hc2 högrisk HPV DNA Test

Bruksanvisning
hc2 högrisk HPV DNA Test®
En in vitro-nukleinsyrehybridiseringsanalys med signalförstärkning och kemiluminescens på
mikrotiterplatta för kvalitativ detektion av 13 högrisktyper av humant papillomvirus (HPV) DNA i
cervixprover
Att användas med:
DNAPap™ Cervical Sampler™
HC Cervical Sampler™
Specimen Transport Medium™
Cytyc ThinPrep® Pap Test PreservCyt®-lösning
TriPath Imaging® SurePath®-konserveringsvätska
VIKTIGA ÄNDRINGAR FRÅN TIDIGARE REVISION AV BIPACKSEDEL
1. Uppdaterad information från tillverkare och EU.
Endast för professionellt bruk av utbildad och godkänd laboratoriepersonal. Läs dessa
instruktioner noggrant innan testet används.
QIAGEN Gaithersburg, Inc.
1201 Clopper Road
Gaithersburg, MD 20878 USA
96
QIAGEN GmbH
QIAGEN Str. 1
D-40724 Hilden
Germany
©
2008 QIAGEN Gaithersburg, Inc.
5197-1330
L2127SV Rev. 3
CE-märkningen visar att hc2 HPV högrisk DNA Test® uppfyller kraven för medicintekniska
produkter för in vitro-diagnostik enligt det europeiska direktivet 98/79/EC.
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
NAMN OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDE ........................................................................................................................1
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING ...................................................................................................................2
TESTPRINCIP ...............................................................................................................................................................3
MEDFÖLJANDE REAGENS OCH MATERIEL .............................................................................................................4
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER ......................................................................................................6
SÄKERHETSFÖRESKRIFTER .......................................................................................................................6
INFORMATION OM SÄKERHET OCH HÄLSORISKER .................................................................................7
ANVÄNDNINGSFÖRESKRIFTER...................................................................................................................7
REAGENSTILLVERKNING OCH FÖRVARING............................................................................................................9
PROVTAGNING OCH PROVHANTERING .................................................................................................................11
CERVIXPROVER I STM................................................................................................................................11
CERVIXBIOPSIER ........................................................................................................................................11
CERVIXPROVER I CYTYC PRESERVCYT-LÖSNING.................................................................................11
CERVIXPROVER I SUREPATH-KONSERVERINGSVÄTSKA .....................................................................11
TESTFÖRFARANDE...................................................................................................................................................12
HÖGKAPACITETSTESTNING MED ANVÄNDNING AV RAPID CAPTURE-SYSTEMET ............................12
DENATURERING ..........................................................................................................................................13
Prepareringsförfarande för kalibratorer, kvalitetskontroller och STM-prover.................... 13
Prepareringsförfarande för prover i PreservCyt-lösning ................................................... 14
BLANDNING OCH DENATURERING ...........................................................................................................16
Manuellt blandningsförfarande.......................................................................................... 16
MST Vortexer 2-förfarande ............................................................................................... 16
Prepareringsförfarande för SurePath-prover .................................................................... 17
HYBRIDISERING ..........................................................................................................................................19
Hybridiseringsmetod som använder hybridiseringsmikrotiterplatta och värmeblock för
mikrotiterplatta I................................................................................................................. 19
Hybridiseringsmetod med mikrorör och vattenbad ........................................................... 20
HYBRIDINFÅNGNING...................................................................................................................................21
HYBRIDDETEKTION.....................................................................................................................................21
TVÄTTNING ..................................................................................................................................................22
Metod med automatiserad tvättapparat för plattor I.......................................................... 22
Metod för manuell tvättning............................................................................................... 22
SIGNALFÖRSTÄRKNING...........................................................................................................................................23
KRITERIER FÖR VERIFIKATION AV ANALYSKALIBRERING.................................................................................23
CUTOFF-BERÄKNING................................................................................................................................................25
KVALITETSKONTROLL .............................................................................................................................................26
TOLKNING AV PROVRESULTAT ..............................................................................................................................26
PRESTANDAEGENSKAPER......................................................................................................................................27
KLINISK PRESTANDA VID SCREENING AV PATIENTER MED NORMALA RESULTAT FRÅN PAP
SMEAR SOM EN HJÄLP I RISKBEDÖMNINGEN FÖR PATIENTHANDLÄGGNING ...................................27
KLINISK PRESTANDA NÄR PATIENTER MED ASC-US PAP SMEAR-RESULTAT UNDERSÖKS FÖR
ATT BESTÄMMA BEHOVET FÖR REMISS TILL KOLPOSKOPI .................................................................29
KLINISK KÄNSLIGHET OCH SPECIFICITET FÖR BESTÄMNING AV RISKEN FÖR HÖGGRADIG
SJUKDOM HOS KVINNOR MED LSIL ELLER HSIL PAP SMEAR...............................................................31
ANALYTISK KÄNSLIGHET ...........................................................................................................................34
EKVIVALENS MELLAN PROVER I TRANSPORTMEDIUM (STM) OCH PROVER I PRESERVCYTLÖSNING (PC) ..............................................................................................................................................34
KORRELATION MELLAN SUREPATH-PROVRESULTAT OCH QIAGEN STM-PROVER I EN KLINISK
POPULATION................................................................................................................................................34
REPRODUCERBARHET...............................................................................................................................35
KORSREAKTIVITET ...................................................................................................................................................36
KORSREAKTIVITETSPANEL .......................................................................................................................36
KORSHYBRIDISERING ................................................................................................................................37
EFFEKTEN AV BLOD OCH ANDRA SUBSTANSER PÅ PROVER I TRANSPORTMEDIUM FÖR
PROVER........................................................................................................................................................37
i
EFFEKTEN AV BLOD OCH ANDRA SUBSTANSER PÅ PROVER I PRESERVCYT-LÖSNING..................37
REPRODUCERBARHETEN AV hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST MED KLINISKA PROVER TAGNA I
TRANSPORTMEDIUM FÖR PROVER..........................................................................................................37
REPRODUCERBARHETEN AV hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST MED KLINISKA PROVER TAGNA I
PRESERVCYT-LÖSNING .............................................................................................................................38
REPRODUCERBARHETEN FÖR hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST MED PROVER TAGNA I
SUREPATH-KONSERVERINGSVÄTSKA.....................................................................................................39
REPRODUCERBARHETEN FÖR SUREPATH-RESULTAT VID ANVÄNDNING AV
HALVAUTOMATISERAT QIAGEN RAPID CAPTURE-SYSTEM FÖR ANALYSBEHANDLING ...................40
BEGRÄNSNINGAR I TESTFÖRFARANDET..............................................................................................................41
REFERENSER.............................................................................................................................................................42
GUIDE FÖR PROBLEMLÖSNING – hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST .......................................................................45
KONTAMINERINGSKONTROLL ...................................................................................................................49
KONTAKTINFORMATION ..........................................................................................................................................50
ÖVERSIKT ÖVER hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST....................................................................................................51
ii
NAMN OCH ANVÄNDNINGSOMRÅDE
För in vitro-diagnostisk användning
hc2 högrisk HPV DNA Test som baseras på Hybrid Capture® 2 (hc2) teknik är en
nukleinsyrehybridiseringsanalys med signalförstärkning som använder kemiluminescens på
mikrotiterplatta för kvalitativ detektion av 13 högrisktyper av humant papillomvirus (HPV) DNA i
cervixprover.
Cervixprover som kan testas med hc2 högrisk HPV DNA Test inkluderar följande:
•
•
•
•
Prover tagna med DNAPap™ Cervical Sampler eller HC Cervical Sampler™
Prover tagna med provtagningsutrustning av kvasttyp eller en kombination av borste/spatel och
placerade i Cytyc PreservCyt Solution® (se bipacksedeln för hc2 Sample Conversion Kit för
utförlig information).
Prover tagna i TriPath Imaging® SurePath®-konserveringsvätska.
Biopsier tagna med Specimen Transport Medium™ (STM)
Detta test är avsett:
1. För detektion av högrisk HPV-typerna 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 vilka har visats
vara den primära orsaksfaktorn för utveckling av cervixcancer.
2. Som ett initialt generellt screeningtest av befolkningen, med eller utan Pap smear, för att
identifiera kvinnor med ökad risk för att utveckla cervixcancer eller befintlig höggradig
cervixsjukdom. HPV-diagnos är i ökande grad indikativ för cervixsjukdom med ökande ålder.
3. Som ett uppföljningstest för patienter med onormala resultat från Pap smear eller cervixsjukdom
för att utröna behovet av remiss för kolposkopi eller andra uppföljningsåtgärder.
4. Som ett uppföljningstest för patienter med testresultaten låggradig skvamös intraepitellesion
(LSIL) eller höggradig skvamös intraepitellesion (HSIL) från Pap smear innan kolposkopi utförs.
För dessa patienter kommer ett hc2 HPV-resultat att hjälpa läkaren handlägga patienterna genom
att bidra med en riskbedömning av kvinnorna för att utesluta höggradig sjukdom.
hc2 högrisk HPV DNA Test ska användas tillsammans med klinisk information från andra diagnostiska
och screeningtester, fysisk undersökning och full anamnes i enlighet med lämpliga procedurer för
patientskötsel. hc2 högrisk HPV DNA Test-resultat ska inte utgöra den enda grunden för klinisk
bedömning och behandling av patienter.
