Laboration 4-11 - UU Studentportalen

Laborationer i Cell- och molekylärbiologi
Lab 1-4
Biomedicinprogrammet,
termin 2
VT 2014
2
Innehållsförteckning
Ordnings- och säkerhetsföreskrifter
4
1: Odling av bakterier
5
2: Polymerase Chain Reaction (PCR)
10
3: Kloning av DNA
25
4: Sekvensering och bioinformatik
38
3
Ordnings- och säkerhetsföreskrifter
1. På laboratoriet skall skyddsrock användas. Använd skyddsglasögon vid risk för
stänk.
2. Rökning, ätande eller dylikt får inte förekomma på laboratoriet. Gäller även
snusning.
3. Handtvättning skall ske innan laboratoriet lämnas.
4. Före och efter arbetet torkas bänken av med fuktat papper samt spritas.
5. Betrakta använt material som potentiell smittorisk. Behandla
laboratoriebakterierna som om de vore sjukdomsframkallande (patogena). Vid
spill av bakterier torka torrt med papper och tvätta sedan med sprit.
6. Smittförande avfall (dvs. bakterier och eukaryota celler) kastas i där för avsedda
riskkartonger (GUL märkning). Trasigt glas samt stickande avfall läggs i lämplig
burk och kastas i riskkartonger (BLÅ märkning). Kemiskt eller radioaktivt avfall
placeras i där för avsedda behållare. Annat avfall kastas i papperskorgarna.
7. Tag bort märkning från använt glasmaterial och skölj i vatten.
8. Använd endast brännare för att bränna av bakterieöglor. Inte för värmning av
lösningar och buffertar.
9. Gör dig bekant med brand- och räddningsutrustning som finns vid/i laboratoriet.
10. Informera dig om användandet av ev. hälsovådliga ämnen i laborationerna.
11. Innan du går hem för dagen, kontrollera att vattenbad, skakar och gaslågor är
avstängda.
12. Varje person i gruppen skall föra journal över laborationsarbetet.
Arbetet på laboratorium samt arbetet med gemodifierade organismer (GMO) är
reglerat enligt svensk och europeisk lagstiftning. Vi hänvisar bl.a. till
Arbetarskyddsstyrelsens författningssamling AFS1997:10 ”Laboratoriearbete med
kemikalier” samt AFS 2000:5 ”Innesluten användning av genetiskt modifierade
mikroorganismer”. Riskbedömning av arbetet samt skadeförebyggande åtgärder
skall genomföras innan arbetet påbörjas. Vid frågor eller oklarheter kring arbetets
risker skall du tala med labamanuenserna.
4
Laboration 1: Odling av bakterier
Dag 1:
Dag 2:




Gjuta agarplattor
Göra spädningsserie av en bakteriekoloni
Sprida bakterier på platta (renstryck och rackling)
Räkna bakteriekolonier på plattor
Teori
Odling och hantering av bakterier är grundläggande för all molekylärbiologisk
metodologi. En av de vanligaste bakterierna som används på labb är Escherichia coli
(E. coli). E. coli växer bra i flytande kultur (rör eller så kallad batch-kultur) eller på
agarplattor. Flytande kulturer bör odlas under skakning. Bakterierna kan växas i
olika typer av näringslösning eller så kallat medium. De flesta medier innehåller
extrakt av döda jäst- och/eller bakterieceller (trypton/peptone). Olika tillsatser som
exempelvis antibiotika (ampicillin eller kanamycin) är vanligt förekommande.
Bakterier som växer på platta bildar kolonier (kolonier ser ut som små
prickar). En koloni härstammar från en enskild bakterie som delat sig och gett
upphov till ”kloner” av sig själv. Enskilda kolonier, ”kloner”, kan sedan plockas för
vidare bruk. Det finns olika sätt att få enskilda kolonier. Två metoder att
åstadkomma separata kolonier exemplifieras i laborationen: Renstrykning av
bakterie på agarplatta samt spridning med glaskulor /rackling på agarplatta.
Särskilda instruktioner
Momenten utförs individuellt av samtliga gruppmedlemmar.
Betrakta bakterier som potentiellt patogena. Börja därför med att studera de
allmänna instruktionerna för arbete med bakterier och smittfarligt material.
Handskar behöver inte användas, men handtvätt efter labben är obligatorisk.
Laborationsrapport
-
Rapporten lämnas in gruppvis men de enskilda resultaten redovisas, i
tabellform där det är möjligt.
Förklara enkelt teorin bakom bakterieodling: mediuminnehåll och spridning
av bakterier.
Beskriv kortfattat resultatet av renstrykningen i en figur.
Ange hur många kolonier det fanns på respektive spädning/platta.
Ange hur många bakterier det fanns i den plockade kolonin och beskriv hur
beräkningen av antalet bakterier i kolonin gått till.
Glöm inte skriva namn och gruppnummer på rapporten!
5
Dag 1: Gjuta plattor, sprida bakterier
Gjuta agarplattor
Laborationen börjar med preparation av TYE-bakteriemedium samt TYE-agarplattor.
Alla grupper skall tillverka TYE-agar, men endast en grupp per labb gör flytande
TYE-medium till resten av kursen. Denna grupp utses av labhandledare.
Beräkna volymen bakteriemedium samt antalet agarplattor som behövs under hela
laborationsblocket (Lab 1 och 3). Notera om plattorna skall innehålla ev. tillsatser
som antibiotika. Lägg till en liten säkerhetsmarginal om en eller annan platta skulle
förolyckas. Räkna med 15 ml agarmedium per 9 cm-platta.
Gör medium/agar i autoklaverbara Schott-flaskor med skruvlock. Vid tillverkning av
agar är det viktigt att inte fylla mycket mer än halva flaskan (~0,6 l) inför
autoklaveringen. Använd flera flaskor om det är nödvändigt.
Material
- Plastpetriskålar: färglösa samt röda
- Ampicillin (stocklösning 100 mg/ml); slutkoncentration i agar: 100 µg/ml
- Autoklaverbara 1l Schott-flaskor
- dH20 (destillerat H2O)
TYE-agar
NaCl 8 g/l
Peptone 10 g/l
Jäst extrakt 5 g/l
Agar 15 g/l
TYE-medium (en grupp gör detta till hela kursen)
NaCl 8 g/l
Peptone 10 g/l
Jäst extrakt 5 g/l
Väg upp kemikalier och fyll upp med destillerat vatten (ur ljusgrön vattenkran på
lab) till rätt volym (använd mätkolv). Agarn kommer inte att lösa sig på egen hand
utan måste smältas. Därför skall lösningarna autoklaveras, vilket även steriliserar
lösningen (dvs. dödar ev. bakteriekontamination). Drag inte åt locken under
autoklaveringen pga. det ökade trycket. Autoklav finns på labbet och lösningarna
autoklaveras gemensamt av handledare.
- Under tiden agarn autoklaveras utförs första momentet på lab 2.
Låt agarn svalna något innan plattorna ska tillverkas. Häll agar till markeringen i
färglösa petriskålar för agar utan tillsatser, samt i röda skålar för agar innehållandes
ampicillin. Ev. bubblor tas bort med hjälp av glödgad platinaögla eller punkteras
med en pipettespets. Gjut först plattor utan ampicillin, tillsätt därefter ampicillin
(slutkoncentration 100 µg/ml) till resten av innehållet i flaskan (uppskatta volymen).
OBS! Tillsätt ampicillinet först då agarn svalnat så att det går att ta i flaskan (ca
50C) eftersom det är värmekänsligt. Jobba relativt fort och håll agarflaskan i rörelse
så att inte agarn svalnar och börjar stelna utmed kanterna (sker vid 38°C).
Lägg locket på glänt medan agarn svalnar för att undvika rinnande kondens. Var
noga med att sedan lägga på locket och lämna plattorna inte öppna i onödan då de
lätt kan kontamineras av bakterier i luften. Förvara de stelnade plattorna upp och ner
för att undvika att de torkar ut och för att samla eventuell kondens i locket och inte
på agarytan.
6
Beräkna antalet bakterier i en koloni
Material (per person):
- 1 st platinaögla samt brännare
- 5 st sterila 1,5 ml Eppendorfrör
- Skruvlocksrör med sterilt TYE-medium
- Rör med sterila 3mm glaskulor
- 4 st TYE-agarplattor utan ampicillin (ofärgad petriskål)
- Agarplatta med bakteriekolonier
Hantering och inkubering av sterila agarplattor: plattor skall alltid hanteras upp och
ned när locket är på. Ev. kondens kommer då att hamna i locket och inte på agarytan
och kondensen kan då hällas av.
Från amanuenserna får ni en platta med bakteriekolonier. En stor koloni plockas med
platinaögla eller pipettspets och förs till ett Eppendorfrör som gjorts i ordning i
förväg med 1 ml TYE medium. Se till att hela kolonin kommer med.
Märk röret ”0”, förslut röret och blanda noggrant under någon minut.
En spädningsserie görs på innehållet i röret: 1:100, 1:1000, 1:10 000 samt 1:100 000
enligt figuren nedan. Byt spetsar på pipetten mellan varje rör! Pipettera upp 990µl
TYE- medium till ett Eppendorfrör märkt ”1”. Pipettera upp 900µl TYE- medium till
3 stycken Eppendorfrör märkta ”2 - 4”. Pipettera sedan 10µl från rör ”0” till rör ”1”,
förslut röret, skaka och pipettera 100µl från rör ”1” till ”2”. Fortsätt spädningsserien
med att pipettera 100µl från rör ”2” till rör ”3” osv. Var noga med att blanda om
rören efter varje steg.
