fatal inhalational anthrax due
to bioterrorism in the United States. N Engl J Med. 2001; 345:1607-1611.
Ezzell J.W. Anthrax-Pasteur to present. Clin Microbiol Newslt. 1988;10:113-116.
Guidelines for the surveillance and control of anthrax in humans and animals.
WHO/EMC/ZDI/98.6.
203
Inglesby TV, Henderson, DA, Barlett JG, Ascher MS, et al. Anthrax as a biological weapon:
Medical and public health management (consensus statement). JAMA. 1999;281:1735-1765.
Jernigan, D.B., et al. Investigation of bioterrorism-related anthrax, United States, 2001:
Epidemiological findings. Emerging Infectious Diseases. 2002;10:1019.
Laboratory protocols for clinical Laboratories for the identification of Bacillus anthracis.
CDC BT public web site: www.bt.cdc.gov
Snyder, J.W. The anthrax vaccine: A question of safety. Clin Microbiol Newslett.
2001;23:51-54.
Swartz MN. Recoqnition and management of anthrax– an update. N Engl J Med.
2001;345:1621-1626.
204
Brucella
Smittämnet
Brucella spp är gramnegativa orörliga kockobaciller. De är aeroba men kräver ofta
CO2 för växt speciellt vid primärisolering.
Inom genus Brucella brukar tre humanpatogena typer särskiljas: B. melitensis (från
får och getter), B. abortus (från nötkreatur) och B. suis (från svin och nöt). Moderna
DNA-analyser ger dock vid handen att de skulle kunna sammanföras till ett species,
B. melitensis. Ytterligare fyra Brucella spp, som enbart förekommer hos djur, har
identifierats.
Brucella hänförs till skyddsklass 3 (ASF 1997:12). De utgör en av de vanligaste
orsakerna till laboratorieinfektion. Öppet arbete med brucellabakterier innebär stor
risk för infektion. Därför bedrivs arbetet i BSL 3-laboratorium i speciell säkerhetsbänk.
Patogenes och patofysiologi
Brucella spp är intracellulära parasiter liksom tuberkelbakterierna och sjukdomen
kan i sin subakuta form förväxlas med tbc. Sedan bakterien penetrerat genom hud,
slemhinnor, mag-tarmkanal, konjunktivae eller luftvägar tas de upp och förökar sig
i lymfkörtlar, varifrån de kan gå ut i blodbanan och tas upp i organ rika på retikuloendotelialt system, t.ex. mjälte, lever, benmärg. I levern utvecklas granulom som
kan vara av diagnostisk betydelse. Bovin placenta utgör ett perfekt odlingsmedium
för B. abortus troligen p.g.a. att den innehåller erythriol. Denna kolhydrat finns ej
hos människa, varför brucellos inte utgör någon särskild risk för gravida kvinnor.
Symtom och klinisk bild
Brucellabakterier förorsakar brucellos (undulantfeber eller maltafeber).
Brucellos hos människa kan vara en akut, periodvis återkommande eller kronisk
sjukdom med sepsis/influensa-liknande symtom.
Inkubationstiden hos människa varierar från veckor till flera månader. Insjuknandet
kommer ofta smygande med långsamt stigande feber och bradykardi. Någon gång
går febern i vågor, undulerar. Den kliniska bilden är skiftande: sjukdomskänsla, lätt
diffus ledvärk, svettningar särskilt nattetid och sänkt stämningsläge förekommer.
Mjälten kan vara öm och förstorad och levern palpabel.
Kronisk brucellos är en lokaliserad sjukdom som persisterat minst ett år. Fokala
lesioner kan uppträda i alla organ men i mer än hälften av fallen är skelett och leder
involverade.
Mortaliteten är låg, spontant tillfrisknande sker vanligen inom några veckor, men i
synnerhet hos obehandlade patienter förekommer ofta recidiv. Dessa kan leda till
205
synnerligen terapiresistenta kroniska tillstånd med lokala härdar, möjligen beroende
på den intracellulära lokalisationen av bakterierna.
I endemiska områden förekommer titerstegringar utan symtom hos 30-40 % av
exponerade personer.
Epidemiologi
Brucellos överförs till människa från djur, Även spridning från människa till människa har beskrivits. Svenska patienter, har vanligen smittats i Medelhavsområdet
och i Sydamerika genom förtäring av t.ex. infekterad getost. B. abortus ger smittsam kastning (abort) hos nötkreatur, och kan spridas t.ex. genom opasteuriserad
mjölk. B. suis förekommer hos svin, vanligast i USA och är den typ som ger den
svåraste sjukdomsbilden hos människa. Hos personer som arbetar med sjuka djur
överförs sjukdomen genom infektion av händerna, med eller utan sår.
I Sverige är bovin brucellos utrotad sedan 1950-talet. Importfall och laboratoriesmitta förekommer dock fortfarande. Under perioden 1990-1999 meddelades totalt
ca 30 fall till SMI.
Prevention
Genom extensiva vaccinationskampanjer är nu många länder fria från bovin brucellos.
