Generation of a recombinant DNA molecule
Genteknik och molekylärbiologi
Föreläsning 4
Rekombinant DNA
Recombinant DNA
Plasmid preparation
• Recombinant DNA technology provided
scientists with the ability to isolate,
sequence, and manipulate individual genes
from any type of cell.
• It has enabled detailed molecular studies of
the structure and function of eukaryotic
genes and genomes, and revolutionized our
understanding of cell biology.
Figure 8-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Transfer of genetic information by DNA
Molekylärbiologiska verktygslådan
• Enzymer
-restriktionsenzymer
-ligaser
-DNA-polymeraser
-omvänt transkriptas (RT)
-kinaser
-polynukleotidtransferaser
-fosfataser
• PCR
• Transformering
• In vitro mutagenes-heat-shock
-elektroporering
• Vektorer
-partikelbombardemang
-plasmider
-fager (M13, λ)
-cosmider
-YACs
• Oligonukleotidsyntes -virus
• Värdceller
-primers
-prober
-bakterier
-gene assembly
-jäst/svampar
-växtceller
• DNA sekvenering
-insektsceller
-Maxam-Gilbert
-mammalieceller
-Sanger
-pyrosekvenering
-mikroinjektion
-transfektering
• Selektionsmetoder
-antibiotika resistens
-genetisk komplementering
• Screeningmetoder
-genotypisk
-fenotypisk
1
Molekylärbiologiska verktygslådan
• Enzymer
-restriktionsenzymer
-ligaser
-DNA-polymeraser
-omvänt transkriptas (RT)
-kinaser
-polynukleotidtransferaser
-fosfataser
• PCR
• Transformering
• In vitro mutagenes-heat-shock
-elektroporering
• Vektorer
-partikelbombardemang
-plasmider
-fager (M13, λ)
-cosmider
-YACs
• Oligonukleotidsyntes -virus
• Värdceller
-primers
-prober
-bakterier
-gene assembly
-jäst/svampar
-växtceller
• DNA sekvenering
-insektsceller
-Maxam-Gilbert
-mammalieceller
-Sanger
-pyrosekvenering
Kloning - Expression
Enzymer
-mikroinjektion
-transfektering
• Selektionsmetoder
-antibiotika resistens
-genetisk komplementering
• Screeningmetoder
-genotypisk
-fenotypisk
Restriktionsenzymer
Recognition sites of common RE
• Specifika DNA-sekvenser (4-8bp) känns igen och klyvs av restriktionsenzymer (RE)
• Igenkänningssekvensen (RS) är ofta en palindrom, d v s kan läsas från båda håll
• Utgör skydd mot främmande inkommande DNA. Finns > 100-tal olika RE
• Specifika metylaser metylerar baser i RS varmed bakteriens eget DNA skyddas från
klyvning
EcoRV
EcoRI
PstI
GATATC
CTATAG
GAATTC
CTTAAG
CTGCAG
GACGTC
GAT
CTA
ATC
TAG
”blunt end”
G
AATTC
CTGCA
G
G
G
ACGTC
CTTAA
”sticky ends”
Restriction map
Restriction maps of λ and adenovirus DNAs
EcoRI recognizes the sequence GAATTC.
This sequence is present at five sites in DNA of the bacteriophage λ, so EcoRI digests λ DNA into six
fragments ranging from 3.6 to 21.2 kilobases long.
• For larger DNA molecules such as cellular genomes, restriction
endonuclease digestion alone does not provide sufficient resolution.
• For example, the human genome would yield more than 500,000 EcoRI
fragments.
2
Restriktionsenzymer
Restriktionsenzymer
Ligaser
Ligase reaction
• Ligaser återskapar fosfodiesterbindningar genom att 5’-fosfatgruppen förenas
med fria 3’-hydroxylgruppen. Ett vanligt använt ligas är T4-DNAligas.
• Ligaser används för att ”klistra ihop” DNA-fragment med varandra.
G-OH P-GATCC
CCTAG-P HO-G
+ T4-DNAligas, ATP
GGATCC
CCTAGG
kan återklyvas med BamHI
(5’-GˇGATCC-3’)
G-OH P-GATCT
CCTAG-P HO-A
+ T4-DNAligas, ATP
G GATCT
CCTAG A
kan ej återklyvas med BamHI
(5’-GˇGATCC-3’)
DNA-polymeraser
Reverse transcription and retrovirus replication
• DNA-polymeraser inkorporerar deoxynukleotider (dNTPs) till en
växande DNA-kedja genom att addera dessa dNTPs till den fria 3’OH-gruppen på kedjan med motstående DNA-sträng som templat.
Några vanligt använda polymeraser är DNA-polymeras I samt T7DNA polymeras.