1
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING
Närvaron av vissa HPV-typer i kvinnans genitaltrakt är associerade med ett antal sjukdomar, inklusive
1-3
kondylom, Bowenoid papulos, och intraepitelcancer i cervix, vagina, vulva och karcinom. Det är allmänt
accepterat att dessa virus övervägande är sexuellt överförda och att högrisktyperna av HPV har visats
4-8
vara den största riskfaktorn för utveckling av cervixcancer.
Humana papillomvirus består av en ikosahedral viruspartikel (virion) som innehåller en dubbelsträngad,
cirkulär DNA-molekyl med 8000 baspar, omgiven av ett kapsidprotein. När epitelceller infekterats,
etableras virus-DNA genom epitelets hela skikt, men intakta virion finns endast i vävnadens övre skikt.
Således kan viralt DNA finnas antingen i virion eller som episomala eller integrerade HPV-sekvenser,
beroende på typen och graden av lesion.
Hitintills kan HPV inte odlas in vitro och immunologiska tester är otillfredsställande för att fastställa
närvaro av HPV-infektion i cervix. Indirekta bevis på anogenital HPV-infektion kan erhållas medelst fysisk
undersökning och genom närvaro av karakteristiska cellförändringar, associerade med virusreplikation, i
Pap smear eller biopsiprover. Alternativt kan biopsier analyseras med nukleinsyrehybridisering för att
direkt detektera närvaron av HPV DNA.
8-10
Historiskt så har HPV 16 och HPV 18 ansetts vara HPV-typer förenade med hög risk för cancer.
HPV-typerna 31, 33 och 35 har visats vara delvis förenade med cancer2,11-14, vilket beror på det faktum att
dessa typer detekteras mer frekvent vid höggradig skvamös intraepitellesioner än vid cancer. Därför är
cancer förorsakad av förekomst av dessa typer mindre troliga än vid förekomst av högrisk HPV DNA38
21,34
Andra HPV
typer. Dessa fem HPV-typer svarar tillsammans för ungefär 73 % av HPV-infektioner.
DNA-typer, inklusive typerna 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 och 68, har identifierats såsom de huvudsakliga
15-20,30-34
HPV som detekterats i återstoden av lesionerna.
Dessa HPV-typer kan också kategoriseras i låg-,
mellan- och högriskgrupper baserade på deras relativa distribution i olika kategorier av histopatologiska
21, 30-35
diagnoser.
Det har visats att HPV DNA är närvarande i cirka 10 % hos kvinnor med normalt cervixepitel men den
faktiska prevalensen i specifika grupper av kvinnor är starkt påverkad av ålder och andra demografiska
variabler2,10,21,29. Prospektiva studier har visat att 15–28 % av HPV DNA-positiva kvinnor utvecklade
22,23
skvamös intraepitelcancer (SIL) inom två år jämfört med endast 1–3 % av HPV-negativa kvinnor.
I synnerhet var risken för progression med HPV-typerna 16 och 18 större (ungefär 40 %) än för andra
22
HPV-typer.
2
TESTPRINCIP
hc2 högrisk HPV DNA Test som använder hybridinfångning 2 teknik är en
nukleinsyrehybridiseringsanalys med signalförstärkning som använder kemiluminescens på
mikrotiterplatta för detektion. Prover som innehåller mål-DNA hybridiserar med en specifik HPV RNAprob. De resulterande RNA:DNAhybriderna binder till en brunn täckt med antikroppar specifika för
RNA:DNAhybrider. De immobiliserade hybriderna får därefter reagera med alkaliskt fosfataskonjugerade
antikroppar specifika för RNA:DNAhybriderna och detekteras med ett kemiluminescenssubstrat. Flera
molekyler av alkaliskt fosfatas konjugeras till varje antikropp. Flera konjugerade antikroppar binds till varje
bunden hybrid vilket resulterar i en avsevärd signalförstärkning. När substratet klyvs av det bundna
alkaliska fosfataset emitteras ljus som mäts såsom relativa ljusenheter (RLU) med en luminometer.
Ljusets emitterade intensitet anger frånvaro eller närvaro av mål-DNA i provet.
Ett mätresultat av RLU som är lika med eller större än cutoff-värdet indikerar närvaro av högrisk HPV
DNA-sekvenser i provet. Ett mätresultat av RLU som är mindre än cutoff-värdet indikerar frånvaro av de
specifika högrisk HPV DNA-sekvenserna som testas eller HPV DNA-nivåer som ligger under analysens
detektionsgräns.
®
Högkapacitetstestning med hc2 högrisk HPV DNA Test kan utföras med hjälp av Rapid Capture System
(RCS). Instrumentet kan behandla upp till 352 prover på åtta timmar. För att möjliggöra
högkapacitetstestning utförs analysens samtliga moment med RCS, med undantag av denaturering av
prover, kemiluminescent signaldetektion och resultatrapportering.
3
MEDFÖLJANDE REAGENS OCH MATERIEL
Det finns 96 tester i en sats hc2 högrisk HPV DNA Test (
varierar beroende på hur många gånger satsen används:
5197-1330). Antalet patientresultat
1 gång = 88 patientresultat
2 gång = 80 patientresultat
3 gång = 72 patientresultat
4 gång = 64 patientresultat
1 x 0,35 ml Indikatorfärg
Innehåller 0,05 % vikt/vol natriumazid.
1 x 50 ml
Reagens för denaturering
Spädd natriumhydroxidlösning (NaOH).
C
1 x 5 ml
Spädningsvätska för prob
Buffertlösning med 0,05 % vikt/vol natriumazid.
1 x 200 µl
Högrisk HPV-prob
HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 RNA-prob i buffertlösning (röd kapsyl).
1 x 1 ml
Lågrisk HPV kvalitetskontroll
5 pg/ml (500 000 kopior/ml) klonad HPV 6 DNA och bärar-DNA i transportmedium för prover
med 0,05 % vikt/vol natriumazid.
1 x 1 ml
Högrisk HPV kvalitetskontroll
5 pg/ml (500 000 kopior/ml) klonad HPV 16 DNA och bärar-DNA i transportmedium för prover
med 0,05 % vikt/vol natriumazid.
1 x 2,0 ml
Negativ kalibrator
Bärar-DNA i transportmedium för prover med 0,05 % vikt/vol natriumazid.
1 x 1,0 ml
Högrisk HPV kalibrator
1 pg/ml klonad HPV 16 DNA och bärar-DNA i transportmedium för prover med 0,05 % vikt/vol
natriumazid.
1X1
Fångande mikrotiterplatta
Belagd med anti-RNA:DNA-hybridantikroppar.
1 x 12 ml
Detektionsreagens1
Alkaliskt fosfataskonjugerade antikroppar för RNA:DNA-hybrider i buffertlösning med 0,05 %
vikt/vol natriumazid.
1 x 12 ml
Detektionsreagens 2
®
CDP-Star med Emerald II (kemiluminescenssubstrat).
1 x 100 ml Tvättbuffertkoncentrat
Innehåller 1,5 % vikt/vol natriumazid.
T
4
NÖDVÄNDIGA TILLBEHÖR SOM EJ MEDFÖLJER
Diagnostisk in vitro-utrustning och tillbehör för hybridinfångningssystemet
A
®
Digene Microplate Luminometer 2000 (DML 2000™)
instrument med PC-system, skrivarkabel, skrivare,
användarhandbok till DML 2000™ instrument och
programvara version 2 och interaktiv operatörshandledning
till Digene Hybrid Capture System version 2 (DHCS v.2)
(4.01 eller senare version av DML 2000 analysprotokoll för
HPV krävs)
Roterande skak I till hybridinfångningssystemet
Värmeblock för mikrotiterplattor till hybridinfångningssystemet
Automatisk tvättapparat för plattor för
hybridinfångningssystemet
B
MST Vortexer 1 eller 2 i hybridinfångningssystemet (tillval)
Konversionsställ och lock (tillval)
Digene provrörsställ och lock (tillval)
C
EXPAND-4™ pipett och ställ (tillval)
Hybrid Capture Cervical Sampler eller DNAPap Cervical
D
Sampler
E
Rapid Capture -system (tillval för högkapacitetstestning)
Tvättapparat
Mikrotiterplattor för hybridisering
Lock för mikrotiterplattor
Tomma strips för mikrotiterplattor (från Costar, modellnr. 2581),
tillval för användning med automatisk tvättapparat för plattor)
Extra långa pipettspetsar för uttagning av prover
Provtagningsrör
Ställ för provtagningsrör
Skruvlock för provtagningsrör
Reagensbehållare för engångsbruk
®
DuraSeal plastfilm för försegling av rör
Mikrorör för hybridisering
Mikrorörsställ
Plattlock
Dispenser för rörförseglingsfilm och avskärningsanordning
(tillval, används med MST Vortexer 1 eller 2)
Extra utrustning och tillbehör för behandling av prover i
PreservCyt-lösning
Utrustning och tillbehör för allmänt laboratoriebruk
65 ± 2 °C vattenbad som rymmer antingen 1 konversionsställ
(36 x 21 x 9 cm) eller provrörsställ
Mikrocentrifug (tillval för centrifugering av probflaskor för
maximal probvolym)
Vortexblandare med koppfäste
Enkanalsmikropipett; variabel inställning för volymer 20-200 µl
och 200-1000 µl
®
Repeterande PD-pipett såsom Eppendorf Repeater Pipette
eller likvärdig
8-kanalspipett: variabla inställningar för 25-200 µl
Timer
Natriumhypokloritlösning, 5 % vol/vol (eller hushållsblekmedel)
®
Parafilm eller likvärdigt
Engångspipettspetsar med aerosolfilter för enkanalspipett
(20-200 µl och 200-1000 µl)
®
Engångsspetsar för Eppendorf Repeater Pipette
(25 och 500 µl)
Engångsspetsar för 8-kanalspipett (25 till 200 µl)
®
Kimtowels torkduk eller likvärdiga luddfria pappershanddukar
Bänkskydd för engångsbruk
Puderfria handskar
5 ml och/eller 15 ml rundbottnade polypropylenrör med
snäpplock (för spädning av prob)
2,0 ml polypropylenrör med lock för mikrocentrifug
Svängrotorscentrifug som når 2900 ± 150 x g och rymmer
koniska polypropylenrör på 10 eller 15 ml för centrifugering
5 ml serologiska pipetter eller överföringspipetter
A
hc2 Sample Conversion Kit
Engångsspetsar för Eppendorf Repeater® (50 och 100 µl)
För manuellt blandningsförfarande:
F
Provrör för hc2 Sample Conversion (15 ml koniska) , Sarstedt
10 ml koniska rör med lock eller 15 ml centrifugrör med
lock och konisk botten av polypropylen av märke VWR eller
Corning®
Rörställ för koniska rör på 10 eller 15 ml
För MST Vortexer 2-förfarande
F
Provrör för hc2 Sample Conversion (15 ml koniska)
MST Vortexer 2-rör
Konversionsställ och lock (specifikt för 15 ml koniska rör)
Dispenser för rörförseglingsfilm och avskärningsanordning
®
DuraSeal rörförseglingsfilm (används med MST Vortexer 2)
Ytterligare utrustning och tillbehör för provbehandling med Surepath-konserveringsvätska
Svängrotorscentrifug som når 800 ± 15 x g och rymmer koniska polypropylenrör på 15 ml för centrifugering
F
Provrör för hc2 Sample Conversion (15 ml koniska rör)
7 ml överföringspipetter med standardspetsar eller likvärdigt
QIAGEN transportmedum för prover
Engångsspetsar för Eppendorf Repeater® Pipette (100 µl)
A
B
C
D
E
F
Endast utrustning och tillbehör som validerats med hc2 högrisk HPV DNA Test kan erhållas från QIAGEN.