Blanda rören igen och pipettera 100µl av resp. spädning (rör ”1-4”) till märkta
agarplattor som försetts med 5-10 sterila glaskulor. Locket sättes på och plattorna
med respektive spädning snurras runt (racklas) så att bakterierna fördelas jämt över
agarytan i plattan med hjälp av glaskulorna. Glaskulorna hälles sedan ut i
uppsamlings-bägare innehållande desinfektionsmedel. Plattorna inkuberas upp och
ner i 37°C över natt.
100µl
1 koloni
100µl
100µl
10µl
0
1
2
100µl
7
3
4
Renstrykningsövning
Material:
- 1 platinaögla och brännare
- TYE- agarplattor utan tillsatser (ofärgad petriskål, 1 per person)
- 1 rör med bakterier (från amanuenserna)
Märk upp en ofärgad TYE-agarplatta med namn, gruppnummer och
laborationsnummer i botten längs kanten. Agarplattor skall alltid märkas på botten
eller på sidan och inte på locket för undvika att skålarna förväxlas. I just denna lab är
det viktigt att ni märker skålarna på sidan av botten-skålen, för att ni senare ska
kunna se och räkna kolonierna genom att titta på undersidan av plattan.
Placera den märkta plattan upp och ned på bänken. Sterilisera platinaöglan genom
att bränna av den i öppen låga, tills den glöder fullständigt. Lyft upp plattan utan
lock (låt locket ligga på bordet) och kyl av öglan i agarn i kanten på plattan. Kyler
man inte av öglan på detta sätt innan man doppar den i bakteriekulturen kommer
bakterierna att dö. Lägg tillbaka plattan i locket.
Doppa öglan i bakteriekulturen, sätt tillbaka locket och ställ ifrån dig röret. Fatta
plattan igen och gör ett utstryk på ytan av agarn (enligt figuren nedan ”område 1”).
Ytan skall ej repas.
Öglan bränns av på nytt tills den glöder och kyls på liknande sätt. Ett andra stryk
utan att doppa öglan i kulturen görs vinkelrätt mot det första (se figuren ”område
2”). Öglan bränns av och kyls och ett tredje stryk görs vinkelrätt mot det andra på
liknande sätt (”område 3”). Varje person i gruppen skall göra en renstrykning som
placeras i 37°C inkubator över natt.
1
2
3
8
Dag 2: Räkna bakteriekolonier
Beräkna antalet bakterier i en koloni, fortsättning
Material:
- Dina agarplattor med spädningsserien och renstrykningen.
- En vattenfast tuschpenna med fin spets.
Kontrollera dina agarplattor med bakterier. Räkna antalet bakterier på respektive
platta i spädningsserien. Använd en tuschpenna och sätt en punkt för varje räknad
koloni på undersidan av plattan. Dela in plattan i sektorer vid stort antal kolonier.
Notera om antalet kolonier (bakterier) stämmer överens med spädningarna (faktor
10 mellan plattorna). Om det är omöjligt att räkna någon platta, försök uppskatta
antalet bakteriekolonier.
Varje person i gruppen ska beräkna antalet bakterier i sin ursprungskoloni. Utgå
ifrån den spädning som gav 100 - 500 kolonier på en platta. Beakta spädningsfaktor
och volym som tillsattes på plattan.
Studera även plattan med renstrykningen. Finns det enskilda kolonier som man
skulle kunna plocka? Var bakteriekulturen ren eller kan bakterier med olika
koloniutseende urskiljas? Ser din platta likadan ut som dina bänkgrannars?
9
Laboration 2: Polymerase Chain Reaction (PCR)
Dag 1:
Dag 2:
Dag 3:
Själva:







Lysera levervävnad
Preparera genomiskt DNA
Mäta DNA-koncentration (spektrofotometri)
Blanda PCR-reagenser, köra PCR
Gjuta agarosgel
Köra ut PCR-reaktionen på gel
Designa primers
Teori
Polymerase chain reaction (PCR) är kanske den enskilt viktigaste molekylärbiologiska metoden och används inom ett stort antal applikationer från isolering av
nya gener till klinisk diagnostik. Styrkan i metoden är dess oerhörda känslighet och
att det är möjligt att amplifiera (mångfaldiga) DNA med utgångspunkt t.o.m. från
enstaka DNA-molekyler. I denna laboration kommer ni designa PCR-primers för att
sedan amplifiera ett specifikt DNA-fragment från hela kycklinggenomet med hjälp
av PCR. Ni kommer att bekräfta att ni har amplifierat ett DNA-fragment av rätt
storlek med hjälp av agarosgelelektrofores.
Särskilda instruktioner
Momenten utförs i grupper om 2-3 personer.
Handskar måste användas när ni jobbar med PCRen för att inte kontaminera
proverna eller reagensen.
Taq-polymeraset får inte värmas upp och måste hela tiden förvaras i frysblocket.
Laborationsrapport
Rapporten lämnas in gruppvis.
Besvara de specifika frågorna som står i slutet och beskriv även i korta ordalag vilka
resultat ni fick. Om ni fick avvikande och/eller felaktiga resultat ska ni göra en
felanalys där ni anger troliga förklaringar till varför ni fick dessa.
10
Dag 1: Lysering av kycklinglever
Lysera kycklinglever
Denna del av lab 2 utförs samtidigt med lab 1. Frusen lever tinas i
lyseringsbuffert innehållande Proteinas K. Proven inkuberas vid 55°C och vävnaden
bearbetas mekaniskt varvid vävnaden bryts ner och det genomiska DNAt frisätts.
Material:
-
Eppendorfrör
Rör med frusen levervävnad från kycklingembryo
Lyseringsbuffert1
Proteinas K, 10 mg/ml
Värmeblock, 55°C
Utförande:
1. 500µl lyseringsbuffert pipetteras till ett Eppendorfrör med en bit frusen
vävnad från kycklingembryo.
2. 2,5µl Proteinas K pipetteras till röret och lösningen blandas.
3. Röret inkuberas i värmeblock vid 55°C över natt. (Proverna blandas
ytterligare några gånger av labhandledare).
1
Lyseringsbufferten innehåller:
- 100 mM Tris-HCL, pH 8.5
- 5 mM EDTA
- 0,2% SodiumDodecylSulphate (SDS)
- 200 mM NaCl
11
Dag 2: Preparera DNA och PCR-körning
Preparera genomiskt DNA
DNAt ifrån den lyserade kycklinglevern fälls ut till ett salt genom etanol och
centrifugeras ned med hjälp av en mikrocentrifug. DNAt löses upp i vatten och en
del används för att mäta DNA-koncentrationen.
Material:
- Eppendorfrör
- Värmeblock, 55°C
- Etanol 99,5%, kall, förvaras i –20C frys.
- Etanol 70%, kall, förvaras i –20C frys.
- dH2O
Om vävnaden inte är helt upplöst:
1. Använd en 1000µl-pipett och pipettera innehållet i röret långsamt upp och
ned tills vävnadsbiten är uppluckrad. Inkubera sedan i ytterligare 10 minuter
vid 55°C. Lösningen bör vara något viskös och börja klarna.
Om vävnaden är helt upplöst, fortsätt här:
2. Centrifugera röret i mikrocentrifug i 5 min. 10 000 rpm. (10K) för att bli av
med olösligt material.
3. För över 400µl av supernatanten till nytt ett rör (undvik att få med något av
pelleten)
4. Tillsätt försiktigt 800µl kall 99.5% etanol och vänd röret långsamt. En liten
tuss av vitt DNA skall falla ut i interfasen mellan etanol och vattenfas. Vänd
röret helt upprepade gånger.
5. Centrifugera ner DNAt i mikrocentrifug 5 minuter, 10K (Med gångjärnet
uppåt så att du vet var pelletten hamnar - Eppendorfrör skall alltid sättas i
rotorn på detta sätt). Sug försiktigt bort supernatanten med en pipett.
6. Tillsätt 1ml 70% etanol för att tvätta pelleten och vortexa (löser inte alltid upp
sig). Centrifugera 30 sek. 10K (med samma orientering på röret). Sug
försiktigt bort lösningen.
7. Låt provet lufttorka (röret kan ställas upp och ned) i 10-15 minuter. Lös upp
pelleten i 100l dH2O.
8. För att lösa DNAt sätt det i 55°C värmeblock ca 20 minuter. Blanda om DNAt
med jämna mellanrum genom att slå försiktigt på röret med fingret.
9. Centrifugera i 5 minuter 10K för att spinna ner olöst material och för över
supernatanten i ett nytt Eppendorfrör som märks tydligt med gruppnummer
och innehåll.
12
Spektroskopisk kvantifiera genomiskt DNA
Ett spektrum tas på DNA-lösningen och koncentrationen beräknas med
utgångspunkt från absorbansen vid 260nm. DNAt används sedan som templat i
PCR-reaktionen.
Material:
- Spektrofotometer (Nano-Drop)
- dH20
- Eppendorfrör
- Prov med genomiskt DNA från punkt 9 ovan.