• De används bl a för att:
-generera blunt-ends
-vid sekvensreaktioner
G
CCATG
+ dNTPs, polymeras
GGTAC
CCATG
3
Omvänt transkriptas (RT)
• Omvänt transkriptas (RT) syntetiserar en komplementär DNAsträng utifrån ett RNA-templat. Retrovirus (ex HIV) använder
denna mekanism för att göra en DNA-kopia av sitt RNA-genom.
• Tekniskt användningsområde:
-utnyttjas i ett steg då man vill göra cDNA.
Terminaltransferas
• Terminaltransferas adderar nukleotider till 3’-änden av DNAkedjor.
• De används bl a för att generera kohesiva ändar från blunt-end
fragment och vid cDNA-syntes.
5’
mRNA 5’Cap
dATP
AAAAA 3’
TTTTT 5’
omvänt transkriptas
+ dNTPs
terminaltransferas
• Fosfataser tar bort fria 5’-fosfatgrupper från DNA
-används för att minimera bakgrundsligering av självligerad vektor
vid kloningsförsök
-vanliga fosfataser är shrimp- samt bovine alkaline phosphatase
3’
HO-TT…TT
5’
ligering
AAAAA 3’
TTTTT 5’
Fosfataser och kinaser
5’
dTTP
AA…AA-OH
5’
3’
mRNA 5’Cap
cDNA
3’
3’
+
3’
5’
AA…AA
3’
3’
TT…TT
5’
Kloning - Expression
Vektorer
• Kinaser adderar fosfatgrupper till 5’ änden av DNA
-används för att fosforylera syntetiskt DNA (ex linkers) före
ligering till vektor
-polynukleotidkinas (PNK)
Önskvärda egenskaper hos kloningsvektorer
Plasmider
• Plasmider är cirkulärt extrakromosomalt DNA
• små
• enkelt att flytta mellan olika organismer
• enkelt att isolera från värdorganismen
• De används som vektorer = bärare av främmande DNA
-utnyttjas för detta ändamål vid kloning och proteinexpression
-insert ≤ 5 kb
• flera unika RE lokaliserade till en specifik region
• Plasmidvektorer innehåller generellt:
-ori (origin of replication)
-gen/er för selektion (ofta antibiotikaresistens)
-multikloningssite
-ibland gen för screening (t ex lacZ för blå-vit screening)
• metod för detektion av närvaro av inklonat DNA
• Olika typer av plasmidvektorer har olika ”copy nr”
• enkelt att detektera och selektera
• multipla kopior (ofta fördelaktigt)
• Plasmider tillhör olika inkompatibilitetsgrupper. Två olika
vektorer tillhörande samma inkompatibilitetsgrupp kan ej
propageras samtidigt i en och samma värdcell.
4
Bakteriofag λ
Bacteriophage λ-life cycle
Figure 5-78 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Bakteriofag λ
In vitro packaging:bacteriophage λ
• Bakteriofag λ är ett virus som infekterar bakterier (E. coli).
-de kan ha en lytisk och en lysogen fas.
-de har ett genom om ca 45 kb, varav en central region,
omfattande ca 15 kb, ej behövs för dess replikation.
-i vardera ände av genomet finns enkelsträngade komplementära
kohesiva ändar (COS-sites). Dessa utnyttjar fagen för att göra
konkatamerer av sitt genom inför packning i fagpartiklar.
• λ-genomet har modifierats så att det passar som vektor. Bl a har
unika sites introducerat på vardera sida om den centrala regionen,
vilka kan utnyttjas för att ersätta denna med främmande DNA.
-insert måste ha en storlek om ca 15 kb, annars kan infektiösa
fagpartiklar ej packas.
• λ används för kloning av genomiska fragment, eftersom
plasmider inte lämpar sig som bärare av större fragment.
Biotechnology: Applying the genetic revolution, Figure 3.17
Cosmider
Yeast artificial chromosome (YAC)
• Cosmider är hybrider av plasmider och λ fager. De innehåller:
-ori
-gen för antibiotikaresistens (ex Tet)
-cos-sites
-kloningsites
• YACs innehåller:
-autonomously replicating sequence (ARS) från jästkromosom
-centromer (CEN), vilken bidrar till stabil fördelning av YACs
mellan moder- och dotterceller
-två telomerer, vilka fungerar som kromosomändar och därmed
möjliggör replikation av YACs i form av små linjära kromosomer.
-selekterbara markörgener, ex LEU2 vilken komplementerar Leunegativa stammar.