Behövs även för den halvautomatiska RCS-metoden.
Kundens egen utrustning. Andra expanderbara multikanalspipetter kan användas förutsatt att ett spetsavstånd på 3,2 cm kan
uppnås i expanderat läge. Alternativt kan en enkanalspipett med en pipetteringskapacitet på 75 µl användas.
Prestandaegenskaper för hc2 högrisk HPV DNA Test har fastställts endast med de nämnda provtagningssatserna.
Se användarhandboken till Rapid Capture-systemet för anvisningar som är specifika för användning av systemet för
högkapacitetstestning med denna analys.
®
Provrör för hc2 Sample Conversion (av märke VWR eller Corning ) som kan beställas från QIAGEN måste användas för att
korrekt analysprestanda ska uppnås vid användning av MST Vortexer 2-förfarandet.
5
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
LÄS ALLA INSTRUKTIONER NOGGRANT INNAN TESTET ANVÄNDS
Se symbolförteckningen på denna cd-romskiva för förklaringar av symboler som används på etiketter.
SÄKERHETSFÖRESKRIFTER
ALLA PROVER ska behandlas som potentiellt smittförande. Ingen känd testmetod kan helt garantera att
prover inte överför infektion. Det rekommenderas att humanprover handhas enligt gällande
nationella/lokala säkerhetsföreskrifter för biologiska ämnen. Följ dessa säkerhetsföreskrifter för biologiska
ämnen som innehåller eller kan misstänkas innehålla smittsamt materiel. Dessa försiktighetsåtgärder
inkluderar, men begränsas inte till det följande:
1. Pipettera inte med munnen.
2. Rök, ät eller drick inte i de lokaler som reagenser eller prover handhas.
3. Använd puderfria engångshandskar när du handskas med reagenser eller prover. Tvätta
händerna noggrant när testet slutförts.
4. Rengör och desinficera allt spill från prover med ett desinfektionsmedel som har tuberkulocid
40,41
effekt såsom 0,5 % v/v natriumhypoklorit, eller annat lämpligt desinfektionsmedel.
5. Dekontaminering och avfallshantering av prover, reagenser och annat potentiellt kontaminerat
materiel ska ske enligt gällande nationella och lokala föreskrifter.
Vissa reagenser innehåller natriumazid. Natriumazid har rapporterats bilda bly- eller kopparazid i
laboratoriers avloppssystem. Dessa azider kan explodera vid slag t.ex. med hammare. För att förebygga
uppkomsten av bly- eller kopparazid ska avlopp spolas ordentligt med vatten efter borthällning av
lösningar som innehåller natriumazid. För att ta bort föroreningar från äldre avloppssystem som misstänks
ha ackumulering av azider rekommenderar US Occupational Safety and Health Administration följande:
(1) sug upp vätskan från vattenlåset med en gummi- eller plastslang, (2) fyll på med 10-procentig vol/vol
natriumhydroxidlösning, (3) låt stå i 16 timmar och (4) spola rikligt med vatten.
6
INFORMATION OM SÄKERHET OCH HÄLSORISKER
Materielen nedan har utvärderats enligt kraven i EC-direktiven 2001/59/EC och 99/45/EC.
Försiktighet: Spädningsvätska för prob kan orsaka övergående ögonirritation. Vid kontakt
med ögonen, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Använd
ögon/ansiktsskydd. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart
läkare. Visa om möjligt etiketten.
Tvättbuffertkoncentratet innehåller natriumazid och klassificeras enligt tillämpligt EC-direktiv
som: Giftigt (T). Nedan följer tillämpliga risk- (R) och säkerhetsfraserna (S).
R25: Giftigt vid förtäring.
T R32: Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra.
S36/37/39: Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar samt skyddsglasögon eller
ansiktsskydd.
S45: Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa
om möjligt etiketten.
Reagens för denaturering innehåller natriumhydroxid och klassificeras enligt tillämpligt
EC-direktiv som: Frätande (C). Nedan följer tillämpliga risk- (R) och säkerhetsfraserna (S).
R35: Starkt frätande.
C S26: Vid kontakt med ögonen, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare.
S36/37/39: Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar samt skyddsglasögon eller
ansiktsskydd.
S45: Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa
om möjligt etiketten.
Se användarhandboken till Rapid Capture-systemet för ytterligare varningar och
försiktighetsåtgärder som är specifika för användning av systemet för högkapacitetstestning med
denna analys.
ANVÄNDNINGSFÖRESKRIFTER
1. För in vitro-diagnostisk användning
2. Cervixborste ska endast användas för kvinnor som inte är gravida.
på ytterkartongens
3.
Använd inte reagenser efter det utgångsdatum som anges vid symbolen
etikett.
4.
Om analysen görs utanför de angivna tids- och temperaturintervallen kan resultaten bli ogiltiga.
Analyser som inte gjorts inom de fastställda tids- och temperaturintervallen måste göras om.
5.
Testförfarandet för hc2 högrisk HPV DNA, kriterier för verifikation av analyskalibrering,
kvalitetskontroll och tolkning av provresultat måste noggrant följas för att pålitliga testresultat ska
erhållas.
6. Det är viktigt att pipettera den indikerade reagensvolymen exakt och att blanda väl efter
tillsättning av varje reagens. Underlåtenhet att utföra detta kan resultera i felaktiga testresultat.
Kontroll av att de angivna färgförändringarna inträffar bekräftar att dessa villkor har uppfyllts.
7. Satskomponenterna har testats som en enhet. Byt inte ut komponenter mot komponenter från
andra källor eller andra satser.
8. Nukleinsyror är mycket känsliga för degradering från nukleaser i omgivningen. Nukleaser finns på
människohud och på ytor eller materiel som har vidrörts av människor. Rengör och täck
arbetsytor med bänkskydd för engångsbruk och använd puderfria handskar för analysens alla
moment.
7
9. Försiktighet ska iakttas under analysens utförande för att förhindra kontaminering av den
fångande mikrotiterplattan och detektionsreagens 2 med exogent alkaliskt fosfatas. Substanser
som kan innehålla alkaliskt fosfatas inkluderar detektionsreagens 1, bakterier, saliv, hår och oljor
från huden. Att den fångande mikrotiterplattan täcks efter tvättmomentet och under
inkuberingen med detektionsreagens 2 är speciellt viktigt eftersom alkaliskt fosfatas kan
reagera med detektionsreagens 2 och ge falskt positiva resultat.
10. Skydda detektionsreagens 2 från långvarig exponering för direkt ljus. Använd detektionsreagens
2 omedelbart efter alikvotering och undvik direkt solljus.
11. Den repeterande pipetten ska fyllas före pipettering av reagens och regelbundet kontrolleras för
stora luftbubblor. Alltför stora luftbubblor i den repeterande pipettens spets kan medföra felaktig
volym, vilket kan undvikas genom att fylla pipetten, dispensera all vätska och återfylla. Se
pipettleverantörens bruksanvisningar för utförligare instruktioner.
12. Multikanalspipettering för dispensering av detektionsreagens 1 och 2 ska utföras med den
omvända pipetteringstekniken (se Hybriddetektion). Kontrollera att varje pipettspets på
multikanalspipetten är riktigt fastsatt och påfylld.
13. Se till att varje brunn på den fångande mikrotiterplattan har tvättats ordentligt såsom anges i
instruktionerna för manuell tvätt. Otillräcklig tvätt medför ökat bakgrundsbrus och kan ge upphov
till falskt positiva resultat. Kvarvarande tvättbuffert i brunnarna kan ge en minskad signal eller
dålig reproducerbarhet.