Utförande:
1. Späd en del av DNA-provet i ett Eppendorfrör (1:10). Tag 5µl DNA till 45µl
dH20.
2. Mät både ert spädda prov och ursprungsprovet i Nano-Drop:en och notera
absorbansen vid 260 och 280 nm. Vid behov kan ni späda provet ytterligare.
3. Beräkna DNA-koncentrationen med hjälp av Lambert-Beer's Lag2. Notera
DNA-koncentrationen och beräkna vilken volym som behövs för att ta 1µg
DNA. Använd det utspädda DNAt som templat för PCR-reaktionen.
4. Beräkna den totala mängden DNA ni fått vid preparationen.
Absorbans vid 260nm (spädning):
Absorbans vid 280nm (spädning):
Ratio 260/280:
Beräknad DNA koncentration (spädning):
Beräknad DNA koncentration (prov):
Volym som krävs för 1µg DNA från spädning:
Lambert-Beer lag: A= x l x c
A: absorbans
: extinktionskoefficient (0,02 ml µg-1cm-1)
l: kyvettlängd (cm) = 1 (obs! kyvettlängden är omräknad jämfört med Nano-Drop)
c: koncentration (µg/ml).
2
13
PCR-amplifiering från genomiskt DNA
Genomiskt DNA från tidigare moment används som templat för att amplifiera ett
DNA-fragment med hjälp av två specifika primers. PCR-reaktionen blandas ihop och
PCR-maskinen körs övernatt. För enkelhetens skull har en PCR-mix gjorts i ordning
innehållande buffert, dNTP, MgCl2 samt primers. En negativ kontroll skall köras
parallellt med provet. Den negativa kontrollen innehåller allt utom DNA-templaten
(det genomiska DNAt).
Material:
- PCR-rör
- dH20
- Templat: genomiskt DNA från tidigare moment
- Taq DNA polymerase (AmpliTaqGold 2,5units/µl)
- PCR mix3 (2.5x stocklösning)
OBS! När ni sätter upp PCR-reaktionen ska ni ha handskar för att undvika att
kontaminera proverna; arbeta noggrant och försiktigt!
Pipettera ihop PCR-reaktionerna i två märkta PCR-rör enligt nedan: Prov och
kontroll. X= volymen av ert genomiska DNA som ni räknat fram
(29,5-X)µl dH20
20µl PCR mix
1µg (Xµl) genomiskt DNA-templat eller Xµl dH20 för kontrollreaktionen
0,5µl enzym AmpliTaq Gold
50µl totalvolym
Förslut rören noggrant och blanda röret lätt med handen. Skaka eller centrifugera ner
innehållet i spetsen på rören. Amanuenserna startar sedan PCRen som körs över
natt.
Följande PCR-program med ”hot start” körs:
1. 95°C 10 min ("Hot start" aktivering av Taq DNA pol.)
2. 95°C 1 min (denaturering)
3. 55.5°C 1 min (annealing)
4. 72°C 1 min (elongering)
Steg 2 till 4 repeteras 36 gånger (cykler)
3
PCR mixen innehåller vid slutkoncentrationen (1x):
-
-
Taq DNA polymeras buffer:
o 100mM NaCl
o 10mM Tris-HCl, pH: 7.5
1,5 mM MgCl2
0,2 mM dNTP
0,5 pmol/µl uppströmsprimer 18-mer (5´-CAG AGT ACG GGG TTT CTC-3´)
0,5 pmol/µl nedströmsprimer 16-mer (5´-CCG ATT TCC TGC TGA G-3´)
14
Dag 3: Verifiera PCR-produktens storlek på agarosgel
Gjuta agarosgel
Resultatet av PCR-reaktionen skall separeras på en 1,2% agarosgel. Gelen gjutes
genom att agaros först smälts i TAE-buffert i mikrovågsugn och sedan hälles i ett
geltråg med gelkam. SYBR safe DNA gel stain inkluderas i gelen för att visualisera
DNAt.
Material:
- Agaros
- 200 ml Erlenmeyerkolv (E-kolv)
- 1x TAE-buffert4
- SYBR safe DNA gel stain (10 000x i DMSO)
- Handskar
Utförande:
1. Väg upp 0,72 g agaros i en 200 ml E-kolv.
2. Tillsätt 60ml 1xTAE till E-kolven med agaros och koka upp agarosen i
mikrovågsugn. Se upp, den kokar över mycket lätt! Agarosen skall vara helt
smält och inga korn/sliror får synas om lösningen hålls upp mot ljuset.
3. Preparera ett geltråg med en gelkam (5-tandad, 9 mm breda kammar) och
tejpa trågets kortsidor.
4. Låt agarosen svalna till ca 60°C (knappt att man kan hålla i den). Blanda om
försiktigt med jämna mellanrum medan den svalnar så att den inte stelnar
utmed kanterna. Blanda i 3 µl SYBR safe.
5. Häll den avsvalnande agaroslösningen i tråget i dragskåp. Låt svalna till
rumstemperatur. Se till att brunnarna inte blir ”sammankopplade” p.g.a. för
mycket agaros, se figuren nedan. Undvik att det bildas bubblor.
Gräns för agaros
Max gräns för agaros
Gelkam
Geltråg
4
1x TAE innehåller:
-
40 mM Tris-acetat
1mM EDTA
15
Agarosgelelektrofores av PCR produkt
Gelen förs över till elektroforesapparaten och TAE-buffert hälls på så att gelen täcks
helt. Gelkammen dras ur försiktigt och proven laddas i de brunnar som bildas. En
storleksmarkör (en blandning av DNA-fragment med kända längder) pipetteras i en
brunn på sidan för att kunna uppskatta storleken på PCR-produkten. DNA är
negativt laddat och kommer att vandra mot anoden (den positiva polen) när
spänningen läggs på. DNAt visualiseras med hjälp SYBR safe DNA gel stain och UVljus på ett UV-bord. Gelen fotograferas och storleken på PCR-produkten bestäms.
Använd handskar då ni hanterar gel, geltråg och buffert. Torka upp spill och släng
Material:
- PCR-reaktion från tidigare moment
- Storleksmarkör (”Generuler”, laddas direkt på gel, ladda 4µl på gelen)
- Gelladdningsbuffert5
- 1x TAE-buffert
Utförande:
1. Ta bort tejpen från kanterna och ställ ner hela tråget med gelen i
elektroforesapparaten och häll på 1x TAE-buffert så att gelen täcks av buffert.
Tänk på att sätta gelen åt rätt håll (− och + )!
2. Pipettera 7µl gelladdningsbuffert direkt till PCR-rören med prov och kontroll.
Blanda och centrifugera kort eller slå ner proven i botten på röret.
3. Avlägsna försiktigt kammen på den stelnade agarosgelen så att brunnar
bildas.
4. Så här skall brunnarna laddas (från vänster till höger):





Storleksmarkör ”Generuler” (4µl)
15µl av provet
Lämnas tom
15µl kontroll
Lämnas tom
5. Ladda proverna på gelen med fin pipettspets. Undvik bubblor i pipettspetsen
och att pipettera luft då bubblor som stiger ur brunnarna stör provet.
Gelladdningsbufferten innehåller bl.a. glycerol som gör att proverna är
tyngre än bufferten och sjunker ner i brunnarna.
6. Kör gelen vid 100V tills den blå markören har vandrat ca 3 cm (ca 60 min).
5
Gelladdningsbufferten innehåller:
- 1% xylencyanol
- 1% bromfenol-blått
- 40% glycerol
16
7. Lyft ur tråget med gelen och placera gelen på UV bordet. Slå på UV-ljuset och
dokumentera sedan gelen för storleksbestämning av PCR-produkten. Detta
moment gör ni tillsammans med labamanuens.
Detta är storleksmarkören som används. 1µg (10µl) av GeneRuler DNA Ladder Mix
innehåller:
- 120ng av 500 bp fragmentet
- 120ng av 1000bp fragmentet
- 32ng av 2000bp fragmentet
- 120 ng av 3000bp fragmentet.
Rita av resultatet av er agarosgelelektrofores nedan:
17
Egenuppgift: Primerdesign
Denna uppgift kan göras hemma eller i en datasal..
Primerdesign in silico (=i datorn)
För att köra en PCR måste man ha så kallade primers, dvs. korta bitar enkel strängat
(es)DNA (16-25bp) som designats för att känna igen en specifik DNA-sekvens.
Primerns uppgift är att erbjuda DNA-polymeraset en startpunkt (dvs. en fri 3’-ände)
från vilken nysyntes av DNA kan ske. Man ”ramar in” den sekvens man vill
amplifiera med PCR genom att designa två stycken olika primers som passar ovanför
och nedanför sekvensen man är intresserad av (så kallad uppströms eller 5’-primer
och nedströms eller 3’-primer, tillsammans kallas de för ett primerpar). Innan man
kan designa sina primers behöver man ha information om den sekvens man vill
amplifiera. Det finns flera olika databaser på internet som har sådan
sekvensinformation för olika arter. I denna del av lab. 2 ska ni först hämta hem
information om sekvensen för kycklingens beta-NGF/NGFB (beta-nerve growth
factor) gen från Ensamble-databasen6 och sedan designa ett primerpar som kan
amplifiera en bit av NGF genen med hjälp av Primer3plus7.
