Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Bcl-2 - proteinet som hindrar celler att begå självmord
Veronica Johansson
Människans celler har en inneboende förmåga att begå självmord, så kallad programmerad
celldöd eller apoptos. Om det har blivit ett fel i arvsmassan i en cell kan detta upptäckas och
cellen tvingas att begå självmord. Detta hindrar misstaget från att spridas vidare. I de fall som
misstaget inte upptäcks kan sjukdomar som cancer uppstå. Apoptos är noggrant reglerat så att
det inte ska ske i onödan hos friska celler. Det finns flera olika proteiner i cellen som främjar,
respektive hindrar apoptos. Man kan framkalla programmerad celldöd genom behandling med
vissa ämnen som är giftiga för cellen.
Mitt examensarbete handlar om Bcl-2, ett protein som förhindrar apoptos. I mina
undersökningar användes ett ämne som kallas DENSPM (N1,N11 diethylnorspermin) som
ersätter och blockerar funktionen av vissa ämnen som är viktiga för celldelning. Behandling
av celler med DENSPM leder därför till apoptos. Jag ville undersöka om celler som innehåller
mer Bcl-2 får en lägre grad av apoptos vid tillsats av DENSPM.
För att få fram celler som har högre halt av Bcl-2 använder man så kallad transfektering. Det
betyder att man för in extra kopior av den gen, som uttrycker proteinet man vill ha mer av, i
cellen. Jag använde mig av en metod där man chockar cellerna med en elektrisk stöt. Metoden
kallas elektroporering. En lösning som består av celler och många kopior av den aktuella
genen utsätts för en stöt under en kort stund. Cellernas membran blir för ögonblicket mer
genomsläppligt och vissa av cellerna får in någon kopia av genen. Dessa celler odlades sedan
och utsattes för behandling med DENSPM. Cellerna som undersöktes var bröstcancerceller
som är ovanligt känsliga mot DENSPM. Det var därför intressant att dels ta reda på hur hög
halt av Bcl-2 de aktuella cellerna har i jämförelse med andra celler som inte är lika känsliga
för DENSPM-behandling, dels ta reda på om ökad halt av Bcl-2 kunde minska deras
benägenhet att genomgå apoptos. För att mäta andelen celler i apoptos användes ett
instrument som kallas flödescytometer.
Mina undersökningar visar att bröstcancercellerna som är mycket känsliga för DENSPMbehandling har lägre halt av Bcl-2 i jämförelse med celler som inte genomgår apoptos i lika
stor utsträckning under samma förhållanden. Hög halt av Bcl-2 verkar skydda celler mot
apoptos. Däremot visade det sig att obehandlade celler hade lika stor mängd Bcl-2 som de
behandlade, alltså påverkas inte halten av DENSPM. Cellerna som överuttryckte Bcl-2 visade
sig genomgå apoptos i samma utsträckning som cellerna som hade normal halt av Bcl-2. I
detta fall skyddade inte Bcl-2 mot den programmerade celldöden, vilket skulle kunna bero på
att överuttrycket var för lågt, eller att vi har använt för höga koncentrationer av DENSPM.
Ett av forskargruppens mål är att finna markörer för känslighet mot DENSPM. En slutsats av
detta arbete är att Bcl-2 inte är en optimal markör.
Swedish official title: Effekten av att överuttrycka Bcl-2 på den apoptosinducerande effekten
av N1,N11dietylnorspermin på den humana bröstcancercellinjen L56Br-C1
Swedish credits: 20p
Supervisor: Stina Oredsson, Department of Cell and Organism Biology
Submission date/time: 8/28/2003
Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
The effect of overexpressing Bcl-2 on the apoptosis inducing effect of
N1,N11diethylnorspermine on L56Br-C1 human breast cancer cells
Veronica Johansson
Biology, Pharmacology
Autumn 2002
Abstract in English
N1,N11 Diethylnorspermine (DENSPM) is a spermine analogue that depletes cells of
polyamines by inducing their catabolism and inhibiting their biosynthesis. The human breast
cancer cell line L56Br-C1 is extremely sensitive to treatment with DENSPM. DENSPM
treatment of L56Br-C1 cells induces apoptosis through the mitochondrial death pathway. Bcl2 is known to be involved in the regulation of the mitochondrial pathway of apoptosis. The
mechanism is not fully elucidated, but it is clear that Bcl-2 inhibits apoptosis. The aim of the
investigation was to find out whether overexpression of Bcl-2 could protect the cells against
DENSPM-induced apoptosis. Overexpression of Bcl-2 was achieved by stably transfecting
the cells with an expression vector containing Bcl-2. The controls were transfected with
empty vectors. To confirm overexpression, the cells were screened for Bcl-2 by Western blot.
The cells were treated with 10 µM DENSPM and apoptosis was evaluated by flow cytometry.
The results show that overexpression of Bcl-2 in L56Br-C1 does not protect the cells from the
apoptosis inducing effect of DENSPM. A number of different breast cancer cell lines were
also screened for normal Bcl-2 expression and the effect of DENSPM treatment was
investigated. DENSPM treatment did not affect the Bcl 2 level. There may however be a
slight correlation between the level of Bcl-2 and sensitivity to DENSPM.
Abstract in Swedish
Effekten av att överuttrycka Bcl-2 på den apoptosinducerande effekten
av N1,N11dietylnorspermin på den humana bröstcancercellinjen L56BrC1
N1,N11 Diethylnorspermin (DENSPM) är en sperminanalog som tömmer cellerna på
polyaminer genom att inducera katabolism och inhibera biosyntes av polyaminer. Den
humana bröstcancercellinjen L56Br-C1 är ovanligt känslig för behandling med DENSPM.
DENSPM-behandling av L56Br-C1 celler inducerar apoptos genom den mitokondriella
vägen. Det är känt att Bcl-2 är involverat i regleringen av apoptos som induceras genom den
mitokondriella vägen. Mekanismen är inte till fullo känd, med det står klart att Bcl-2 inhiberar
apoptos. Syftet med undersökningen var att ta reda på huruvida överuttryck av Bcl-2 kan
hämma DENSPM-inducerad apoptos. Överuttryck av Bcl-2 åstadkoms genom stabil
transfektion av cellerna med en expressionsvektor som innehåller Bcl-2. Kontrollerna
transfekterades med en tom vektor. För att bekräfta uttryck analyserades cellerna för Bcl-2
med hjälp av western blot. Cellerna behandlades med 10 µM DENSPM och apoptos
utvärderades med hjälp av flödescytometri. Resultaten visar att överuttryck av Bcl-2 i L56BrC1 inte skyddar cellerna mot den apoptosinducerande effekten av DENSPM. Ett antal olika
bröstcancercellinjer analyserades med avseende på normalt Bcl-2 uttryck och effekten av
DENSPM undersöktes. DENSPM-behandling påverkade inte nivåerna av Bcl-2. Det kan dock
finnas ett visst samband mellan den normala nivån av Bcl-2 och känslighet mot DENSPM.