14. Vänta minst 60 minuter efter en kallstart för att värmeblocket för mikrotiterplatta I för
hybridinfångningssystemet ska stabiliseras vid 65 °C ± 2 °C. Om denna uppvärmningsperiod inte
utförs kan mikrotiterplattan för hybridisering smälta. Se användarhandboken Värmeblock för
mikrotiterplatta I för ytterligare information.
8
REAGENSTILLVERKNING OCH FÖRVARING
1. När satsen mottagits, förvara den vid 2-8 °C. Tvättbuffertkoncentratet, reagens för denaturering
och indikatorfärg kan enligt önskemål förvaras vid 2-30 °C.
2. Använd inte efter utgångsdatumet som anges vid symbolen
på kartongens etikett eller
utgångsdatumet för de beredda reagenserna (se nedan).
3. Alla reagenser är färdiga för användning utom reagens för denaturering och högrisk HPV-prob,
och tvättbuffertkoncentrat.
För högkapacitetstestning, se användarhandboken till Rapid Capture-systemet beträffande
beredning av högrisk HPV-probblandning, tvättbuffert, detektionsreagens 1 och
detektionsreagens 2. De anvisningarna är specifika för användningen av systemet för
högkapacitetstestning.
REAGENS
TILLVERKNINGSMETOD
Reagens för
denaturering
Tillverka först:
Tillsätt 5 droppar indikatorfärg till flaskan med reagens för denaturering och blanda ordentligt. Reagenset
för denaturering ska ha en genomgående, mörkviolett färg.
När det väl är berett så är reagens för denaturering stabilt i tre månader om det förvaras vid 2-8 °C. Märk
det med det nya utgångsdatumet. Om färgen bleknar, tillsätt ytterligare 3 droppar indikatorfärg och blanda
väl före användning.
Varning: Reagens för denaturering är frätande. Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar samt
skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Var försiktig vid hanteringen.
Högrisk HPVprobblandning
(beredd av
högrisk HPVprob och
reagenser för
spädningsvätska
för prob)
Tillverkas under inkubationsdenatureringen av prov:
Viktigt: Ibland fastnar proben i flaskans lock.
OBS: Utomordentlig försiktighet ska iakttas i detta steg för att förhindra RNas kontaminering av prob och
probblandning. Använd pipettspetsar med aerosolfilter för att pipettera prob. Spädningsvätskan för prob
är viskös.
Försiktighet ska iakttas för att tillförsäkra ordentlig blandning när högrisk HPV-prob bereds. En
synlig virvel måste bildas i vätskan under blandningssteget. Otillräcklig blandning kan ge en
minskad signal.
•
Centrifugera flaskan kortvarigt med högrisk HPV-prob för att få vätskan till flaskans botten. Slå
lätt på flaskan för att blanda.
•
Bestäm den erforderliga mängden probblandning (25 µl/test). Det rekommenderas att extra
probblandning görs för att kompensera för den volym som kan förloras i pipettspetsar eller till
flaskans sida. Se föreslagna volymer i listan nedan. Det minsta antalet rekommenderade brunnar
för varje användningstillfälle är 24. Om färre än 24 brunnar per analys önskas så kan det totala
antalet tester per sats minskas pga. begränsade volymer av prob och spädningsvätska för prob.
•
Överför den erforderliga volymen spädningsvätska för prob till en ny engångsbehållare. Beroende
på antalet tester så rekommenderas antingen ett 5 ml eller 15 ml rundbottnat polypropylenrör
med lock. För att bereda probblandning gör en spädning 1:25 av högrisk HPV-prob i
spädningsvätska för prob.
Volym spädningstester/strips
vätska för prob*
Probvolym*
96/12
4,0 ml
160,0 µl
72/9
3,0 ml
120,0 µl
48/6
2,0 ml
80,0 µl
24/3
1,0 ml
40,0 µl
Per brunn
0,045 ml
1,8 µl
*Dessa värden inkluderar den rekommenderade extravolymen.
•
Pipettera högrisk HPV-prob till spädningsvätska för prob genom att placera pipettspetsen mot
rörets innervägg precis ovanför menisken och töm innehållet. Doppa inte ned spetsen i
spädningsvätskan för prob.
•
Blanda under minst fem sekunder med maximal hastighet för att blanda ordentligt. En synlig
virvel måste bildas. Märk som “Högrisk HPV-probblandning" och förvara i ren, tillsluten behållare
tills du är klar att använda den. Oanvänd probblandning ska kasseras.
9
Tvättbuffert
TILLVERKA UNDER INFÅNGNINGSSTEGET:
Tvättbuffert för hybridinfångningssystemets automatiserade tvättapparat för plattor I kan
beredas såsom beskrivs nedan och förvaras i en täckt behållare eller tillverka 1 liter åt gången
och häll den i behållaren på den automatiserade tvättapparaten för plattor I. Se tabellen nedan
för blandningsvolymer:
För anvisningar om skötsel och underhåll, se användar- och underhållshandboken till automatisk
tvättapparat för plattor I.
Varning: Tvättbuffertkoncentrat är giftigt att förtära. Använd lämpliga skyddskläder, handskar,
ögon/ansiktsskydd. För minsta möjliga exponering, tillsätt vatten till tvättbuffertkoncentratet vid
beredningen.
Mängd tvättbuffertkoncentrat
Mängd destillerat eller
avjoniserat vatten
Slutlig volym
tvättbuffert
33,3 ml
66,6 ml
100 ml
966,7 ml
1 933,4 ml
2 900 ml
1L
2L
3L
OBS: Det är mycket viktigt att strömmen till den automatiska tvättapparaten för plattor I är
påslagen hela tiden. Det medger att underhållssköljning kan utföras när den inte använts
på åtta timmar.
Före varje analys se till att avfallsbehållaren till den automatiska tvättapparaten för plattor
I är tom och att sköljbehållaren är fylld med destillerat eller avjoniserat vatten.
Metod för manuell tvättning av plattor:
•
•
•
Blanda tvättbuffertkoncentratet väl.
Späd 100 ml tvättbuffertkoncentrat med 2,9 liter destillerat eller avjoniserat vatten i
tvättapparaten och blanda väl (slutlig volym ska vara 3 liter).
Försegla behållaren för att förebygga kontaminering eller avdunstning.
När tvättbufferten är beredd är den stabil i tre månader vid 2-30 °C. Märk den med det nya
utgångsdatumet. Om tvättbufferten har kylts ned, låt den komma i jämvikt vid20-25 °C innan den
används.
Det rekommenderas att tvättapparaten och rörledningar rengörs med 0,5 %
natriumhypokloritlösning och sköljs ordentligt med destillerat eller avjoniserat vatten var tredje
månad för att förebygga möjlig kontaminering från alkaliskt fosfatas som finns i bakterier och
mögel.
VOLYMER FÖR ANVÄNDNINGSFÄRDIGA REAGENSER
Detektionsreagens 1 &
detektionsreagens 2
OMEDELBART FÖRE ANVÄNDNING:
Blanda reagenset ordentligt och häll därefter försiktigt de tillämpliga volymerna av
detektionsreagens 1 eller detektionsreagens 2 i en ren reagensbehållare enligt riktlinjerna
nedan. För att undvika kontamination FÅR dessa reagenser INTE hällas tillbaka till
originalflaskorna. Kassera oanvänt materiel efter användning. Om en 8-kanalspipett inte
används kan en lämplig repeterande pipett användas i stället. I detta fall ska alikvoter av
reagenset tillsättas ett polypropylenrör av tillräcklig storlek för att hålla den nödvändiga volym
såsom anges nedan.
Antal
tester/strips
96/12
72/9
48/6
24/3
1 test
Volym detektionsreagens
1 eller 2
flaskans innehåll
7,0
ml
5,0
ml
3,0
ml
0,125
ml
10
PROVTAGNING OCH PROVHANTERING
Cervixprover som tagits och transporterats med hjälp av DNAPap Cervical Sampler eller HC Cervical
Sampler (båda bestående av en cervixborste och transportmedium för prover) eller prover som tagits med
en provtagningsanordning av kvasttyp eller en kombination av borste och spatel och placerade i Cytyc
PreservCyt-lösning eller cervixprover som tagits i Tripath Imaging Surepath-konserveringsvätska är de
enda prover som rekommenderas för användning med hc2 högrisk HPV DNA Test. Prover som tagits
med andra provtagningsanordningar eller transporterats i annat transportmedium har inte godkänts för
användning med denna analys. Den här satsens prestandaegenskaper har endast fastställts med de
nämnda provtagningssatserna. Cervixprover måste tas före applikation av ättiksyra eller jod om
kolposkopiundersökning utförs. Se bipacksedeln till DNAPap Cervical Sampler eller HC Cervical
Sampler™ för ytterligare provtagnings- och provhanteringsrutiner.
CERVIXPROVER I STM
STM-prover kan förvaras i rumstemperatur i upp till två veckor och transporteras utan kylning till
testlaboratoriet. Proverna ska transporteras i en isolerad behållare med över-natten-leverans eller
tvådagars leverans. På testlaboratoriet ska prover förvaras vid 2-8 °C om analysen ska utföras inom en
vecka. Om analysen ska utföras senare än efter en vecka, ska proverna förvaras vid -20 °C i upp till tre
månader (se Observera under Cervixbiopsier, före nedfrysning). Ett konserveringsmedel har tillsatts
transportmedium för prover för att hämma bakteriell tillväxt och för att behålla DNA:s integritet. Det är inte
avsett att bevara organismers eller cellers duglighet.