Material:
Ensembl: http://www.ensembl.org/index.html
Primer3Plus: http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
Utförande:
Ni ska söka efter NGF-genen i kycklingens genom. Välj ”Chicken” i sökfältet,
skriv in ”NGF” och klicka sedan på ”Go”.
Ensembl är ett sökverktyg som innehåller bla. sekvensinformation från ett stort
antal organismers genom sekvenser, bland annat kycklingens.
6
7
Primer3plus är ett online-verktyg för att designa primers.
18
Ett antal sökresultat dyker upp. Klicka på ”chicken” och sedan ”gene”. Tryck på
”Gene ID”. En ny sida laddas upp med all möjlig info om NGF-genen. Titta igenom
sidan och ta reda på nedan uppgifter. Bläddra mellan de olika flikarna längst upp på
sidan.
När det gäller sista frågan angående genens funktion får ni själva söka efter
informationen. Det är viktigt att ni använder en pålitlig källa samt att ni anger vilken
källa ni använde er av för att besvara frågan.
På vilken av kycklingens kromosomer finns NGF?
Ligger NGF på kromosomens forward eller reverse strand?
Hur många exoner består NGF genen av?
Hur många aminosyror består NGF-proteinet av?
Vad för funktion har NGF genen?
19
Ni vill ha cDNA-sekvensen för NGF. Klicka fliken ”Transcript NGF_201” högst upp
(bild 1) och därefter ”Exons” längst ut till vänster (bild 2). Ni får då fram sekvensen i
en grå ruta. Markera sekvensen med musen och kopiera den (CTRL+C). Klistra sedan
in den (CTRL+V) i ett nytt txt- eller word dokument för att ha den tillgänglig senare.
Ni har nu hämtat sekvensen för kyckling NGF. Dags att designa primers. Följ länken
till Primer3plus.
Klistra in sekvensen för kyckling NGF i det stora vita fältet och välj sedan ”General
settings” (bild 3). I General settings väljer ni följande parametrar:
Product size ranges: 400-410
Önskad storlek på vår PCR produkt (ca
400bp är bra).
Föredragen storlek på våra primers
(mellan 18-22bp)
Primer size: Min: 18, Opt: 20, Max: 25
Det finns även en del andra parametrar man kan ställa in, bl.a. smältpunkt för
primrarna (Tm) och önskat GC innehåll osv. Men de lämnar vi åt sidan så länge.
Tryck sedan på den gröna knappen ”Pick primers” (bild 4).
20
Ni får nu upp ett nytt fönster med olika förslag på primerpar.
Skriv ner datorns första förslag på primrar här nedan:
Primer 1/left:
Primer 2/right:
Produktens längd:
Kolla igenom resten av listan notera följande till labrapporten:



Hur många olika förslag på primerpar fick ni upp?
Jämför förslag nr1 på primerpar med sekvensen ni klistrade in (blå och gul
markerat). En av primrarna är inte identisk med sekvensen ni klistrade in.
Varför?
Vilken primer är 5’ resp. 3’ primer?
I nästa steg är det viktigt att kontrollera att primrarna är specifika och verkligen bara
känner igen den region/gen man vill amplifiera med PCR. Detta kontrolleras genom
att söka med primersekvenserna mot kyckling-genomet exempelvis NCBI-Entrezdatabasen för att se om det eventuellt finns andra regioner i kyckling-genomet som
primrarna kan binda till. Om primrarna känner igen fler platser än en, är de inte
specifika nog och man måste välja/designa nya primers. Denna typ av sökning eller
sekvensjämföresle kallas för BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) och ni ska öva
mer på BLAST-sökningar i lab 4.
Gå till NCBI-Entrez (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Välj programmet Nucleotide blast (bild
6, pil) och ytterligare ett fönster (bild 7) visas i vilket ni skall skriva/klistra in era
primer sekvenser.
21
Skriv in sekvensen på Primer 1 och 2 på två rader i den översta rutan. Välj sedan
Database: Others/Nucleotide collection (nr/nt)
Organism: ”Gallus gallus” (bild 7)
Starta Blast med BLAST knappen!
22
Ett nytt fönster öppnas medan databasen arbetar. Det kommer förmodligen att dröja
ett tag (ca 1 minut) innan sökningen är färdig eftersom databasen söker med
primersekvenserna mot hela kycklingens genom för att försöka hitta träffar. Det är
färdigt när ett nytt fönster dyker upp.
Ni får nu se en ny sida som visar vilka era sekvenser i databasen som era primers
känner igen. Nedanför kommer även en lista att visas med eventuella träffar. Varje
träff ges en ”score” och ju högre desto bättre. ”Query coverage” säger hur många
procent av söksekvensen som matchar i databasen. Under listan visar resultatet av
jämförelsena.
Besvara följande till labrapporten:



Vad känner era primers igen?
Vad kan ni säga om dessa primers specificitet utifrån sökresultatet? Binder de
på flera ställen med hög % av ”Query coverage”?
Skulle ni vilja använda dessa för att köra PCR?
Primer-design delen av lab 2 klar! Observera dock att det primerpar som ni just har
letat fram inte är samma primerpar som används i PCR-labben. För varje bit DNA
man vill amplifiera med PCR finns det oftast flera olika primers man kan använda!
23
Mall för labrapport med specifika frågor till laboration 2:
Lysering och spektrofotometri:
1. Vilken funktion har Proteinas K och SDS i lyseringsbufferten?
2. Vad är SDS för typ av reagens?
3. Visa era DNA-koncentrationsberäkningar.
4. Hur mycket DNA (µg) fick ni totalt ut från kycklinglevern?
5. Vad blev kvoten A260/A280?Vad visar denna kvot? Inom vilka värden bör den
ligga? Redovisa även mätvärdena ni fick.
PCR och gelelektrofores:
1. Beskriv funktionen hos de komponenter som ingår i en PCR-reaktion.
2. Vad menas med "hot start" och varför använder man denna metod vid PCR?
3. Varför utförs en negativ kontroll till en PCR-reaktion?
4. Varför kör man ut PCR-reaktionen på agarosgel?
5. Vilken funktion har laddningsbufferten och Generuler?
6. Bilägg gelbild från agaroselektroforesen av PCR-produkten (märk ut tydligt
på gelen vad som är vad och relevanta storlekar i stegen).
7. Vilka fragment kan ni se? Notera storlekar på banden i storleksmarkören
samt för PCR-produkten.
8. Syns några band i den negativa kontrollen? Varför/ varför inte? Förklara.
9. Uppskatta mängden DNA som bildats i PCR-reaktionen (uttryckt i µg)
genom att jämföra PCR-bandets intensitet med intensiteten i ett av banden i
storleksmarkören (som har känd DNAmängd/µl, se figur ovan). Räkna sedan
baklänges för att få reda på hur mycket DNA som måste finnas i PCR-röret.
10. Varför syns DNAt i UV-ljus?
11. Om du råkar göra en 2%-ig agarosgel i stället för 1%-ig, hur påverkar detta
din elektrofores?
Primer design:
1. Besvara frågorna ang. NGF sökträffarna.
2. Hur såg datorns första primer-förslag ut? Hur lång produkt blir det?
3. Besvara frågorna ang. primersökningen.
4. Besvara frågorna ang. BLAST-sökningen.
24
Laboration 3: Kloning av DNA
Dag 1:
Dag 2:
Dag 3:









Ligera PCR-produkt och vektor
Transformera bakterier
Sprida bakterier på plattor
Räkna blå/vita kolonier
Plocka kolonier till övernattskultur
Preparera plasmid-DNA
Restriktionsenzymsklyva plasmid-DNA
Gjuta agarosgel
Köra ut klyvda och oklyvda plasmider på gel
Teori
Kloning är en av de absolut vanligaste metoderna på lab och olika varianter av
kloningsarbete används rutinmässigt överallt för att isolera och arbeta med DNA och
gener. Varianter på tillvägagångssättet används i all forskning där man har behov av
ett specifikt DNA-fragment eller sekvens, men att klona olika typer av fragment i
plasmid-vektorer (som i denna lab) är antagligen det enskilt vanligaste
molekylärbiologiska experimentet. Några andra exempel där kloning används:
isolering av nya gener, screening av bibliotek, sekvensning, riktad mutagenes, in
vitro transkription, mm. All kloning bygger dock på att med hjälp av enzymer klippa
och klistra i DNA för att bilda det konstrukt man vill ha, och sedan utnyttja
exempelvis bakterier eller virus för att bära och mångfaldiga konstruktet.
Särskilda instruktioner
Momenten utförs i grupper om 2-3 personer.
X-Gal är giftigt och måste hanteras med handskar.
Handskar måste även användas vid ligeringen och restriktionsklyvning för att inte
kontaminera reagensen.
Enzymerna (T4 DNA ligas & restriktionsenzymer) får inte bli rumstempererade och
måste hela tiden förvaras i frysblocket.
Laborationsrapport
Rapporten lämnas in gruppvis.
Besvara de specifika frågorna som står i slutet. Om ni fick avvikande och/eller
felaktiga resultat ska ni göra en felanalys där ni anger troliga förklaringar till varför
ni fick dessa.