B. abortus avdödas vid pasteurisering.
Provtagning och transport
För odling av Brucella rekommenderas blod, sternalpunktat (särskilt i subakuta fall)
eller punktat från annan steril lokal. Materialet inokuleras i aerob blododlingsflaska
innan transport. Koagulerat material lämpar sig ej för odling, eftersom sådana prov
kräver mortling med ökad risk för smittspridning och kontamination. Dessutom är
överlevnaden av intracellulära brucellabakterier osäker efter koagulation.
Störst sannolikhet att isolera Brucella ur ett blodprov eller benmärgspunktat är
tidigt i en febertopp. Även aspirat från abscess, lymfkörtel eller i nödfall pinnprov
kan övervägas. Vid misstanke om Brucella bör blododlingsflaskan sändas till
säkerhetslaboratorium för utodling.
Vävnadsprov transporteras i en steril provtagningsburk innehållande en mindre
mängd steril koksalt.
Pinnprov transporteras nedstoppat i ett transportsubstrat.
206
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Diagnosen brucellos kan verifieras med odling och serologi. Odling är referensmetod.
Serologi i sin nuvarande utformning har bedömts inte fylla kraven på standardisering.
För att odla ut prov med Brucella-misstanke krävs tillstånd från Arbetsmiljöverket,
vilket i praktiken innebär att arbetet måste utföras i ett BSL3-laboratorium. Vid
misstanke på växt av Brucella i en blododlingsflaska skall denna därför sändas till
ett laboratorium som uppfyller dessa krav, t.ex. SMI. Om utfallet blir negativt för
Brucella sp bör laboratoriet efter enskild bedömning kunna ge alternativt
taxonomiskt besked och göra ev. resistensbestämning.
Referensmetodik
Referenssubstrat
Brucellabakterier växer på de flesta rutindiagnostiska substrat som blodagar, hematinagar och brucellaagar vid 37 °C i en miljö av 5 - 10 % CO2.
De flesta moderna blododlingssystem indikerar växt av Brucella efter 5 dygn. Vid
särskild brucellamisstanke är förlängd odling upp till 28 dagar tillrådlig i negativa
fall. Fynd av Brucella först efter 21 dygn har gjorts vid SMI på en patient under
antibiotikaterapi.
Isolering
sker enligt rutiner som anges i referenslaboratoriets kvalitetsmanual. Plattorna
avläses efter 2 - 3 dygn och efter en vecka då de kastas.
Identifiering och minimikriterier
Brucellakolonier på blod- och/eller hematinagar är små, olika stora och stafylokockliknande, ej hemolyserande. De är katalas- och oxidaspositiva, gramnegativa
små kockoida stavar.
Misstänkta kolonier sänds till SMI för verifiering med biokemi, PCR och agglutination med monospecifika brucellaantisera.
Artidentifiering utförs ej regelbundet vid SMI p.g.a. hög kostnad och begränsat
värde för behandlingen av patienten. Vid fynd av annan bakterie gör SMI
artidentifiering med API eller motsvarande metod.
Alternativ diagnostik
Serologi: Den klassiska röragglutinationstesten-Widal- har ersatts av ELISA-metodik som är känsligare men mindre väl standardiserad och ej kommersiellt tillgänglig.
207
Resistensutveckling och resistensbestämning
Vid behandling av brucellos måste hänsyn tas till bakteriens intracellulära överlevnad.
I allmänhet väljs kombinationsterapi under lång tid. Tetracykliner, aminoglykosider, rifampicin och trimsulfa har alla använts med framgång.
Resistensbestämning rekommenderas ej.
Epidemiologisk typning
Att särskilja de olika biotyperna av Brucella kräver speciella antisera och substrat.
Vid importfall eller vid konstaterad laboratorieinfektion ger denna information
mycket lite epidemiologisk hjälp samtidigt som den är mycket kostsam.
”Artidentifiering” görs därför inte rutinmässigt.
Kvalitetskontroll
Referensstammar: B. abortus, ATCC 23448,
B. melitensis, ATCC 23456,
B. suis, ATCC 23444.
Växt på använda substrat kontrolleras regelbundet.
Vid identifiering med PCR används positiv och negativ DNA-templat.
Antisera kontrolleras mot referensstammar vid utebliven agglutination med misstänkt isolat.
Svarsrutiner
Växt av/Ingen växt av Brucella.
Laboratorierapportering
Brucellainfektion är ej anmälningspliktig enligt Smittskyddslagen, men rapporteras
på listan för frivillig laboratorierapportering.
I förslag till ny smittskyddslag är undulantfeber klassad bland ”Övriga anmälningspliktiga smittsamma sjukdomar”.
REFERENSER:
Lindberg, J., Larsson, P. Transmission of Brucella melitensis. Lancet. 1991;337:848-849.
Ruben, B., Wong, P, Band J.D., Colville, J. Person-to-person transmission of Brucella
melitensis. Lancet. 1991;337:14-15.
Yagupsky, P., Peled, N., Riesenberg, K., Banai, M. Exposure of hospital personnel to Brucella melitensis and occurrence of laboratory-acquired disease in endemic area. Scand J
Infect Dis. 2000;32:31-35.
208
Burkholderia mallei och pseudomallei
Smittämnen
Bakterier tillhörande genus Burkholderia, före 1992 inkluderade i genus Pseudomonas, är gramnegativa, obligat aeroba stavar. Inom detta genus finns tre species
som hos människa orsakar sjukdom: B. cepacia ses främst vid cystisk fibros,
B. mallei orsakar "glanders" hos häst, men kan vid kontakt med djur eller vid
laboratoriearbete också ge humana infektioner, och slutligen B. pseudomallei som
ger sjukdomen melioidos.