CERVIXBIOPSIER
Nytagna cervixbiopsier 2-5 mm i tvärsnitt kan också analyseras med hc2 högrisk HPV DNA Test. Nytagna
cervixbiopsier måste omedelbart placeras i 1,0 ml av transportmedium för prover och förvaras fryst vid
-20 °C. Biopsiprover kan skickas vid 2-30 °C över natt för leverans nästa dag till testlaboratoriet och
förvaras vid -20 °C tills de ska användas. Biopsier som är mindre än 2 mm i diameter ska inte användas.
OBS: För att förhindra att locket lossnar på provrör som transporteras eller förvaras frysta:
®
• Täck locken med Parafilm före transport av provrör som varit frysta. Prover kan transporteras
frysta eller vid 20-25 °C.
• När prover tas ur frysen för test ska locket omedelbart bytas ut mot skruvlock för
provtagningsrör.
CERVIXPROVER I CYTYC PRESERVCYT-LÖSNING
Prover som tagits med hjälp av en provtagningsanordning av kvasttyp eller kombination av borste/spatel
och placerade i PreservCyt-lösning för att göra ThinPrep® Pap Test på objektglas kan användas i hc2
högrisk HPV DNA Test. Prover ska tas på ett rutinmässigt sätt och ThinPrep Pap Test på objektglas ska
beredas enligt Cytycs instruktioner.
Det måste finnas minst 4 ml PreservCyt-lösning kvar för hc2 högrisk HPV DNA Test. Prover med mindre
än 4 ml kvar efter det att Pap test har beretts kan innehålla för lite materiel och kan ge falskt negativa
resultat i hc2 högrisk HPV DNA Test.
Prover i PreservCyt-lösning kan förvaras i upp till tre månader, efter provtagning och före beredning för
hc2 högrisk HPV DNA Test, vid temperaturer mellan 2 °C och 30 °C. Prover i PreservCyt-lösning kan inte
frysas. För beredning av dessa prover, se Prepareringsförfarande för prover i PreservCyt-lösning.
CERVIXPROVER I SUREPATH-KONSERVERINGSVÄTSKA
Prover som tagits i SurePath-konserveringsvätska enligt standardförfaranden ger ett ut-ur-flaskanalternativ för att testa närvaron av högrisk HPV DNA från samma prov som används för att bereda
®
objektglas för cytologisk undersökning med TriPath Imaging PrepStain™ Slide Processor. Cervixprover
bör tas på ett rutinmässigt sätt och cytologiska objektglas med tunt lager ska beredas enligt
instruktionerna i användarhandboken till PrepStain Slide Processor-systemet.
11
TESTFÖRFARANDE
Prover kan innehålla smittsamma ämnen och ska hanteras i enlighet därmed. hc2 högrisk HPV
DNA Test kan utföras manuellt enligt anvisningarna på bipacksedeln eller med RCS-instrumentet för
högkapacitetstestning.
HÖGKAPACITETSTESTNING MED ANVÄNDNING AV RAPID CAPTURE-SYSTEMET
RCS (Rapid Capture System) är ett automatiserat pipetterings- och spädningssystem för allmän
användning som kan användas med hc2 högrisk HPV DNA Test för högkapacitetstestning. Systemet kan
hantera upp till 352 prover på åtta timmar, vari ingår en 3,5-timmarsperiod då inget ingripande krävs. Upp
till 704 provresultat kan genereras på 13 timmar. Denatureringen av prover som förberedelse för testning
utförs oberoende av RCS, i det primära provtagningsröret, som vid den manuella metoden för hc2 högrisk
HPV DNA Test som beskrivs nedan, innan proverna ställs på RCS-plattformen. Dessutom utförs
kemiluminescent signaldetektion och resultatrapportering med ett offline luminometersystem [Digene
Microplate Luminometer (DML 2000™) Instrument] som är gemensamt för både den manuella metoden
och RCS-metoden. Var och ett av momenten i hc2 högrisk HPV DNA Test utförs i exakt samma sekvens
som vid det manuella testförfarandet. Vid RCS-metoden kan upp till fyra mikrotiterplattor behandlas i
överlappande sekvens. Varje platta innehåller prover och nödvändiga analyskalibratorer och
kvalitetskontroller.
Vid användning av systemet, läs handboken till Rapid Capture-systemet vid sidan av denna
bipacksedel för att få nödvändig information om och beskrivning av förfarandet.
INSTÄLLNING
1. Om värmeblocket för mikrotiterplatta I används, vänta minst 60 minuter från en kallstart för att
det ska komma i jämvikt vid 65 ± 2 °C . Se Användarhandboken för värmeblock för
mikrotiterplatta I för detaljer.
2. Kontrollera att vattenbadet är 65 °C varmt och att vattennivån är tillräckligt hög för att täcka hela
volymen i provrören.
3. Tag ut proverna och alla behövliga reagenser från kylskåpet innan analysen påbörjas. Tillåt
dessa att uppnå 20-25 °C under 15 till 30 minuter.
OBS: Bered proverna i PreservCyt-lösning och SurePath innan du låter redan denaturerade
prover och satsreagens komma i jämvikt vid rumstemperatur.
4. Gör en layout för plattan med hjälp av programmet Digene Hybrid Capture System Version 2
(DHCS v.2) eller Digene kvalitativ programvara. Se användarhandboken för respektive program
för anvisningar om hur du gör en layout för plattan.
5. Placera kalibratorer, kvalitetskontroller och prover som ska testas i ett provrörsställ, i samma
ordning som de ska testas. Den negativa kalibratorn och högrisk HPV-kalibratorn måste
testas FÖRST. Negativ Kalibrator (NK), högrisk HPV-kalibrator (HRK), lågrisk kvalitetskontroll
(KK1-LR), högrisk kvalitetskontroll (KK2-HR) och prover ska köras i en konfiguration med åtta
kolumner av mikrotiterplattbrunnar. Se Exempel på layout nedan.
Exempel på layout för en analys med 24 mikrotiterplattbrunnar:
Kolumn
Rad
1
2
3
NK
Prov 1
Prov 9
A
NK
Prov 2
Prov 10
B
NK
Prov 3
Prov 11
C
HRK
Prov 4
Prov 12
D
HRK
Prov 5
Prov 13
E
HRK
Prov 6
Prov 14
F
KK1-LR
Prov 7
Prov 15
G
KK2-HR
Prov 8
Prov 16
H
12
6. NK och HRK testas trefaldigt och KK1-LR och KK2-HR en gång med högrisk HPV-probblandning.
Digene programvara bestämmer positionerna på mikrotiterplattan för kalibratorer och
kvalitetskontroller. Se användarhandboken för DML 2000 instrument och programvara version 2
och Digene Hybrid System (DHCS V.2) interaktiv operatörshandledning till programvara version 2
eller användarhandboken för Digene kvalitativ programvara för hur man ställer in programvaran
rätt för kalibrator/kvalitetskontroll/prov.
DENATURERING
OBS:
•
•
•
•
•
•
•
Varning: Reagens för denaturering är frätande. Var försiktig och använd puderfria handskar vid
hanteringen.
Viktigt: Vissa cervixprover kan innehålla blod eller annat biologiskt materiel, vilket kan maskera
färgförändringarna när reagens för denaturering tillsätts. Prover som uppvisar en mörk färg före
tillsättningen av reagens för denaturering kanske inte visar den korrekta färgförändringen i detta
steg. I dessa fall även om den avsedda färgförändringen inte inträffar så påverkar detta inte
analysens resultat. Att blandning utförts korrekt kan verifieras genom att observera färgförändring
på kalibratorer och kvalitetskontrollerna.
Se till att vattennivån i vattenbadet under denaturerings- och hybridiseringsmomenten är tillräcklig
för att sänka ned rörets hela provvolym.
Kalibratorer, kontroller, och prover kan beredas upp till och med denatureringssteget och förvaras
vid 2-8 °C över natten eller i upp till tre månader vid -20 °C. Maximalt så kan tre
frys/upptiningscykler göras med max. två timmar i rumstemperatur för varje upptiningscykel.
Blanda väl före användning.
26
Efter denaturering och inkubering anses prover inte längre vara smittsamma.
Laboratoriepersonal ska dock fortfarande följa nationella/lokala försiktighetsåtgärder.
Tag inte bort provtagningsanordning före denaturering.
För att undvika falskt positiva resultat är det mycket viktigt att alla kalibrator-, kvalitetskontroll- och
STM-provmateriel kommer i kontakt med reagenset för denaturering. Blandning efter att
reagenset för denaturering tillsatts är ett kritiskt moment: Se till att MST Vortexer är inställd på
100 (maximal hastighet) och att en synlig vätskevirvel som sköljer vätska över rörets hela
inneryta kan ses under blandningen. Om blandning utförs manuellt ska man kontrollera att
varje kalibrator, kvalitetskontroll och prov blandas individuellt genom att blanda var och
en under minst fem sekunder med max. hastighet så att vätskan sköljer rörets hela
inneryta, varefter röret vänds upp och ned en gång.
Prepareringsförfarande för kalibratorer, kvalitetskontroller och STM-prover
1. Tag av och kassera locken från kalibratorer, kvalitetskontroller och STM-prover.
OBS: Lock som tas av provrören ska betraktas som potentiellt smittsamma. Kassera dem enligt
nationella/lokala bestämmelser.
2. Pipettera reagens för denaturering med indikatorfärg till varje kalibrator, kvalitetskontroll eller
STM-prov med en repeterande eller justerbar pipett. Iakttag försiktighet så att rörets sidor inte
vidrörs annars kan korskontamination av prover ske. Den volym av reagens för denaturering som
behövs är ekvivalent med halva provvolymen. Exakt volym för varje typ av kalibrator,
kvalitetskontroll och prov anges i tabellen nedan.