25
Bakgrund
I denna lab ska ni först ligera samman ett DNA-fragment (samma som ni
amplifierade genom PCR) med en vektor som heter pMOS-Blue och sedan
transformera in detta konstrukt i bakterier. pMOS-Blue är en vektor som möjliggör
sk. blå-vit selektion och efter transformationen kommer ni att plocka både blåa och
vita kloner som ni odlar vidare. Sedan preparerar ni fram plasmid-konstruktet ur
dessa och klyver upp med restriktionsenzym och kör ut på agarosgel. På så sätt får ni
bekräftat om ert kloningsexperiment lyckades och någon av bakterierna innehåller
det konstrukt ni ville skapa.
Det är enklast att ligera två DNA-molekyler som har komplementära och
överlappande ändar (sk. ”sticky-ends”) men det går också att ligera "blunt ends" eller
sk. trubbiga ändar. För att en sticky-end ligering skall lyckas är det absolut
nödvändigt att ändarna är komplementära (dvs. kan baspara) till varandra. Därför
måste man ha samma sorts ändar på fragmentet som på vektorn. Om man inte har
det måste man först skapa sk. blunt-ends för att man ska kunna ligera samman
fragment och vektor. I denna lab använder vi blunt-end kloning.
pMOS Blue-vektorn som ni använder i denna lab för ligeringen har redan klyvts med
restriktionsenzymet EcoRV som ger trubbiga ändar. Den EcoRV kluvna plasmiden
har dessutom behandlats med enzymet fosfatas som tar bort 5'-fosfatgrupperna.
Fosfatasbehandlingen görs för att pMOS inte skall kunna ligeras ihop med sig själv
(ringslutas). PCR-produkten som skall ligeras in har även den i förväg behandlats för
att få trubbiga ändar, men dessa ändar har inte fosfatasbehandlats utan har sina 5’fosfatgrupper kvar.
Efter ligeringen förs plasmid-DNAt in i bakterier vilket kan ske genom
transformation eller elektroporering. Vid transformation behövs så kallade
kompetenta bakterier som kan ta upp plasmid-DNA. Kompetenta bakterier kan
köpas eller framställas genom att behandlas med bl.a. CaCl2. Normalt tar bara ett
fåtal av bakterierna upp DNA. Endast de bakterier som tagit upp plasmid och
därmed en antibiotika-resistensgen kommer att vara resistenta mot antibiotika
(vanligtvis ampicillin) och kommer att överleva selektionen när de sprids ut på ampplattor.
En plasmidvektor som har ett DNA-fragment (ett sk. insert) kallas en rekombinant
plasmid. Vid ligeringen bildas normalt både rekombinanta och icke-rekombinanta
plasmider. De selekterade bakteriekolonierna screenas ytterligare för om den
upptagna plasmiden är rekombinant eller ej. Denna andra typ av screening kallas
blå/vit-screening eftersom den görs utifrån bakteriekoloniernas färg.
pMOS har ett sk. "multiple cloning site" (MCS) mitt i en gen, LacZ, som kodar för
enzymet ß-galaktosidas. ß-galaktosidas kan spjälka substratet X-gal (se figurer
nedan) och ger då en blå produkt. Om ett DNA fragment ligeras in i MCS så förstörs
enzymets aktivitet. Bakterier som bär på en icke-rekombinant plasmid (endast
vektor) kommer alltså att innehålla ett aktivt enzym och kommer bilda blåa kolonier
på X-gal plattor. Bakterier som tagit upp rekombinant plasmid kommer vara färglösa
26
(vita). Genom att undvika att plocka blåa kolonier kan man öka chansen att få en
rekombinant plasmid.
Överkurs: För att LacZ genen skall vara aktiv behövs vanligtvis isopropyl-ßthiogalaktosid (IPTG). IPTG är en galaktosanalog och aktiverar ß-galaktosidasgenen.
Vi kommer dock att använda en stam av E.Coli-bakterier som kallas TOP10. Denna
stam kräver ej IPTG för att aktivera LacZ och ni behöver därför inte tillsätta det.
27
Dag 1: Ligering och transformation
Ligering av PCR-produkt och pMOS-Blue vektor
Ni ska sätta upp två ligeringsreaktioner. En som innehåller PCR-produkten
(kloningsligering) och en utan PCR-produkt (kontroll-ligering).
Material:
- Renad PCR-produkt (med trubbiga ändar och 5’-fosfat)
- pMOS-Blue vektor (klyvd med EcoRV (trubbiga ändar), fosfatas-behandlad)
- Eppendorfrör
- T4 DNA ligas
- dH2O
- 10x ligasbuffert8
Utförande:
Märk 2 Eppendorfrör med gruppnummer samt ”Ligering” och ”Kontroll-ligering”
och pipettera upp följande:
Ligering:
6 µl dH2O
1 µl PCR produkt
1 µl vektor
1 µl 10x ligasbuffert
1 µl T4 DNA ligas 4 U (4 U/µl)
tot volym: 10 µl
Kontroll-ligering:
7 µl dH2O
Ingenting
1 µl vektor
1 µl 10x ligasbuffert
1 µl T4 DNA ligas 4 U (4 U/µl)
tot volym: 10 µl
Inkubera rören vid rumstemperatur i 15 minuter.
8
10x Ligasbuffert innehåller:
- 100 mM Tris-HCl pH 7,5
- 50 mM NaCl
- 10 mM ATP
28
Transformation av kompetenta bakterier
Ligeringarna blandas med de kompetenta bakterierna och inkuberas i isbad.
Förutom ligeringarna så transformeras en kontroll-plasmidDNA (TK). Denna
transformation fungerar som positiv kontroll för transformationen och talar om hur
bra transformationen fungerat. Bakterierna utsätts sedan för en värmechock och
sprids på plattor med ampicillin. Bara bakterier som tagit upp plasmid och är
resistenta mot ampicillin kommer att överleva på plattorna (selektion). Plattorna ska
även förses med X-gal som används som substrat för blå/vit-screeningen.
Material:
- 6 st TYE-agarplattor med ampicillin 100µg/ml (röd petriskål) från lab 1
- Glaskulor för bakteriespridning
- X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-galactoside) 20mg/ml
- De två rören med ligeringar
- Kontroll-plasmidDNA, 0,01ng/µl (för positiv transformationskontroll=TK)
- Kompetenta bakterier: E.coli TOP10 (3 frusna rör, 20µl/rör)
- 1 rör med sterilt TYE-medium
- Isbad, värmeblock 42°C och vattenbad 37°C.
Utförande:
1. Fyll en islåda med is. Hämta sedan 3 rör med 20µl kompetenta bakterier av
stammen TOP10 från kursledare. OBS! De kompetenta bakterierna är
mycket känsliga och måste hållas på is hela tiden!
2. Pipettera direkt till var sitt rör med bakterier (endast en ”ligering” per rör):
- 4µl ligering (markera röret med +)
- 4µl kontroll-ligering (markera röret med −)
- 2µl kontroll-plasmidDNA (markera röret med TK)
Blanda INTE med pipettering upp och ner utan försiktigt genom att knäppa
med fingret mot röret. Undvik att värma upp proven genom att hålla långt
ner på rören, håll i stället uppe vid locket!
3. Inkubera rören på is 15 minuter. Se till att värmeblocket håller 42°C.
Under tiden:
Märk upp era amp-plattor. Märk era plattor med gruppnummer samt: +, −
eller TK (två plattor till varje). Märk sedan +, − eller TK-plattorna med ”50µl”
resp. ”150µl” (totalt sex plattor).
4. Efter det att bakterierna stått på is 15 minuter, är det dags att värmechocka
bakterierna för att transformera dem. Inkubera rören med bakterier på
värmeplattan (42°C) i EXAKT 30 sekunder. Sätt genast rören på is igen och
inkubera i ytterligare 2 minuter.
5. Tillsätt 250µl TYE-medium till rören med transformerade bakterier och
inkubera rören vid 37°C i 40 minuter under skakning.
6. Preparera amp-plattor med X-gal. Häll ut ett tiotal glaskulor på plattorna
märkta med + eller – (totalt fyra plattor) och pipettera 40µl X-gal till varje
platta och sprid. Fördela lösningen direkt på plattan genom att skaka runt
kulorna.
29
Var noga så att X-gal kommer på hela plattan (brist på X-gal kan ge falska
resultat vid er blå/vit-screening). Låt agarn suga upp X-gal:en i c:a 10 minuter.
Behåll glaskulorna i plattan i väntan på spridning av bakterierna.
X-Gal är giftigt och måste hanteras med handskar. Använd inte brännare.
Spridning av transformerade bakterier
Utförande:
1. 50µl av transformations-lösningarna skall sättas på plattor märkta ”50µl” och
150µl skall sättas till plattor märkta ”150µl”. Fördela bakterierna med hjälp av
glaskulorna.
2. Låt agarn suga upp lösningen några minuter innan glaskulorna hälles av i
angivet uppsamlingskärl.
3. Inkubera plattorna upp och ner vid 37°C över natt.
30
Dag 2: Beräkna transformationseffektivitet och plocka kloner
Beräkna transformationseffektiviteten
De bakterier som växer på plattorna måste ha tagit upp plasmid eftersom de
uppvisar ampicillinresistens. Olika bakterier har dock tagit upp olika plasmider.