Infektioner med B. mallei och B. pseudomallei är ofta svårbehandlade och deras
potential som B-stridsmedel gör att de klassas som BSL3-patogener.
Patogenes och patofysiologi
Virulensfaktorer och virulensmekanismer hos Burkholderia är ofullständigt
kartlagda.
Nästan alla kliniska isolat av B. pseudomallei saknar förmåga att assimilera
L-arabinose som enda substrat medan biotyper med denna förmåga förekommer
parallellt i jord i 25-50 %. Detta är ett uppslag för vidare studier av virulensmekanismer hos sjukdomsframkallande biotyper
Symtom och klinisk bild
Symtombilden vid både både melioidos och "glanders" varierar beroende på infektionsväg. Vid inhalation av bakterier ger de en allvarlig pneumoni som kan spridas
till blod och ge septisk sjukdomsbild. Vid infektion av sår fås primärt en sårinfektion. Även den kan sprida sig hematogent och ge septisk sjukdomsbild. Obehandlade septikemier är ofta fatala inom 7 - 10 dagar. B. pseudomallei anses kunna ge
latenta infektioner med symtomdebut år efter infektionstillfället.
Epidemiologi
B. pseudomallei finns allmänt förekommande i vatten, särskilt risfält och jord i
Sydostasien och norra Australien. I undantagsfall infekteras människa som då
insjuknar i melioidos. I Thailand är melioidos den vanligaste samhällsförvärvade
typen av septikemi.
B. mallei förekommer endemiskt hos främst häst i Afrika, Asien och Sydamerika.
Sjukdomarna melioidos och "glanders" är mycket ovanliga i Sverige. Ett fall av
melioidos rapporterades år 1999 av SMI hos en person smittad i Vietnam.
Infektioner med B. mallei är generellt mycket ovanliga. I USA hade inte någon
infektion setts sedan 1940-talet när en laboratorieinfektion nyligen inträffade.
Melioidos är vanligare och har både drabbat amerikanska soldater och under senare
år även turister främst i Sydostasien.
209
Prevention
Det finns inga verksamma vacciner mot Burkholderia. Prevention består därför i
att undvika kontakt med smittade hästar vad gäller "glanders"och för melioidos i
första hand att undvika endemiska områden och i andra hand att skydda sår och
rispor från sötvatten och jord.
Provtagning och transport
Vid septisk bild rekommenderas blododling. Vid kutan infektion tas pinnprov som
för andra sårodlingar.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Infektioner med Burkholderia diagnostiseras företrädesvis genom odling. För
melioidos finns serologiska metoder uppsatta, dock inte i Sverige.
Referensmetodik
Referenssubstrat
Burkholderia växer bra på de flesta substrat. Referenssubstrat utgörs av blod- och
hematinagar.
Isolering
Bakterierna som är aeroba växer ut i luft.
Identifiering och minimikriterier
B. pseudomallei identifieras vanligtvis med API20NE; andra kommersiella tester
klarar inte av att identifiera denna bakterie. En kommersiell test identifierade
B. mallei som Pseudomonas fluorescens/putida vid det senaste fallet i USA.
Konfirmerande diagnos görs med DNA-metodik. Fynd sänds till ett internationellt
referenslaboratorium för konfirmering.
Alternativ diagnostik
För B. pseudomallei finns en serologisk metod att påvisa bildade antikroppar. Det
laboratorium som SMI i förekommande fall anlitar, PHLS i London, använder en
ELISA där hela bakterier används som antigen.
Resistensutveckling och resistensbestämning
B. mallei är in vitro vanligen känslig för imipenem och trimetoprim/sulfa liksom för
ciprofloxacin, ceftazidim, gentamicin, streptomycin och tetracyklin. Erfarenheter av
behandling är dock ringa p.g.a. de få fallen i den utvecklade världen.
B. pseudomallei är vanligen känslig för amoxicillin, azlocillin, ceftazidim,
ticarcillin och aztreonam. Känsligheten för ciprofloxacin varierar. I Thailand finns
förvärvad resistens mot trim/sulfa.
210
Epidemiologisk typning
Utförs ej rutinmässigt.
Kvalitetskontroll
Referensstammar: Burkholderia mallei, ATCC 23344,
Burkholderia pseudomallei, ATCC 23343.
Svarsrutiner
Fynd av bakterie telefonbesvaras. Slutsvar ges efter konfirmering av annat referenslaboratorium.
Laboratorierapportering
Infektioner med Burkholderia är inte anmälningspliktiga enligt smittskyddslagen.
REFERENSER:
Dharakul, T., Tassaneetrithep, B., Trakulsomboon, S., Songsivilai, S. Phylogenetic
annalysis of Ara+ and ara- Burkholderia pseudomallei isolates and development of a
multiplex PCR procedure for rapid discrimination between the two biotypes. J Clin
Microbiol. 1999;37:1906-1912.