Späd ut resterande reagens för denaturering i en flaska innan det kasseras enligt
nationella/lokala laboratorieprocedurer.
13
Kalibrator, kvalitetskontroll eller prov
Negativ kalibrator
Högrisk HPV-Kalibrator
Lågrisk eller högrisk kvalitetskontroller
Cervixprov
Volymbehov av reagens för
denaturering
1000 µl
500 µl
500 µl
500 µl
3. Blanda proverna med en av de två metoderna nedan.
OBS: MST Vortexer I kan bara användas med prover som tagits med DNAPap Cervical Sampler
eller HC Cervical Sampler i STM (Specimen Transport Medium). Prover som tagits i
PreservCyt-lösning måste behandlas enligt anvisningarna nedan (se
Prepareringsförfarande för prover i PreservCyt-lösning).
MST Vortexer-metod (för flera provrör)
OBS: DNAPap Cervical Sampler-prover och HC Cervical Sampler-prover som blandats i MST
Vortexer I måste hybridiseras med metod med hybridiseringsmikrotiterplatta och
värmeblock för mikrotiterplatta I.
a) Täck kalibratorer, kvalitetskontroller och STM-provrören med DuraSeal® plastfilm för
förslutning av rör genom att dra filmen över rören i stället.
b) Placera provrörsställets lock över de filmtäckta rören och fäst det med de två sidspännena.
Skär av filmen med avskärningsanordningen.
c) Placera stället på MST Vortexer och fäst stället med spännet. Verifiera att hastigheten är
inställd på 100 (maximal hastighet) och ställ MST Vortexer strömbrytare i läge “PÅ”. Blanda
rören i tio sekunder.
Manuell metod för individuell blandning
a) Sätt på nya, rena skruvlock för provtagningsrör på kalibrator-, kvalitetskontroll- och provrören.
b) Blanda varje rör ordentligt genom att blanda individuellt med hög hastighet under fem
sekunder.
c) Vänd varje rör upp och ned en gång för att skölja rörets insida, lock och kant.
d) Sätt tillbaka rören i stället.
Oavsett vilken blandningsmetod som används så måste en vätskevirvel ses inne i varje rör
under blandningen så att vätskan sköljer rörets hela inneryta. Kalibratorerna,
kvalitetskontrollerna och proverna ska bli violetta.
4. Inkubera rören i provrörsstället i ett vattenbad med 65 + 2 °C under 45 + 5 minuter (denaturerade
kalibratorer, kvalitetskontroller och prover kan testas omedelbart eller förvaras såsom beskrivs
under Observera ovan). Bered högrisk HPV-probblandning under denna inkubation. Se avsnittet
Reagenstillverkning och förvaring.
Prepareringsförfarande för prover i PreservCyt-lösning
OBS:
• Se bipacksedeln till hc2 Sample Conversion Kit för fullständiga uppgifter.
• Behandling av en alikvot på 4 ml PreservCyt-lösning ger tillräcklig volym för två tester vid manuell
testning. Minsta volym som kan behandlas är 4 ml.
• Bered högst 36 prover i PreservCyt-lösning i samma sats, annars kan cellpelleten fastna när
supernatanten dekanteras. Detta är viktigt för att cellpelletens integritet ska behållas under
dekanteringen. Om fler flaskor med PreservCyt-lösning ska beredas bör det inte göras förrän den
första satsen är klar.
14
Reagenstillverkning
Använd antingen reagenset för denaturering (DNR) som medföljer hc2 högrisk HPV DNA Test (se
Reagenstillverkning och förvaring) eller det DNR som medföljer hc2 Sample Conversion Kit. För att
bereda det DNR som medföljer hc2 Sample Conversion Kit, tillsätt tre droppar indikatorfärg i flaskan med
DNR och blanda väl. Lösningen ska anta en jämn mörkt violett färg. För att avgöra hur stor volym som
behövs, använd tabell 1.
Tabell 1
Volymbehov: Reagenstillverkning
Antal tester
1-2
3
4
5
6
Volym
PreservCytlösning
4 ml
6 ml
8 ml
10 ml
12 ml
Volym
konversionsbuffert
0,4 ml
0,6 ml
0,8 ml
1,0 ml
1,2 ml
1. Märk ett hc2 Specimen Conversion-rör, ett 10 ml koniskt Sarstedt-rör eller ett 15 ml koniskt rör av
märke VWR eller Corning med lämpligt identifikationsnummer för provet.
2. Hantera ett prov åt gången:
a. Skaka PreservCyt-flaskan kraftigt tills cellerna verkar vara jämnt spridda.
b. Cellerna sjunker mycket snabbt, så pipettera omedelbart in lämplig volym PreservCyt-prov i det
märkta röret. Pipettera in PreservCyt-lösningen längst ned i det koniska röret så att så litet
cellmateriel som möjligt fastnar på insidan av röret.
3. Tillsätt lämplig volym Sample Conversion-buffert till varje rör (se tabell 1).
4. Sätt på locket igen och blanda innehållet i varje rör noga med en vortexblandare med koppfäste.
OBS: MST Vortexer 2-förfarandet har inte validerats för blandning av prover i PreservCyt-lösning
före centrifugering och därför får det inte användas i detta moment.
5. Centrifugera rören i en svängrotor vid 2 900 ± 150 x g i 15 ± 2 minuter.
6. Bered under tiden STM/DNR-blandningen (Specimen Transport Medium/reagens för denaturering) i
kvoten 2:1, enligt tabell 2.
OBS: STM/DNR-blandningen måste beredas på nytt varje dag som testet utförs.
a. För att avgöra hur mycket STM/DNR-blandning som behövs totalt, använd startvolymen för
proverna i PreservCyt-lösning och multiplicera volymen STM och DNR som behövs ”per rör” med
antalet prover som ska behandlas (se tabell 2).
Tabell 2
Volymbehov: STM/DNR
STM-volym
DNR-volym
STM/DNRper rör för
per rör för
blandning som
Volym
slutlig
slutlig
tillsätts till
Antal
PreservCytSTM/DNRSTM/DNRröret
tester
lösning
blandning*
blandning*
1-2
4 ml
120 µl
60 µl
150 µl
3
6 ml
170 µl
85 µl
225 µl
4
8 ml
220 µl
110 µl
300 µl
5
10 ml
270 µl
135 µl
375 µl
6
12 ml
320 µl
160 µl
450 µl
* Volymerna som anges i tabellen ska inte tillsättas direkt till provröret.
15
b. Blanda lösningen noga genom att använda vortexblandare.
7. Ta ut rören ur centrifugen ett i taget och ställ i ett provrörsställ eller konversionsställ. En rosa/orange
cellpellet ska finnas i botten på varje rör.
OBS: Prover som inte har en synlig cellpellet efter centrifugering kan inte användas för testning och
ska kasseras.
8. Hantera varje rör för sig:
a. Ta av locket och lägg åt sidan på en luddfri pappershandduk.
b. Dekantera supernatanten försiktigt.
c.
Håll fortfarande röret upp och ned och torka (ca sex gånger) på absorberande luddfri
pappershandduk tills det inte längre droppar någon vätska från röret. Använd ett rent område av
handduken varje gång. Låt inte cellpelleten glida ned utefter röret under avtorkningen.
OBS:
• Torka inte på samma område av den absorberande luddfria pappershandduken mer än en
gång.
• Det är viktigt att avlägsna så mycket PreservCyt-lösning som möjligt vid avtorkningen. Det är
emellertid normalt att det blir någon PreservCyt-lösning kvar efter avtorkning.
d. Placera röret i ett ställ eller i konversionsstället.
BLANDNING OCH DENATURERING
Manuellt blandningsförfarande
1. Tillsätt lämplig volym STM/DNR till varje cellpellet (se tabell 2). Sätt tillbaka locket på varje rör och
suspendera pelleten på nytt genom att blanda varje rör individuellt i minst 30 sekunder vid högsta
hastighet. Om det är svårt att få en pellet att suspenderas igen kan röret blandas i ytterligare 10-30
sekunder eller tills pelleten flyter loss från botten av röret. Om pelleten fortfarande inte är upplöst efter
ytterligare blandning (högst två minuter sammanlagt), anteckna provets identifikation och gå till nästa
moment.
2. Placera rören i ett ställ.
3.
Placera stället i ett vattenbad med 65 ± 2 °C i 15 ± 2 minuter. Se till att det finns så mycket vatten i
badet att det står över all vätska i rören.
4.
Ta ut stället med prover ur vattenbadet och blanda proven individuellt i 15-30 sekunder.
OBS: Se till att alla cellpelletar är helt suspenderade igen. Prover som fortfarande har en synlig
cellpellet kan inte användas för testning och ska kasseras.
5.
Ställ tillbaka stället i vattenbadet med 65 ± 2 °C och fortsätt denatureringen i ytterligare 30 ± 3
minuter.
6.
Fortsätt till momentet Hybridisering eller läs under Valfri stoppunkt hur denaturerade prov ska
förvaras och behandlas.
MST Vortexer 2-förfarande
OBS:
• MST Vortexer 2-förfarandet har validerats för behandling av prover i PreservCyt-lösning efter
centrifugering och dekantering av supernatanten.
• Det är bara MST Vortexer 2 som är avsedd för behandling av prover i PreservCyt-lösning. MST
Vortexer I är inte avsedd för behandling av PreservCyt-lösning, eftersom den inte är förenlig med
användning av konversionsstället med lock. Använd därför inte konversionsstället med MST
Vortexer I.