Bakterier som tagit upp rekombinanta plasmider blir färglösa (vita) och de som tagit
upp icke-rekombinanta plasmider (endast vektor) blir blå (se bild).
Räkna och notera hur många kolonier ni fått på plattorna samt andelen blå och vita
kolonier. Alla gruppers resultat noteras på tavlan och resultaten diskuteras
gemensamt i labbet tillsammans med handledare.
Plocka blå och vita kloner
Två vita och en blå koloni plockas till rör med TYE-medium och odlas upp i 37°C till
nästa dag. Dessa kulturer kommer sedan att används för minipreparation av
plasmidDNA.
Material:
- Agarplattor med kolonier från dag 1 av lab 3
- Pipettspetsar
- 3 st skruvlocksrör med 2ml TYE-medium (Innehåller Amp)
Utförande:
1.
Märk tre skruvlocksrör: ”VIT A”, ”VIT B” (vita kolonier) och ”BLÅ” (blå
koloni) samt gruppnummer. Två vita kolonier (med förhoppningsvis
ligerad PCR-produkt, tas från +-plattan) och en blå koloni (förmodligen
utan PCR-produkt, tas från −-plattan) skall plockas.
2.
Ta plattan med den spädning som gett enskilda, lätt urskiljbara, kolonier och
välj ut två vita och en blå koloni. Plocka kolonierna till var sitt
skruvlocksrör med hjälp av en pipettspets. Spetsen släpps ner i röret och
lämnas där.
3.
Skruva fast locken på rören. Rören inkuberas i 37°C med skak över natt (tas
om hand av labhandledare).
31
Dag 3: Plasmidpreparation, restriktionsenzymsklyvning, gelkörning
Plasmidpreparation (TENS-metoden/”mini-prep”)
Bakterierna som odlats i skruvlocksrör förs över till Eppendorfrör, centrifugeras ner
och slammas upp i en liten volym för att sedan brytas ner med TENS-buffert.
Lösningen neutraliseras med NaAc varvid bakteriecellvägg samt genomiskt DNA
faller ut och centrifugeras ner. PlasmidDNAt och RNA finns i supernatanten och
precipiteras (fälls ut) med etanol. Plasmid DNAt löses sedan upp i vatten och
analyseras genom agarosgelelektrofores. Proven behandlas med RNase för att
selektivt bryta ner bakteriellt RNA.
Material:
- 6 st Eppendorfrör
- TENS-buffert9, pH >12
- 3M NaAc, pH 5,2
- RNase A lösning
- Etanol, kall, 99,5% samt 70%
- dH20
Utförande:
1. Kontrollera att de plockade klonerna har vuxit i rörkulturerna. TYE-mediet
skall vara grumligt som ”uppslammat mjöl”. Från varje rör skall 1500µl
bakterielösning pipetteras över i Eppendorfrör och centrifugeras med högsta
hastighet (10K) under 10 sekunder. Sätt i rören med gångjärnet utåt för att få
bakteriepelleten under gångjärnet.
2. Efter centrifugering skall det bli en klart synlig bakteriepellet. Häll av den
klara supernatanten försiktigt utan att få med pelleten (ca 100µl medium blir
kvar i röret om man försiktigt häller av lösningen utan att knacka ut det
sista). Vortexa kraftigt tills pelleten är helt uppslammad i de resterande 100µl
medium.
3. Tillsätt 1µl RNase A lösning till varje rör. Inkubera 5 min i rumstemperatur.
4. Tillsätt 300µl TENS buffert per rör och vänd försiktigt rören upp och ner 5-7
gånger för att blanda (vortexa inte). Lösningen skall bli mer eller mindre klar
och slemmigt tjockflytande (viskös) av denaturerat genomiskt DNA och
cellvägg (kan vara svårt att se).
5. Tillsätt 150µl 3M NaAc lösning till rören och vänd rören upp och ner 5 gånger
för att blanda och skaka sedan om rören kraftigt med handen (vortexa inte).
6. Centrifugera rören 10 minuter, 10K. Gångjärnet utåt!
7. Ta rören direkt efter det att centrifugen stannat och för över supernatanterna
till nya märkta Eppendorfrör utan att få med något av pelleten.
9
TENS innehåller:
- 10mM Tris-HCL pH: 7,5
- 1mM EDTA
- 0,1M NaOH
- 0,5% SDS
32
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Volymen av den överförda supernatanten bör vara ca 450µl. PlasmidDNAt
finns löst i supernatanten.
Fäll ut (=precipitera) plasmidDNAt genom att tillsätta 900µl kall 99,5% etanol
till rören och blanda sedan om genom att vända rören under några sekunder.
Inkubera rören 2-5 minuter i rumstemperatur på bänken.
Centrifugera sedan rören 10 minuter 10K i mikrofug. Gångjärnet utåt!
Det skall bli en synlig liten vit pellet (pelleten är inte alltid synlig) som består
av plasmidDNA samt eventuellt RNA. Supernatanten suges försiktigt av utan
att vidröra pelleten.
Tillsätt 1ml 70% etanol för att tvätta pelletten och vortexa lätt. Centrifugera 30
sek. 10K (med samma orientering på röret). Sug försiktigt bort lösningen utan
att få med pelletten.
Sug av så mycket som möjligt av etanolen och ställ röret upp och ned på en
pappershandduk under några minuter. Knacka försiktigt ut den sista
etanolen på pappret och kontrollera att pelleten sitter kvar. Det går även att
torka ut den sista etanolen genom att ställa röret med öppet lock i
värmeblocket en kort stund.
Tillsätt 50µl dH20 till rören och vortexa tills pelleten gått i lösning. Märk rören
och tejpa på märkningen med genomskinlig tejp så texten inte försvinner.
Gjuta agarosgel
Gör gelen på samma sätt som i lab 2, men använd 0,60 g agaros (1,0 % agarosgel).
Använd en kam med 8 tänder istället för 5.
Material:
- Agaros
- 200ml Erlenmeyerkolv (E-kolv)
- 1x TAE-buffert
- SYBR safe DNA gel stain (10 000x)
Medans gelen stelnar utförs restriktionsklyvningen.
33
Restriktionsenzymklyvning av plasmidDNA
Restriktionsenzymsklyvning i kombination med storleksanalys av DNA-fragment
används för att enkelt analysera identiteten på DNA och för att klyva ut DNAfragment från större DNA-bitar eller för att kontrollera resultatet efter en ligering.
För att analysera storleken av ett DNA-insert i en rekombinant plasmid används
restriktionsenzym som klyver ut fragmentet. Klyvningen analyseras sedan på
agarosgel. Man kan förutom att studera fragmentets storlek även kontrollera i vilken
riktning det har satt sig inuti plasmiden genom att använda ett restriktionsenzym
som man vet klipper osymmetriskt inuti fragmentet. I detta moment ska ni dock bara
klyva upp plasmiden för att bekräfta och kontrollera att ett fragment av rätt storlek
hamnat i MCS.
Att klyva ut fragmentet:
Studera pMOS-Blue multiple cloning site igen. Som ni kommer ihåg ligerades
fragmentet in med hjälp av trubbiga ändar i EcoRV sitet. Denna process förstörde
därmed EcoRV igenkänningssekvensen och EcoRV kan inte användas för att på nytt
klyva ut fragmentet. För att göra det måste vi använda andra restriktionsenzym som
ligger på varsin sida om fragmentet. Vi väljer att använda EcoRI och HindIII.
Överkurs: Eftersom vi ligerade med trubbiga ändar kommer fragmentet att
slumpmässigt hamna i antingen rätt eller fel riktning. För att kontrollera i vilken
riktning fragmentet har hamnat kan man antingen sekvensera sin plasmid eller
använda restriktionsenzym som: a) klipper endast en gång i vektorn, b) klipper
endast en gång i fragmentet, samt c) klyver osymmetriskt inuti fragmentet så att två
olika långa ”fragmentbitar” bildas. I denna laboration kommer vi dock inte att utföra
en ”riktnings-klyvning”.
Material:
- Eppendorfrör
- Fällt DNA från prov VIT A och VIT B
- Fällt DNA från BLÅ
- dH20
- Restriktionsenzym EcoRI (FastDigest enzym)
- Restriktionsenzym HindIII (FastDigest enzym)
- Restriktionsenzymbuffert, 10x FastDigest buffer10 (Slutkoncentration: 1x)
34
Utförande:
Plasmiderna (VIT A, VIT B och BLÅ) klyvs med restriktionsenzymen EcoRI och
HindIII och analyseras på agarosgel. Storleken på de utkluvna fragmenten i den
rekombinanta plasmiden och storleken på vektorn uppskattas genom jämförelse med
storleksmarkör. Även prov med oklyvda plasmider skall analyseras på gelen.
Sex Eppendorfrör märks, tejpas och klyvningarna sätts upp som nedan.
OBS! endast ett prov plasmidDNA/ rör (dvs. VIT A, VIT B eller BLÅ).
Fragment-klyvning (3st):
7µl dH20
2µl 10x FastDigest buffer
9µl plasmidDNA (VIT A/B, BLÅ)
1µl enzym EcoRI
1µl enzym HindIII
20µl total volym
Oklyvd kontroll (3st):
9µl dH20
2µl 10x FastDigest buffer
9µl plasmidDNA (VIT A/B/ BLÅ)
0µl enzym
0µl enzym
20µl total volym
Rören blandas försiktigt genom att slå med fingret på rörets spets och lösningen
samlas upp i rörets botten genom att kort centrifugera rören.