211
Francisella tularensis
Smittämnet
Bakterier tillhörande genus Francisella är små gramnegativa, obligat aeroba kockoida stavar. Släktet är uppkallat efter Edward Francis verksam i USA på 1920- och
30-talen. Inom detta genus återfinns två species, F. tularensis (efter Tulare county i
södra Kalifornien) och F. philomiragica. F. tularensis, som orsakar tularemi eller
harpest förekommer i två huvudtyper: Typ A, spp tularensis, med spridning i
Nordamerika, ger allvarligare infektioner än Typ B, spp palearctica som
förekommer i Sverige, övriga Europa, och Asien. På grund av sin stora förmåga att
ge laboratorieinfektioner vid odling klassas F. tularensis som en BSL3-patogen.
Patogenes och patofysiologi
Typ A är till skillnad från Typ B letal för marsvin och kanin. Hos människa orsakar
50 Typ A organismer tillförda i aerosol eller subkutant svår sjukdom medan 12000
Typ B bakterier ger mild, självbegränsande sjukdom.
Infektionen sprider sig från ett infekterat sår till de regionala lymfkörtlarna som
svullnar och sprids därifrån ibland vidare till blodbanan.
Den enda kända virulensfaktorn hos F. tularensis är dess förmåga att överleva
intracellulärt. Vidare anses att lipopolysackariden är en virulensfaktor eftersom
genomgången infektion ger höga titrar mot LPS.
Symtom och klinisk bild
Den kliniska bilden varierar beroende på infektionssätt. Den vanliga spridningen
via insektsbett ger efter tre till sju dagar framförallt svullna lymfkörtlar och feber,
ibland också typiska sår (ulcero-glandulär form). Obehandlad är sjukdomen långdragen med månadslånga symtom. I en del fall är sjukdomen allvarligare med
lunginflammation eller sepsis. Mortaliteten vid obehandlad Typ A pneumoni har
angivits till 10 %. Vid infektion med Typ B är dödsfall ovanliga.
Epidemiologi
Harpest är en zoonos som sprids från smågnagare och hare till människa via direktkontakt, insektsbett eller via inandning av aerosoler och damm, förorenat av
sjuka djurs avföring eller urin. En viktig riskfaktor vid pneumoniformen är aerosolbildning som kan uppstå vid motoriserat trädgårdsarbete under fuktig väderlek.
Bakterien kan, ehuru ej sporbildande, överleva månadsvis i vattenrik miljö.
Harpest förekommer i de flesta länder på norra halvklotet men inte söder om
ekvatorn. Utbrott av tularemi har de senaste åren även beskrivits i Spanien och i
Kosovo. Typ A har nyligen isolerats i Slovakien. Tularemi får därför anses vara en
"emerging infection".
212
Tularemi är endemiskt förekommande i Sverige. Traditionellt har ett område i
Dalarna, Hälsingland och Gästrikland varit en "hotspot". Vid det senaste utbrottet
år 2000 med 464 rapporterade fall inträffade sjukdom efter smitta i både Uppland,
Södermanland och även i Stockholm. Så många fall har inte rapporterats något år
sedan 1970. Under de flesta åren på 90-talet har färre än 100 fall rapporterats.
Svensk skogshare är känsligare än fältharen med hög dödlighet och det är möjligt
att subkliniska former hos den senare bidrar med fler fall hos jägare. Till skillnad
från andra länder, där fästingar är en viktig vektor för smittspridning, anses det att
mygg är den viktigaste vektorn för smittspridningen i Sverige.
Prevention
Det finns för närvarande inte något kommersiellt tillgängligt vaccin. Ett effektivt
vaccin måste bestå av levande modifierade bakterier.
Provtagning och transport
Vid den ulcero-glandulära formen kan bakterien odlas fram från det infekterade
såret. Liksom för andra sårodlingar rekommenderas ett pinnprov i transportsubstrat.
Vidare kan bakterien framodlas från punktioner av lymfkörtlar och biopsier.
Aspirat transporteras lämpligast på en steril bommullspinne i transportsubstrat.
Biopsier transporteras i steril koksalt i ett sterilt rör.
För serologi rekommenderas ett rör utan tillsatser.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Odling av Francisella tularensis är referensmetod och kräver tillgång till ett BSL3laboratorium.
Merparten av diagnoser ställs med serologi men direktpåvisning med PCR kan
också göras. Serumprov anses inte smittsamma.
Serologin är dock ej så standardiserad att den kan anses vara referensmetod.
Referensmetodik
Referenssubstrat
Tularemiagar med och utan antibiotika, PcG, polymyxin B och cyklohexamid
(Gaspar) samt blodagar.
Isolering
Provet stryks ut på referenssubstraten och inkuberas i luft med fuktig miljö – plastpåse med fuktad kompress - upp till fem dygn.
F. tularensis växer vanligen ut på två dygn som marmorskimrande kolonier.
Identifiering och minimikriterier
F. tularensis identifieras genom att den växer på tularemiagar men inte på blodagar
213
samt att bakterien agglutinerar i specifikt antiserum. Vid osäkerhet kan bakterien
verifieras med en PCR specifik för 16S-rRNA gener.
Alternativ diagnostik
PCR
F. tularensis kan påvisas direkt i sårsekret med PCR. Rutinmetod för detta finns
uppsatt på bakteriologiska laboratoriet vid Norrlands Universitetssjukhus, Umeå.