16
• Konversionsstället med lock är speciellt utformat för att rymma hc2 Sample Conversion-rören (15 ml
koniska rör av märke VWR eller Corning). Endast en rörtyp åt gången ska användas på konversionsstället. Andra märken har inte validerats för användning.
• Det är viktigt att man följer de angivna blandningstiderna för konversionsstället med lock.
• Konversionsstället med lock kan inte användas för att blanda kalibratorer eller kvalitetskontrollerna för
hc2 DNA-testsatsen. Höjden på STM-rören gör att de inte kan blandas ordentligt i konversionsstället
med lock.
1.
Efter att ha torkat av alla de märkta koniska 15 ml rören, ställ dem var och en på sin plats i
konversionsstället.
2. Tillsätt lämplig volym STM/DNR-blandning till varje cellpellet (tabell 2).
3. Täck de koniska 15 ml rören med DuraSeal förseglingsfilm genom att dra filmen över rören, där de
står i stället.
4. Lägg ställocket över de filmöverdragna rören och lås fast locket med de båda sidspännena. Skär av
filmen med avskärningsanordningen sedan locket har satts fast säkert.
5. För upp spaken med rött handtag till horisontellt läge.
6. Ställ konversionsstället på MST Vortexer 2 så att det största naggade hörnet på konversionsstället
kommer i det högra främre hörnet. Ställ stället med lock på MST Vortexer 2-plattformen så att det
sitter ordentligt mellan stöden. Sätt fast stället genom att sänka spaken med rött handtag till vertikalt
läge. Då är stället fastlåst.
7. Kontrollera att hastigheten är inställd på 100 (maxhastighet) och att vippkontakten för
momentanstyrning står i läget AV.
8. Ställ strömbrytaren för Vortexer i läget PÅ. Blanda rören i 30 sekunder.
9. Ställ strömbrytaren för Vortexer i läget AV.
10. Ta ut konversionsstället med lock ur MST Vortexer 2 genom att föra upp spaken med rött handtag.
11. Placera stället i ett vattenbad om 65 ± 2 °C i 15 ± 2 minuter. Se till att vattnet når upp över hela
vätskan i alla rören.
12. Efter 15 minuters inkubering, ta ut stället med prov ur vattenbadet.
13. För att undvika stänk, torka av det mesta av vattnet på stället innan det placeras på MST Vortexer 2.
14. Sätt fast konversionsstället med lock på MST Vortexer 2 som beskrivs i Steg 6.
15. Kontrollera att hastigheten är inställd på 100 och ställ in strömbrytaren för Vortexer i läget PÅ. Blanda
rören i en minut.
16. Ställ strömbrytaren för Vortexer i läget AV.
OBS: I MST Vortexer 2-förfarandet standardiseras blandningshastigheten, tiderna och
behandlingen. Det betyder att cellpelleten inte behöver kontrolleras visuellt, vilket måste göras
om man använder sig av manuell blandning.
17. Ställ tillbaka stället i vattenbadet om 65 ± 2 °C och fortsätt denatureringen i 30 ± 3 minuter.
18. Ta ut stället ur vattenbadet, torka av stället och sätt fast det på Vortexer.
19. Ställ strömbrytaren för Vortexer i läget PÅ. Blanda i tio sekunder på högsta inställning.
20. Ställ strömbrytaren för Vortexer i läget AV. Ta ut stället.
21. Ta omedelbart av ställocket och DuraSeal-filmen på proverna.
22. Fortsätt till momentet Hybridisering eller läs under Valfri stoppunkt hur denaturerade prov ska
förvaras och behandlas.
Prepareringsförfarande för SurePath-prover
Efter cytologisk analys kan SurePath-prover förvaras i upp till fyra veckor vid 2-30 ºC.
Efter cytologisk behandling ska man fortsätta enligt följande:
1. Se till att proverna har kommit i jämvikt vid rumstemperatur och att den observerade vätskevolymen
är cirka 2,8 ml.
17
FÖRSIKTIGHET: Om provet visar sig innehålla mindre än 1 ml vätska är det möjligt att
SurePath-konserveringsvätska inte tillsattes efter cytologi och att provet
INTE är lämpligt för högrisk HPV DNA-testning.
2. Centrifugera provet i en svängrotor vid 800 ± 15 x g i 10 ± 1 minut.
3. Ta bort rören från centrifugen.
4. Dekantera supernatanten försiktigt omedelbart efter centrifugering och torka av varje rör försiktigt
(~tre gånger) på absorberande pappershanddukar för att få bort vätska. Undersök pelleten i varje rör.
Låt inte cellpelletar glida ned i röret vid avtorkning.
5. Placera rören i stället.
6. Tillsätt 200 μl hc2 Specimen Transport Medium (STM) till varje pellet med en repeterande eller
justerbar pipett.
Obs: Rören kan blandas utan att locken sätts på.
7. Lös upp varje pellet genom att blanda varje rör individuellt i 15 sekunder vid hög hastighet. Om pelleten
är svår att lösa upp ska man blanda i ytterligare 5 till 30 sekunder eller tills pelleten flyter lös från botten
av röret och ser ut att lösas upp.
8. Pipettera 100 μl berett reagens för denaturering (med indikatorfärg) till varje prov med en repeterande
eller justerbar pipett.
FÖRSIKTIGHET: Se till att rörväggarna inte vidrörs, annars kan korskontamination av prover
inträffa.
Följ tillämpliga lokala och nationella bestämmelser för kassering av frätande ämnen vid kassering av
återstående reagens för denaturering.
9. Blanda varje rör noggrant och individuellt vid hög hastighet i fem sekunder.
Obs: Rören kan blandas utan att locken sätts på.
Märk 15 ml koniskt rör med lämplig providentifikation och typ (exempel “SP” för SurePath-provtyp) och
placera i ett ställ.
Obs: Om QIAGEN Rapid Capture®-systemet för halvautomatiserad analysbehandling används måste
15 ml koniska rör av märkena VWR eller Corning® användas för korrekt placering i Digene
Conversion Rack (silverställ).
10. Överför hela rörvolymen till ett 15 ml koniskt rör med skruvlock med en överföringspipett för engångsbruk
med 7 ml standardspets eller likvärdigt1.
11. Sätt på locken på 15 ml koniska rör.
12. Inkubera i vattenbad vid 65 ± 2 °C i 90 ± 5 minuter.
FÖRSIKTIGHET: Denna inkubationstid är längre än vad som krävs för andra godkända
provtyper.
13. Om HPV-testning avslutas samma dag, denaturera hc2 högriskkalibratorer i vattenbad vid 65 ºC i 45
minuter enligt anvisningar för hc2 HPV DNA Test.
14. Ta bort provstället från vattenbadet.
Valfri stoppunkt
Efter denaturering kan STM-prover och konverterade PreservCyt- och SurePath-prover förvaras vid
2-8 °C över natt eller vid -20 °C i upp till tre månader. För förvaring i kylskåp över natt kan proverna
lämnas kvar i konversionsstället med DuraSeal-filmen och ställocket på. Före förvaring vid -20 °C måste
1
QIAGEN-verifikationstester använder 15 ml koniska rör av märket VWR
18
ställocket och DuraSeal-filmen tas bort och rören förses med lock. I vilket fall måste proverna komma i
jämvikt i rumstemperatur (20 – 25 °C) och noga blandas innan de går till hybridiseringsmomentet.
OBS: Förvara eller transportera inte denaturerade prover på kolsyresnö.
Högst tre frysnings/upptiningscykler får utföras med högst två timmar vid rumstemperatur i varje
upptiningscykel.
HYBRIDISERING
OBS:
•
•
•
Högrisk HPV-probblandning är viskös. Försiktighet ska iakttas för att tillförsäkra ordentlig
blandning och att den nödvändiga mängden är helt dispenserad till varje mikrorör eller
mikrotiterplattsbrunn. Se avsnittet Reagenstillverkning och förvaring.
Om det denaturerade provet har förvarats vid -20 °C, låt det tina till 20-25 °C och blanda provet
ordentligt innan hybridisering påbörjas.
Förvärm värmeblocket för mikrotiterplatta I till 65 ± 2 °C i minst 60 minuter före användning. Vid
behov se användarhandboken för värmeblock för mikrotiterplatta I för ytterligare instruktioner.
Hybridiseringsmetod som använder hybridiseringsmikrotiterplatta och värmeblock för
mikrotiterplatta I
OBS:
Prover som tagits med DNAPap eller HC Cervical Sampler i transportmedium för prover (STM)
och som behandlats enligt metoden med MST Vortexer kan hybridiseras enbart med hjälp av
metoden med värmeblock för mikrotiterplatta I.
1. Tag en hybridiseringsmikrotiterplatta och märk den.
2. Tag ut kalibratorer, kvalitetskontroller och prover från vattenbadet efter inkubationen. Om MST
Vortexer används så ska hela stället med STM-prover blandas under minst fem sekunder med
maximal hastighet. För prover i PreservCyt- eller SurePath-lösning, blanda hela
konversionsstället i minst tio sekunder vid högsta hastighet. Alternativt så kan varje rör blandas
individuellt under minst fem sekunder.
3. Pipettera 75 µl av vardera kalibrator, kvalitetskontroll eller prov till botten av en tom brunn på en
hybridiseringsmikrotiterplatta enligt den layout som gjordes under ”Inställning”. Undvik att vidröra
brunnarnas sidor och begränsa bildningen av luftbubblor. Använd en ren, extra lång pipettspets
för varje överföring för att undvika korskontamination av kalibratorer, kvalitetskontroller eller
prover. Ta inte bort provtagningsanordningen från provets transportrör. Denaturerade prover kan
tillslutas med skruvlock för provtagningsrör och kan förvaras med provtagningsanordningen kvar i
rören. För denaturerade PreservCyt-prover kan de ursprungliga locken användas.