Klyvningarna och kontrollerna inkuberas i 15 minuter i 37°C (ställ rören i
värmeskåpet där ni hade era bakterieplattor).
35
Agarosgelelektrofores av plasmidDNA
De olika klyvningarna samt storleksmarkören laddas på gelen.
Material:
- Rör med klyvningarna från ovan
- Gelladdningsbuffert
- Storleksmarkör (Stege; Generuler)
- Handskar
Utförande:
1. Pipettera 3µl gelladdningsbuffert direkt till varje rör med klyvningar och
kontroller. Blanda och centrifugera samtliga prov kort för att spinna ner
proven i botten på röret.
2. Avlägsna försiktigt kammen på den stelnade agarosgelen så att brunnar
bildas.
3. Ladda 20µl av proven på gelen med pipettspets. Från vänster till höger:








Storleksmarkör (4µl)
BLÅ
[Oklyvd]
VIT A
[Oklyvd]
VIT B
[Oklyvd]
Lämnas tom
BLÅ
[EcoRI+HindIII]
VIT A
[EcoRI+HindIII]
VIT B
[EcoRI+HindIII]
4. Kör gelen på 100V tills den första blå markören har vandrat ca 3cm
(ca 30 min).
5. Lyft ur tråget med gelen och placera gelen på UV-bordet. Slå på UV-ljuset och
beskåda och fotografera gelen. Kör eventuellt gelen ytterligare för att få
fullständig upplösning av banden och dokumentera sedan gelen.
Identifiera proverna och storleksbestäm de olika banden med hjälp av
storleksmarkören. Jämför de kluvna proverna med respektive okluvna.
Innehåller plasmiderna VIT A eller VIT B PCR-produkten? I så fall: Grattis! Ni har
lyckats med att "klona" ett DNA-fragment. Om detta skulle varit ett "skarpt"
experiment så skulle man sparat rören med levande bakterier för att starta upp en
större plasmidDNA preparation för att få mer DNA som sedan skulle kunna
användas för de fortsatta forskningsändamål man har.
36
Mall för labrapport med specifika frågor till laboration 3:
Ligering av PCR-produkt och vektor:
1. Vad menas med ”blunt-” och ”sticky ends”? Vilken typ använde ni?
2. Vad är fördelen, respektive nackdelen, med att använda blunt eller sticky
ends vid kloning?
3. I lab 2 använde ni dATP och i denna lab ATP. Vad är skillnaden? I vilka
syften använder man de olika nukleotiderna?
Transformation:
1. Varför inkuberar man de transformerade bakterierna i TYE-medium 30
minuter vid 37°C innan spridning på ampicillinplattor?
2. Vilka är de olika kontrollerna ni utför i detta moment och vad syftar de till?
3. Visa resultatet av transformationen i tabellform (antalet kolonier per platta
per transformation, blå/vita kolonier, etc).
4. Varför blir kolonierna vita eller blå?
5. Transformationseffektiviteten uttrycks som ’antal bakterier per µg DNA’ och
beskriver hur bra bakterierna är på att ta upp plasmid. Beräkna
transformationseffektiviteten med utgångspunkt från hur många kolonier
som växte på transformationskontroll-plattorna (den positiva kontrollen).
6. Varför blir frekvensen av återligering (ringslutning) av vektorn låg?
7. Hur kan det uppstå falska positiva kolonier?
Analys av transformerade bakterier:
1. Efter att valda kloner odlats i flytande medium över natt preparerar ni fram
plasmidDNA. I denna process, vilka funktioner har TENS och RNase?
2. Vilka restriktionsenzymer användes för analys av plasmidpreparationen?
Varför utförs en kontroll utan restriktionsenzym?
3. Baserat på de kloner ni plockade för analys, vilka band förväntar ni er att se?
4. Bilägg gelbild och identifiera banden i storleksmarkören och proven (dvs.
märk upp utskriften eller en kopia med svaren på fråga 5-6 nedan).
5. Vilka band såg ni? Identifiera och beräkna storleken på de olika banden på
gelen. Stämmer storleken på fragment respektive vektor med vad ni förväntat
er? Vilka andra eventuella band ser ni?
6. I vilka former förekommer banden ni ser på gelen? Vilka band är
”supercoiled”, relaxerad cirkulär plasmid och/eller linjäriserad plasmid. Kan
ni se RNA och bakteriellt genomiskt DNA i på gelen och i så fall var?
7. Uppskatta mängden plasmidDNA i klyvningen av prov BLÅ (uppskatta
grovt) genom att jämföra bandets intensitet med intensiteten av banden i
storleksmarkören (som har känd DNAmängd/µl, se figur).
8. Beräkna hur mycket plasmidDNA (µg) från prov VIT A som ni fick från i er
minipreparation (dvs. TENS-steget). Börja med att uppskatta intensiteten av
banden liksom ovan. Beakta sedan eventuella fragments storlek i förhållande
till hela plasmiden, hur mycket av provet ni laddade på gelen samt den totala
volymen som ni spädde upp ert plasmidDNA prov i.
37
Laboration 4: Sekvensering och bioinformatik
Dag 1:


Analys av sekvenseringsdata
Sekvensjämförelse med hjälp av BLAST alignment
Teori
Majoriteten av DNA-sekvensering sker med Sanger-metoden. Metoden (också kallad
dideoxymetoden eller ”chain termination method”) bygger på DNA-polymerisering
från en specifik primer och att polymeriseringen avbryts vid en av de fyra baserna.
Detta sker genom att en låg andel av dideoxy-nukleotider (ddNTP) blandas in i
polymeriseringsreaktionen vilken stoppas då en dideoxynukleotid inkorporeras.
Stoppet sker eftersom 3’–OH saknas på dideoxy-nukleotiderna och då kan fortsatt
DNA-syntes inte fortgå. Om en reaktion innehåller ddATP, dGTP, dATP (lägre
konc.), dTTP, dCTP, så kommer alla fragment som bildas ha ett A i slutet. Om fyra
reaktioner körs med respektive ddGTP, ddTTP och ddCTP kommer alla baser i ett
DNA-fragment att representeras (se närmare Lodish et al). För att detektera DNAfragmenten används fluorescens-märkta nukleotider/primers. Storleken på DNAfragmenten bestäms sedan genom någon form av elektrofores. All sekvensering är
idag automatiserad och sköts ofta av lab-robotar. Sekvenseringen använder sig av
laserbaserad fluorescens-detektion och i stället för en reguljär gelelektrofores
används kapillärelektrofores. Sekvenseringsteknologin utvecklas snabbt och andra
tekniker som kan sekvensera ett stort antal DNA fragment samtidigt har börjat
användas mer och mer: 454 och Illumina är de viktigaste och bygger inte Chain
termination/Sanger utan på Pyro-sekvensering.
Denna laboration är teoretisk och ni kommer att analysera resultat från en
automatiserad Sanger-sekvensering. Resultatet är från sekvensering baserat på
fluorescens- och kapillärelektrofores av s.k. ”big dye termination type”. Vid denna
typ av reaktioner är de olika dideoxynukleotiderna inmärkta med olika
fluorokromer. Detta ger den stora fördelen att alla fyra baserna kan analyseras i en
och samma reaktion. Sekvensreaktionen sker direkt på denaturerat dubbelsträngat
plasmid-DNA med hjälp av Taq DNA-polymeras och en PCR-maskin. DNAfragmentet som skall sekvenseras kan vara klonat i en plasmid med
sekvenseringsprimer-sekvenser på vardera sidan av kloningsstället (multiple cloning
site, MCS). Exempel på sekvensprimers är T3, T7, M13 eller M13rev.
Särskilda instruktioner
Labben utförs i respektive laborationsgrupp.
Laborationsrapport
Rapporten lämnas in gruppvis.
Besvara frågorna i denna manual samt de specifika frågorna som står i slutet.
38
Analys av sekvensinformation
Denna laboration är en fortsättning på lab 2 och 3, i vilka ni har isolerat DNA, kört en
PCR, klonat och fört in en gen i en vektor. I denna lab kommer ni arbeta med två
typer av sekvenseringsdata:
 en PCR-produkt som sekvenserats med en PCR primer
 en BAC-klonsekvens innehållande NPY4R och en vektorsekvens
I laborationens första del har ni fått sekvenseringsdata utfört på NPY4R PCR-produkt
som sedan separerats med kapillärelektrofores. Målet med denna första del är att
bekanta er med sekvenseringsdata samt utvärdera dess kvalité.
Er uppgift är att bekräfta att den rätta genen har sekvenserats (alltså NPY4R) samt
kontrollera sekvenseringens kvalité genom jämförelse med den korrekta sekvensen i
databasen.
Material:
- Filen ”NPY4R PCR product”
- Dataprogrammet ”Chromas Lite”
- Webbsidan ”Entrez” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov )
Ladda ner filen NYP4R från Studentportalen (finns i mappen ”Laborationer och
seminarier”) och spara den någonstans på datorn där ni kan hitta den.