Diagnosen tularemi kan ställas med serologisk metodik. Den klassiska Widalmetoden har ersatts av ELISA som baserar sig på ett lipopolysackaridantigen.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Någon resistensutveckling har inte noterats. Dock görs inte regelmässigt resistensbestämningar men kan i förekommande fall inskränkas till preparat som ger intracellulära koncentrationer. Standardbehandling är tetracyklin, men även ciprofloxacin rapporteras vara effektivt.
Epidemiologisk typning
Någon standardiserad metod för att särskilja isolat under artnivå finns inte. Arbete
pågår, bl.a vid FOI, att utveckla DNA-baserad typningsmetodik.
Kvalitetskontroll
Referensstam: Francisella tularensis, ATCC 06223.
Den selektiva tularemiagarn prövas regelbundet för växt av Francisella tularensis.
Vid PCR körs parallellt en positiv och en negativ DNA-kontroll.
Svarsrutiner
Växt av/Ingen växt av Francisella tularensis.
Laboratorierapportering
Tularemi är anmälningspliktig enligt smittskyddslagen Grupp A.2 Andra anmälningspliktiga sjukdomar.
REFERENSER:
Arneborn, M., Tegnell, A. Harpestepidemi i Sverige. Smittskydd. 2000;6:124-125.
Hornick R. Tularemia revisited. N Engl J Med. 2001;345:1637-1639.
214
Rickettsia
Smittämnet
Rickettsiae är små (0,3-1,0 µ) strikt intracellulära gramnegativa kockobaciller. Som
en följd av DNA-sekvensdata är emellertid taxonomin under modifiering. De
indelas vanligen i
a)
en tyfusgrupp (TG) med R. prowazekii, R. typhi och R. canada. Tidigare
Rickettsia tsutsugamushi, etiologiskt agens för scrub typhus, har överförts
till ett nytt genus; Orientia. Människa är den naturliga reservoaren i
R. prowazekiis livscykel och löss fungerar som vektor. För R. typhi är
råttor reservoar och loppor vektorer.
b) en ”spotted fever” grupp (SFG) omfattande ca 20 species. I denna grupp
utgör fästingar såväl reservoar som vektor. Flera olika djurslag utgör
mellanvärd förutom människa som mer accidentellt utsätts för smittan och
inte normalt ingår i SFG-rickettsians livscykel. Den i Sverige, Centraleuropa och Japan påvisade Rickettsia helvetica sprids med Ixodes ricinus.
Besläktade genera är Bartonella och Coxiella.
I Arbetsmiljöverkets anvisningar (1997:12) anges följande species som klass 3
organismer: R. conorii, R. typhi, R. prowazekii, R. rickettsii och O. tsutsugamushi
samt med (**) - normalt inte luftsmitta - R. acari, R. canada och R. montana;
övriga som Klass 2.
Patogenes och patofysiologi
Rickettsiorna förökar sig i kärlens endotel och ger därigenom upphov till småkärlsvaskulit med olika symtom beroende på vilka organ som drabbas. Som en följd
av endotelskadan uppstår ökad permeabilitet och läckage av vätska ut i den
interstitiella vävnaden. Särskilt vid epidemisk tyfus kan en perivaskulär reaktion ge
upphov till noduli bestående av inflammatoriska celler. Invaderas kärlens glatta
muskulatur kan en nekrotiserande typ av vaskulit med trombos uppstå.
Smittämnet har i en del fall med epidemisk tyfus samt enstaka fall orsakade av
R. rickettsii visats leva kvar i kroppen under många år och kan reaktiveras upp till
flera decennier senare.
Symtom och klinisk bild
Den klassiska formen av epidemisk tyfus domineras av långdragen feber, intensiv
huvudvärk och ett makulärt utslag som debuterar omkring den femte dagen. Mortaliteten vid obehandlad sjukdom är 10-30 %.
Återfall kan ske efter många år som en mildare form av tyfus – Brill-Zinssers
sjukdom.
215
Spotted fever uppträder med olika geografiska tillnamn som mer eller mindre
allvarliga sjukdomstillstånd. Utdragen feber, muskelvärk och utslag av varierande
typ är genomgående drag. Rocky Mountain spotted fever, orsakad av Rickettsia
rickettsii, ger i allvarliga fall hemorragiskt nekrotiska eller gangränösa långsamt
läkande ulcera. Mediterranean spotted fever eller ”boutonneuse” fever, orsakad av
R. conorii, uppvisar initialt vid fästingbettet en typisk sårbildning – tache noire eller
eschar. Utslaget är vid detta tillstånd papulärt snarare än makulärt. Infektion med R.
africae, vanlig i Södra Afrika, karakteriseras av multipla eschar och ibland
blåsformigt utslag.
Scrub typhus liknar epidemisk tyfus men interstitiell myokardit är mer frekvent
förekommande.
Epidemiologi
Fläcktyfus är i krigshistorien förknippad med större dödlighet än den orsakad av
själva striderna.
Vid epidemisk tyfus överförs smittan genom att ett lusbett kontamineras med lusens
feces. Fecalierna innehåller stora mängder rickettsior som visats kunna överleva
upp till 100 dagar.