-kloningsites
• Cosmider utnyttjas för kloning av genomiskt DNA när större
fragment än 15 kb används (gränsen för vad lambda kan
härbärgera). De kan bära ca 45 kb insert.
cos
vektor DNA (cosmid)
• YACs används för kloning av mkt stora genomiska DNAfragment (100-2000 kb)
telomer
antibiotika-resistens
gen
genomiskt DNA
LEU2
ARS
CEN
jäst DNA
telomer
50 kb
5
Various cloning vectors
Vectors for cloning large DNA-fragments
Biotechnology: Applying the genetic
revolution, Figure 3.16
Värdceller
Kloning - Expression
Värdceller
Olika vektorer används för att introducera rekombinant
DNA i olika typer av värdceller, t ex:
• Bakterier
•
•
•
•
Kloning - Expression
Jäst
Insektsceller
Däggdjursceller
Växtceller
- E. coli är vanligast
- Höga expressionsnivåer
- Möjlighet till storskalig produktion.
Eukaryota celler
Post-translationella modifieringar
(t ex glykosylering) möjliga
Heat shock transformation
Transformationsmetoder
Biotechnology: Applying the genetic revolution, Figure 3.18
6
Electroporation
Kloning - Expression
Selektionsmetoder
Acta Physiol Scand. 2003 Apr;177(4):437-47
Issuses to consider:
1. Cell size
2. Temperature
3. Post-pulse manipulation
4. Composition of electrodes and pulsing medium
Antibiotika-resistens
Kloning - Expression
Vanliga antibiotika inom molekylärbiologi:
-
ampicillin
carbenicillin
kloramfenikol
tetracyklin
kanamycin
Transformera bakterier
med ligerad plasmid
Klonad gen
Inhiberar syntes av cellväggen
Inhiberar proteinsyntes
Sprid ut bakterierna och
låt växa på agar-platta med
antibiotika
Gen för
antibiotikaresistens
Plasmid
Screeningmetoder
Endast bakterier som tagit upp
plasmid med antibiotika-resistens
överlever och ger upphov till
kolonier
Genotypisk screening
• Probhybridisering
– känd nukleotidsekvens
• 15 nukleotiders prob
– okänd nukleotidsekvens
• guessmer, ca 50 nukleotider (unik)
Längre pga risk för mismatch
• degenererad prob, ca 18 nukleotider
baserad på aa-sekvens (6 st)
Fenotypisk screening
• Aktivitets-screening
– ex. proteasaktivitet (subtilisin)
• odling på kasein-medium
• klart område runt koloni
• Immunoscreening
– antikropp mot proteinet
7
Blå-vit screening
Kloning - Expression
EcoRI site
LacZ
AmpR
Kloning av ett fragment i EcoRI
sitet förstör LacZ, som kodar för
enzymet β-galaktosidas
- endast bakterier som har tagit upp
plasmid är resistenta mot ampicillin
och kan växa
Transformera bakterier och
odla på agar-plattor med
ampicillin och X-gal
- bakterier utan klonat fragment har
funktionellt β-galaktosidas och bildar
en blå produkt av substratet X-gal
H
N
OH
OH
H
OH
O
O
Cl
H
H
OH
- bakterier med klonat fragment
saknar funktionellt β-galaktosidas och
bildar vita kolonier
Br
H
H
Exempel på
kloning
X-gal
Kloning prokaryot gen
• Exempel: Subtilisin
•
•
•
•
från Bacillus subtilis
proteas
storlek ca 1000 bp
används i tvättmedel
Skapa genbibliotek
BamHI
EcoRI
BamHI
Bakteriell plasmid
GATCC
G
G TAG
CC
G
CTTAA
C
TT G
AA
skapa genbibliotek (genomiskt DNA)
selektion och genotypisk screening
fenotypisk screening
sekvensverifiering
expressionsvektor
aktivitetsstudier/protein engineering
EcoRI
Kromosom
• Delmoment
•
•
•
•
•
•
EcoRI
DNA-ligas
Transformation av bakterier
Genbibliotek
Screening a recombinant library by hybridization
• Kromosom klyvs med 4-klippare
• (4x4x4x4=256 bp) [Ex. Sau3AI, ^GATC^]
• Partiell klyvning
– Större slumpmässigt klyvda fragment (~2500 bp)
• Plasmid klyvs med 6-klippare
• Matchande överlap [Ex. BamHI, G^GATC^C]
• Ligering (Fosfatas-behandlad plasmid)
• Transformering (CaCl2, Elektroporering)
• Selektion
• Kolonier med rekombinant plasmid
8
Kloning eukaryot gen
• Oftast mRNA som utgångsmaterial
• Delmoment
• Skapa genbibliotek
– mRNA rening
– cDNA syntes (S1-metoden, RNasH-metoden)
– Ligering i vektor (fager eller plasmider)
•
•
•
•
•
Selektion och genotypisk screening
Fenotypisk screening
Sekvensverifiering
Expressionsvektor (val av värd!)
Aktivitetsstudier/protein engineering
9