Starta programmet Chromas Lite och öppna den nerladdade filen NPY4R i
programmet. Titta på sekvenseringsdiagrammet och notera var det finns regioner av
bra respektive dålig sekvensinformation. Bra sekvensinformation är när topparna är
höga, väl skilda åt och inte överlappar varandra för mycket. Sekvensen (ATCG) kan
utläsas ovanför topparna. Om ”N” skulle finnas ovanför topparna betyder detta
obestämd nukleotid och många N är ytterligare ett tecken på ”dålig sekvens”.
Notera följande till labrapporten:
S-1:
S-2:
S-3:
Hur lång är hela sekvensen (i bp)?
Mellan vilka bp (ungefär) finns det bra sekvensinformation? (Behöver
inte vara exakt.)
Vilka regioner innehåller riktigt dålig sekvensinformation?
För att ni ska kunna analysera sekvensen mot databaser på Internet måste
sekvensinformationen först exporteras i s.k. FASTA-format, som är ett format som
databaserna förstår och kan använda.
I Chromas, välj: File -> Export -> Döp filen (till något ni minns). Var noga med att ni
exporterar filen i FASTA-format, samt att sparar den någonstans ni senare kan finna
och har tillgång till.
I den andra delen av denna lab har ni fått sekvenseringsdata som utförts på en BACklonsekvens innehållande NPY4R-genen. Ladda ner filen ”NPY4R_BAC” från
Studentportalen (finns i mappen ”Laborationer och seminarier”) och spara den
någonstans på datorn där ni kan hitta den. Filen är redan i FASTA-format. För att
öppna filen: → högerklicka och välj “Öppna med” (alternativt “Open with”) → välj
Word eller Wordpad beroende på er preferens. Markera sekvensen (inte första raden,
39
som är information om själva sekvensen) och kopiera den till datorns minne
(markera, CTRL+C).
Följ länken till Entrez-sidan. Gör denna sida till ett bokmärke i webbläsaren (Spara
som ”Favorit”), eftersom ni kommer att behöva återvända hit ofta under labben.
Entrez är en mycket användbar plats som samlar en mängd databaser genom vilka
man kan utföra i princip all sorts biologisk och medicinsk bioinformatik. Välj BLASTfunktionen i listan Popular Resources (bild 1).
En ny sida öppnas där man kan välja mellan olika sorters för BLAST-sökningar (bild
2). Titta på sidan för att bekanta er med de olika alternativen. Bland annat kan man
BLAST:a nukleotidsekvenser, aminosyrasekvenser men även låta datorn translatera
exemplevis en DNA-sekvens till aminosyror för att sedan söka efter liknande
40
aminosyrasekvenser. Vi är intresserade av att jämföra vår DNA-sekvens med annan
DNA-sekvens och väljer därför ”Nucleotide blast” (bild 2). En ny sida öppnas där vi
ska fylla i vad vi vill undersöka och i vilken art (bild 3).
Börja med att klistra in NPY4R-sekvensen från datorns minne i ruta A (CTRL+V).
Sedan måste vi välja vilken databas vi vill söka i (B). Titta på alternativen i dropdown menyn. Här kan man välja att söka i flera olika databaser, bl.a. i musens eller
människans genom. Men vi är ju ute efter att undersöka kvalitén på vår ”hemmaklonade” NPY4R-sekvens genom att jämföra den med den redan publicerade
människosekvensen. Välj ”nucleotide collection (nr/nt)” i menyn (B) och sedan
organismen människa (=Homo sapiens) i ruta C. I ruta D, välj ”Highly similar
sequences”. Tryck sedan på BLAST-knappen och vänta på att sökningen blir färdig.
En ny sida öppnas när sökningen är klar. Titta noggrant på sidan och besvara
följande till labrapporten:
S-4:
S-5:
S-6:
S-7:
S-8:
S-9:
Hur många träffar fick ni upp? Vilken var bäst? Vad heter den?
Hur många procent av sekvensen ni sökte med (Query) träffade
någonting i databasen (lägg fokus på den bästa träffen)?
Vid vilka bp i er Query börjar respektive slutar träffen?
Vad är likheten (=identity) mellan Query och Sbjct (Sbjct = subject) i
procent?
Hur många gaps (dvs. positioner ”utan par”) finns det? I vilken
sekvens finns det gaps – i Query, Sbjct eller båda?
Vilket ”Accession number” har bästa Sbjct-sekvensen?
Gå nu tillbaka till sidan som visas i bild 3 och välj istället ”Somewhat similar
sequences” i fältet D. Svara sedan på följande frågor:
S-10:
S-11:
S-12:
Hur många träffar får ni upp nu? Vilken träff var den bästa?
Spelar det någon roll vilket sökalternativ i D ni använder?
Vilket sökalternativ skulle ni föredra att använda själva? Motivera.
Nu är denna del av labben klar och vi fortsätter med nästa moment.
Sekvensjämförelser med BLAST alignment
Syftet med denna del av laborationen är att jämföra hur lik eller olik den humana
NPY4R (mRNA-/cDNA- och aminosyrasekvens) är jämfört med några andra
organismer (mus, zebrafisk, kyckling).
Utförande:
Gå till Entrez-sidan och klicka på ”Nucleotide” i högra spalten (Popular Resources). I
sökfältet, skriv NPY4R och, för att begränsa antalet träffar, skriv även Homo sapiens.
Notera datumet träffarna uppdaterades genom att klicka på dem. Välj den senast
uppdaterade varianten av genen, men kontrollera att det är rätt typ av information
(mRNA) genom att observera ”accession number”, vilket i detta fall bör börja med
NM_. Om det finns flera varianter uppdaterade samma dag, välj det längre av dem.
41
Notera accession number för det senast uppdaterade (eller längsta varianten)
humana NPY4R mRNA:t.
Accession number: __________________
B-1:
B-2:
B-3:
Hur många bp består den humana NPY4R-genen av?
På vilken kromosom finns genen?
Vilken funktion har genen? (Finnes under ”More information”.)
Kopiera nukleotidsekvensen (FASTA) till ett dokument så ni kan använda den
senare.
Gå tillbaka till Entrez-startsidan och klicka på Nucleotide igen. Sök nu efter NPY4R
mus musculus istället, så ni kan jämföra de två arterna. Kopiera FASTA-sekvensen
av musgenen (senast uppdaterade/längsta, som ovan) till ett dokument (kom ihåg
vilken sekvens tillhör vilken art).
B-4:
B-5:
Notera ”Accession number” för musens NPY4R:
Hur många bp består musens NPY4R-gen av?
Gå till Entrez-startsidan och välj BLAST-funktionen i högra spalten (som tidigare). I
listan ”Specialized BLAST”, välj ”Align”.
I boxarna, klistra in de två olika sekvenserna. Notera i vilken box mus respektive
humana FASTA-sekvensen du klistrar in, då du kommer behöva veta detta i nästa
steg. Välj ”Highly similar sequences” och BLAST:a.
B-6:
B-7:
B-8:
Hur många % identitet uppvisar de båda sekvenserna mot varandra?
Hur lång sekvens (bp) är det som överlappar total sett?
Vid vilka baspar börjar respektive slutar överlappet mellan
människans sekvens och musens sekvens?
Gå tillbaka till aligntment-boxarna och gör om sökningen, men istället för att klistra
in FASTA-sekvenserna, skriv de respektive accession number för de två arterna.
För att göra en fullständig sökning mellan olika arter, finn NPY4R-sekvenserna
(accession number) genom att söka för NPY4R och artens latinska namn. Notera de
olika accession number för träffarna (senast uppdaterade eller längsta).
Art
Kyckling
% likhet
Latinskt namn Antal bp Accession number (med människa)
Gallus gallus
Zebrafisk
Danio rerio
Mus
Mus musculus
Människa Homo sapiens
Fyll i tabellen ovan.
42
Nu ska du jämföra de olika arternas aminosyrasekvens. Finn först accession number
för proteinerna genom att utföra sökningen som tidigare, med undantaget att välja
Protein istället för Nucleotide i den högra spalten på Entrez-startsidan. I align-steget,
klicka på fliken blastp istället för blastn, som du gjorde för alignment av mRNAsekvenserna (blastn är standardalternativet). Kom ihåg att accession number börjar
på NP_ för aminosyrasekvenser.
Art
Kyckling
% likhet
Latinskt namn Antal aa Accession number (med människa)
Gallus gallus
Zebrafisk
Danio rerio
Mus
Mus musculus
Människa Homo sapiens
Fyll i tabellen ovan.
Mall för labrapport med specifika frågor till laboration 4:
Analys av sekvenseringsdata:
1. Redovisa svaren på de frågor som står i labhandledningen.
2. Hur många % av er söksekvens (query) träffade något i databasen? Vad tror
ni att den övriga sekvensen (som inte träffade något) består av?
Sekvensjämförelse mellan olika arter:
1. Redovisa svaren på de frågor som står i labhandledningen.
2. Redovisa tabellerna med nukleotid- och aminosyrasekvenser.
3. Vilken art är mest lik och vilken är mest olik människan med avseende på
nukleotidsekvens?
4. Vilken art är mest lik och vilken är mest olik människan med avseende på
aminosyrasekvens?
5. Finns det en korrelation mellan likheten på nukleotidnivå och aminosyranivå (utgå ifrån era egna resultat)?
6. Varför skiljer sig likheterna mellan nukleotidsekvens och aminosyrasekvens
åt?
43