Fläcktyfus är numera endemisk i Sydamerikas högländer, Afrika och Asien men det
finns tecken på att den också återkommer i epidemisk form. Under inbördeskriget i
Burundi på 1990-talet infekterades mer än 30 000 människor. Scrub typhus är
begränsad till sydöstra Asien, Indien och norra Australien.
Av spotted fever rickettsioserna, som förekommer i de flesta världsdelar, och där
företrädesvis fästingar överför smittämnet, vid bett, direkt genom saliven är Rocky
Mountain spotted fever liksom Mediterranean spotted fever väl kända och beskrivna sedan början av förra seklet. Benägenheten att ge rash liksom eschar, det
typiska långsamläkande såret på platsen för bettet, har bidragit till att de lättare
diagnostiserats.
I Sverige diagnostiserades rickettsios hos 77 svenska utlandsresenärer under perioden 1997-2001, 14 tillhörande tyfusgruppen och 63 spotted fever gruppen. Majoriteten hade smittats i södra Afrika. Förekomsten av inhemsk rickettsios är dock
dåligt kartlagd men några få fall orsakade av R. helvetica har beskrivits. Sådana fall
har även rapporterats från Frankrike.
216
Prevention
Effektivaste förebyggande åtgärden är att bekämpa vektorn och skydda sig mot
bett.
Mot Rocky Mountain Spotted Fever finns ett avdödat vaccin, som dock används i
mycket begränsad omfattning. Mot övriga rickettsioser saknas vaccin.
Provtagning och transport
Provtagningsmaterial: För serologisk undersökning samlas blod i sterilt rör utan
tillsats eller med gel, lämpligen vacutainerrör eller motsvarande.
Transport enligt gängse rutiner för serologiska prov.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Laboratoriediagnostiken är baserad huvudsakligen på serologi men även på identifiering av själva mikroben.
Referensmetodik
Serologi: I Sverige används indirekt mikroimmunfluorescens. Analysen utförs på
objektglas med acetonfixerade formalinbehandlade renade bakterier som antigen.
Serologisk screening mot rickettsioser utförs på SMI med R. conorii och R. typhii
som antigen.
För konfirmering av osäkra resultat skickas provet till referenslaboratorium i
Marseille.
Alternativ diagnostik
Direktpåvisning
IF: Organismen kan påvisas i vävnadsprover med fluoresceininmärkt polyklonal
eller monoklonal antikropp. Erfarenhet finns för närvarande endast från forskningssammanhang inom landet.
PCR: För forskningsändamål finns erfarenhet med PCR för påvisning och identifiering av rickettsier baserad på 16S-rRNA-, gltA- och 17 kDa-genen. Metodiken är
ej validerad som referensmetod eller rutinmetod.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Tetracykliner är alltjämt effektiva förstahandsmedel och resistensbestämning är inte
aktuell. Andra antibiotikaregimer inkluderar kloramfenikol alternativt kinoloner
eller rifampicin.
Epidemiologisk typning
Typning till speciesnivå anses som regel tillfyllest. För typning anlitas för närvarande referenslaboratoriet i Marseille.
217
Kvalitetskontroll
Europeiskt referenslaboratorium för rickettsioser är beläget i Marseille, (Unité
des Rickettsies, Faculté de Medecine, CNRS UPRESA 6020, 27 Blvd. Jean
Moulin,13385 Marseille, France).
Svarsrutiner
I det serologiska svaret från SMI anges IgG- och IgM-titrar med en kommentar.
Sera undersöks i spädningar 1:20 – 1: 640. Bedömning: Titer ≤ 20: antikroppar mot
resp agens påvisas ej. Titer ≥ 40: antikroppar mot resp agens påvisas.
Serologiska korsreaktioner förekommer inom olika genus inom familjen
Rickettsiacae. För spotted fever gruppen används därför R. conorii som referensstam vid SMI för spotted fever rickettsior.
Analogt används R. typhii som antigen för tyfusgruppen. IgG är som regel specifikt,
speciellt tidigt i sjukdomsförloppet, till skillnad från IgM-svaret som är mer
ospecifikt. Enbart IgM-titrar anses otillräckligt för att ställa en serologisk diagnos.
Prov svaras därför ej ut som positiva för spotted fever gruppen eller typhus gruppen
om specifikt IgG ej påvisas.
Laboratorierapportering
Smittskyddslagen tar under samhällsfarliga sjukdomar 1,1 upp fläcktyfus eller
epidemisk tyfus orsakad av Rickettsia prowazekii.
REFERENSER:
Nilsson Kenneth. 2002. Rickettsia helvetica. Detection in arthropods and human tissues
and its relation to clinical disease. Dissertation. Acta Universitatis Upsaliensis, 2002.
Philip RN, Casper EA, Peacock MG and Burgdorfer W. Microimmunofluorescence test for
the serological study of Rocky Mountain spotted fever and typhus. J Clin Microbiol. 1976;
3:51-61.
Rahman, A., Tegnell, A., Vene, S., and Giesecke, J. Rickettsioses in Swedish travellers,
1997-2001. Scand J Infect Dis. 2003; 35:1-4.
Raoult D and Roux V. Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases.
Clin Microbiol Reviews. 1997; 10: 694-719.
Walker, DH, Cain BG and PM Olmstead.. Laboratory diagnosis of Rocky Mountain spotted
fever by immunofluorescent demonstration of Rickettsia in cutaneous lesions. Am J Clin
Pathol. 1978; 69:619-623.
218
Yersinia pestis
Smittämnet
Yersinia pestis är orörliga icke sporbildande gramnegativa kockobaciller.
Genus Yersinia inkluderar 10 species av vilka Y. pestis, Y. pseudotuberculosis och
vissa stammar av Y. enterocolitica har betydelse för sjukdom hos människa. Andra
species isoleras också från kliniskt material och kräver därför identifiering till
speciesnivå. Y. pestis och Y. pseudotuberculosis är så nära besläktade att Y. pestis
föreslagits bli ett subspecies under Y. pseudotuberculosis vilket man dock motsatt
sig av historiska skäl.
Liksom hos andra patogena Yersinia species synes aktuella patogenitetsgener
finnas samlade på virulensplasmider. Vid 37 °C men inte vid 26 utvecklar det s.k.
F1-proteinet ett geleliknande hölje eller kapsel.
Bakterien sprids till människa huvudsakligen genom loppor vilka infekterats när de
sugit blod av infekterade gnagare. När loppans mage är fylld av pestbakterier bildas
en plugg som blockerar strupkanalen. Vid fortsatta angrepp strömmar en del blod
tillbaka, varvid smittan förs vidare. Då det till följd av pestens härjningar börjar bli
ont om råttor flyttar lopporna över sin blodsugande verksamhet till människan.
Y. pestis hänförs till skyddsklass 3 (ASF 1997:12).
Patogenes och patofysiologi
Y. pestis sprider sig från loppbettet till de regionala lymfkörtlarna, förmerar sig och
orsakar svullna smärtsamma varbölder – s.k. buboner. Organismen överlever och
förökar sig intracellulärt i makrofager. Infektionen kan därefter via blodbanan
sprida sig till andra organ, vilket inträffar i ca hälften av fallen med lungpest som
en fruktad variant. De synliga tecknen på att någon drabbats av sekundär septemisk
pest är de svarta fläckar vilka p.g.a. kapillärskador så småningom uppstår på kroppen (”black death”). Bakterien kan också ta sig in genom sår och sprickor i huden
på personer som flår pestsjuka gnagare eller tillreder pestinfekterat kött. I särskilt
olyckliga fall är sjukdomsförloppet så intensivt att bakterierna passerar rakt in i
blodomloppet, angriper inre organ och orsakar dödsfall redan innan bölderna hunnit
visa sig.
Symtom och klinisk bild
Man brukar skilja mellan två huvudformer av sjukdomen, böldpest och lungpest.
Böldpest är den klassiska formen. Patienterna utvecklar feber, huvudvärk, frossa
och svullna extremt ömma lymfkörtlar 2 - 6 dagar efter smittillfället. Gastrointestinala besvär är också vanliga. Sekundär bakteriemi och sepsis är vanlig med
spridning till andra organ. Mest fruktad är lungpest som uppträder i ca 10 % av alla
219
pestfall. Under perioden 1947 - 77 diagnostiserades 10 % av fallen i USA primärt
som septikemi. Sjukdomsbilden liknar i dessa fall annan gramnegativ sepsis.
Obehandlad leder böldpest till döden i 40 – 60 % medan lungpest alltid är dödlig. I
modern tid har mortaliteten i USA varit 14 %.
Epidemiologi
Pestens historia indelas i tre stora pandemier. Den första skall ha härjat mellan år
541 och 544. Den andra pandemin bröt ut någon gång under första hälften av 1300talet och stannade till 17-1800-talen. Digerdöden förknippas med den andra
pandemins allra första utbrott i Europa 1347 - 1352. Den tredje pandemin inträffade
i slutet av 1800-talet och ebbade ut vid tiden för andra världskriget.
Pest är en zoonos som i naturen hålls vid liv genom samspelet mellan loppor och
djur. Den orientaliska råttloppan – Xenopsylla cheopis- är den klassiska vektorn för
pest och svartråttan –Rattus rattus- den viktigaste länken till människa. Flera andra
djurarter såsom ekorre, präriehund och även vanlig katt kan utveckla bakteriemi
och därmed utgöra reservoar för fortsatt spridning. Människan spelar en mycket
underordnad roll i denna process. För att smittan skall föras vidare till människa
krävs en stor sjukdomsvåg bland djur, en s.k. epizooti. Vid lungpest kan
infektionen via aerosoler spridas mellan människor men det snabba sjukdomsförloppet gör att smittspridningen blir begränsad.
Lämpliga klimatologiska förhållanden för permanent endemiska foci finns i Tanzania, Zaire, Uganda, Madagaskar, Vietnam, Kina, Burma, Peru och USA fr.a. i de
sydvästra staterna. En uppmärksammad epidemi inträffade i Indien 1994 med 5 150
fall och 53 dödsfall. Under perioden 1967 - 1993 rapporterades till WHO i
genomsnitt 1 666 fall per år, inget från Västeuropa. Statistiken från USA visar på i
genomsnitt elva fall per år mellan 1984 och 1994.
Det ackumulerade antalet pestrelaterade dödsfall beräknas till 200 miljoner.
Prevention
Om alla smittbärande loppor och råttor kan elimineras är den böldpestsjuke i princip ofarlig för sin omgivning.
Effektiv profylax kan åstadkommas med såväl vaccination som antibiotika, vanligen tetracykliner. Det finns två typer av vaccin, ett levande attenuerat och ett formalinavdödat. Dessa är dock otillräckligt dokumenterade och skyddseffekten är
tveksam. Ett av dem testades på fångar som sedan exponerades varvid ca 50 %
insjuknade.
Provtagning och transport
Hos människa kan pestbakterier isoleras från blod, aspirat från bölder (injicera 1
mL steril koksalt och aspirera omedelbart), skrap från angripen hud, sputum vid
220
pneumoni och likvor vid meningit. Vid obduktion bör material tas från bölder,
lever, mjälte och lunga. Pinnar kan transporteras i vanligt transportmedium.
Laboratoriediagnostik
Allmänt
För laboratoriediagnostik av pest används i första hand odling och serologi. Vid
böldpest är blododling positiv i 80 % av fallen.
Odling av pestbakterier och handläggning av prov med specifik frågeställning skall
ske i BSL3-laboratorium. Laboratoriepersonal måste skyddas mot hudkontakt och
aerosoler.
Referensmetodik
Referenssubstrat
Pestbakterier växer på vanliga icke-selektiva rutindiagnostiska substrat.
Vid odling från kontaminerat material som sputum kan CIN-agar med reducerad
mängd cefsulodin (4 mg/L) användas.
Isolering
sker enligt rutiner som används vid referenslaboratoriet. Inkubering sker vid 35 °C i
sju dagar innan provet rapporteras negativt. Synliga kolonier uppträder efter två
dygn.
Identifiering och minimikriterier
Presumtiv diagnos av Y. pestis kan erhållas med biokemiska test. Kommersiella
testsystem, t.ex. API 20E, kan oftast inte identifiera Y. pestis.
Slutlig verifiering baseras idag på identifiering av specifika virulensgener med PCR
samt sekvensering av 16S-rRNA gener. Fynd skickas till annat laboratorium för
konfirmering.
Vid CDC används lys med en specifik fag för slutlig identifiering.
Alternativ diagnostik
Direktmikroskopi med gramfärgning visar gramnegativa stavar med typisk bipolär
färgning.
Direkt FA kan användas för presumtiv närvaro av pestbakterier. Tillgängliga
reagenser består av antikroppar riktade mot F1- antigenet. Prov som förvarats i
kylskåpstemperatur mer än 30 tim eller odlats vid lägre temperatur än 35 °C är
negativa liksom prov från loppor.
Serologi med F1-proteinet som antigen kan användas för sen verifiering.
Resistensutveckling och resistensbestämning
Positiv erfarenhet av antibiotikabehandling finns för aminoglykosider och tetra221
cykliner. Resistensutveckling är ovanlig.
Epidemiologisk typning utförs ej.
Kvalitetskontroll
Referensstam: Yersinia pestis, ATCC 19428.
Växt på använda substrat kontrolleras regelbundet.
Vid identifiering med PCR används positivt och negativt DNA-templat.
Svarsrutiner
Fynd av Yersinia pestis meddelas insändaren per telefon. Slutsvar lämnas efter
konfirmering vid annat laboratorium.
Laboratorierapportering
Pest är tillsammans med kolera och gula febern de enda kvarvarande karantänsjukdomarna.
Y. pestis är anmälningspliktig enligt Smittskyddslagen allmänfarliga sjukdomar
Grupp 1.2.
REFERENSER:
Harrison, D. Stora Döden. Ordfront 2000.
Perry, R.D., Petherston, J.D. Yersinia pestis – Etiologic agent of plague. Clin Microbiol
Rev. 1997;10:35-66.
222
Anmälningspliktiga sjukdomar
Enligt Smittskyddslagen (SmL 1988:1472 och SOSFS 1997:7) skall
behandlande läkare och läkare vid mikrobiologiska laboratorier anmäla
inträffade fall (diagnos) av vissa smittsamma sjukdomar. Aktuella för det
område som behandlas i denna volym är:
Samhällsfarliga sjukdomar
Difteri
Corynebacterium diphtheriae,
Återfallsfeber
Borrelia recurrentis, Borrelia duttonii,
Mjältbrand
Bacillus anthracis,
Fläcktyfus
Rickettsia prowazekii,
Pest
Yersinia pestis.
Övriga anmälningspliktiga sjukdomar
Haemophilus influenzae typ b, invasiv,
Stafylokocker, meticillinresistenta Staphylocoocus aureus (MRSA),
Pneumokocker med nedsatt känslighet för penicillin (MIC >=0,5 mg/L),
Stelkramp
Clostridium tetani,
Enterokocker, vanko R
E. faecium, E. faecalis (VRE),
Listerios
Listeria monocytogenes,
Tularemi
Francisella tularensis.
Patogener vilka ingår i den frivilliga laboratorierapporteringen
Brucella species,
EHEC andra än O157,
Haemophilus influenzae ej typ b, invasiv,
Streptococcus pneumoniae, invasiv,
Streptococcus pyogenes (GAS), invasiv,
Vibrio species.
223
224