OBS: Falskt positiva resultat kan inträffa om alikvoter av prover inte överförs noggrant. Vid
överföringen av prov, låt inte pipettspetsen vidröra rörets insida när alikvoten på 75 µl tas bort.
4. När det sista provet har överförts ska hybridiseringsmikrotiterplattan täckas med ett plattlock
och inkuberas i tio minuter vid 20-25 °C.
5. Alikvotera den beredda och ordentligt blandade högrisk HPV-probblandningen i en
reagensbehållare för engångsbruk. Pipettera försiktigt 25 µl av högrisk HPV-probblandningen i
varje brunn med kalibratorer, kvalitetskontroller och prover med hjälp av en 8-kanals pipett och
med nya spetsar för varje rad. Dispensera probvolymen till varje hybridiseringsbrunn och undvik
returstänk. Undvik att vidröra brunnarnas sidor.
6. Täck hybridiseringsmikrotiterplattan med plattlocket och skaka med Hybrid Capture-systemets
roterande skak I som ställts in på 1100 ± 100 varv/min i 3 ± 2 minuter. Kalibratorer,
kvalitetskontroller och prover ska bli gula efter skakning. Brunnar som förblir violetta har kanske
inte fått korrekt mängd probblandning. Tillsätt ytterligare 25 µl probblandning till de prover som
19
fortfarande är violetta och skaka igen. Om brunnarna förblir violetta efter denna procedur ska
proverna omtestas.
OBS:
•
Efter skakning ska prover i PreservCyt-lösning bli rosa istället för gula.
•
När hybridiseringsmikrotiterplattan placeras i värmeblock för mikrotiterplatta I ska försiktighet
iakttas så att stänk inte uppkommer.
7. Inkubera hybridiseringsmikrotiterplattan i ett förvärmt värmeblock för mikrotiterplatta I som är
stabiliserat till 65 ± 2 °C under 60 ± 5 minuter.
Hybridiseringsmetod med mikrorör och vattenbad
OBS:
•
•
Behandlingen av prover som tagits med HC Cervical Sampler i transportmedium för prover (STM)
och som använder metoden med MST Vortexer för blandning och vattenbadsmetoden för
hybridisering har inte validerats. Prover som tagits med DNAPap eller HC Cervical Sampler i
transportmedium för prover (STM) och behandlats enligt metoden med MST Vortexer kan
hybridiseras enbart med hjälp av metoden för värmeblock för mikrotiterplatta I.
Om denaturerade prover har förvarats vid -20 °C, låt dessa tina till 20-25 °C och blanda proverna
ordentligt innan hybridisering påbörjas.
1.
Märk och placera behövligt antal rena hybridiseringsmikrorör i provrörsstället för mikrorör.
2.
Tag ut kalibratorer, kvalitetskontroller och prover ur vattenbadet efter inkubationen. Blanda varje rör
individuellt under minst fem sekunder precis innan alikvoter tas bort.
3.
Pipettera 75 µl av vardera kalibrator, kvalitetskontroll eller prov till botten av en tom brunn på
hybridiseringsmikrotiterplattan enligt den layout som gjordes under Inställning. Undvik att vidröra
mikrorörens sidor och begränsa bildningen av luftbubblor. Använd en ren, extra lång pipettspets för
varje överföring för att undvika korskontamination av kalibratorer, kvalitetskontroller eller prover. Det
är inte nödvändigt att ta bort provtagningsanordningen från provets transportrör. Denaturerade
prover kan tillslutas med skruvlock för provtagningsrör och kan förvaras med
provtagningsanordningen kvar i rören.
4.
När det sista provet har överförts, inkubera mikrorören för hybridisering i tio minuter vid 20-25 °C.
5.
Alikvotera den beredda och ordentligt blandade probblandningen till reagensbehållare för
engångsbruk. Pipettera försiktigt 25 µl av probblandningen till varje mikrorör som innehåller
kalibratorer, kvalitetskontroller och prover med hjälp av en 8-kanals pipett med nya spetsar för varje
rad. Dispensera probblandningen till varje hybridiseringsmikrorör och undvik returstänk. Undvik att
vidröra sidorna av rören. Inspektera stället underifrån för att verifiera att alla rör har fått korrekt
mängd probblandning.
6.
Täck mikrorören med ett plattlock. Placera locket till stället över stället. Skaka provrörsstället för
mikrorör på roterande skak I som ställts in på 1100 ± 100 varv/min i 3 ± 2 minuter. Kalibratorer,
kvalitetskontroller och prover ska bli gula efter skakning. Rör som förblir violetta har kanske inte fått
korrekt mängd probblandning. Tillsätt ytterligare 25 µl probblandning till de prover som fortfarande är
violetta och skaka igen. Om rören förblir violetta efter denna procedur ska proverna omtestas.
OBS: Efter skakning ska prover i PreservCyt-lösning bli rosa istället för gula.
7.
Inkubera mikrorörsstället i ett vattenbad om 65 ± 2 °C under 60 ± 5 minuter. Se till att vattennivån i
vattenbadet är tillräcklig för att täcka hybridiseringsblandningens hela volym. Provrörsstället för
mikrorör flyter i vattenbadet.
OBS: Gör en layout med hjälp av DHCS v.2 programvara eller Digene kvalitativ programvara om
detta inte har gjorts tidigare.
20
HYBRIDINFÅNGNING
1. Tag bort alla utom det nödvändiga antalet brunnar från den fångande mikrotiterplattans ram. Lägg
tillbaka de oanvända mikrotiterplattbrunnarna i originalpåsen och försegla. Numrera varje kolumn 1,
2, 3..... med en märkpenna och märk mikrotiterplattan med passande identifikation. Proverna ska
tillsättas brunnarna enligt layouten i exemplet som förbereddes under ”Inställning”.
2. Tag försiktigt bort hybridiseringsmikrotiterplattan som innehåller kalibratorer, kvalitetskontroller och
prover från värmeblock för mikrotiterplatta I. Tag omedelbart bort plattlocket och lägg det på en ren
yta. Alternativt, tag ut provrörsstället för mikrorör ur vattenbadet. Tag omedelbart av locket på stället
och dra locket uppåt och längs med stället.
3. Överför hela innehållet (cirka 100 µl) i kalibratorer, kvalitetskontroller och prover från
hybridiseringsmikrotiterplattans brunnar eller mikrorör till botten av motsvarande brunnar på den
fångande mikroplattan med en 8-kanals pipett. Använd nya pipettspetsar till 8-kanalspipetten för varje
kolumn som överförs och låt varje pipettspets rinna av ordentligt för att tillförsäkra en fullständig
provöverföring. Om så föredras kan pipetten stödjas genom att låta mitten av pipettspetsarna vila på
toppkanten av brunnarna på den fångande mikroplattan (se diagram 1).
DIAGRAM 1: KORREKT PIPETTERING
Korrekt
Pipettera inte vertikalt.
Undvik returstänk.
Låt inte spetsen
vidröra brunnens sida
4. Täck mikrotiterplattan med plattlocket eller locket och skaka med roterande skak I med
1100 ± 100 v/min vid 20-25 °C under 60 ± 5 minuter.
5. Bered tvättbuffert. Om automatiserad tvättapparat för plattor I används, kontrollera skölj- och
avfallsbehållarna under denna inkubation. Se avsnittet Reagenstillverkning och förvaring.
6. När infångningssteget är fullständigt, tag bort den fångande mikrotiterplattan från den roterande
skaken I och tag försiktigt bort plattlocket eller locket. Tag bort vätskan från brunnarna genom att
hälla den i slasken. Vänd plattan helt upp och ned och skaka hårt med en nedåtgående rörelse och
var försiktig så att detta inte orsakar returstänk genom att dekantera den för nära slaskens botten.
®
Vänd inte på plattan igen. Torka av genom att knacka bestämt 2-3 gånger mot en ren Kimtowels
torkduk eller likvärdiga luddfria pappershanddukar. Se till att all vätska är borttagen från brunnarna
och att plattans översida är torr.
HYBRIDDETEKTION
OBS:
• Gör tillsättningar tvärsöver plattan i riktning från vänster till höger med en 8-kanalspipett.
• Det rekommenderas att den omvända pipetteringstekniken används för att förbättra
reagenstillsättningens enhetlighet. Med denna teknik så överfylls pipettspetsarna initialt genom
att använda pipettens andra stoppläge på kontrollen för aspirering/dispensering (kolv). Se
procedur nedan. Torka av spetsarna på reagensbehållaren för engångsbruk för att ta bort
överflödigt reagens före dispensering till platta.
• Om så föredras, kan pipetten stödjas genom att låta mitten av pipettspetsarna vila på
mikroplattbrunnarnas toppkant. Iakttag försiktighet så att mikroplattbrunnarnas sidor inte vidrörs
annars kan korskontamination av prover ske. Referera till diagram 1 ovan.
1. Alikvotera lämplig volym detektionsreagens 1 till en reagensbehållare för engångsbruk. Se
avsnittet Reagenstillverkning för instruktioner. Pipettera, med omvänd pipetteringsteknik, försiktigt
75 µl av detektionsreagens 1 till varje brunn på fångande mikrotiterplatta med en 8-kanalspipett.
21
Omvänd pipetteringsteknik:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Sätt spetsar på en 8-kanalspipett och se till att alla spetsar sitter ordentligt fast.
Tryck pipettens kolv förbi det första stoppläget till det andra stoppläget.
Sänk ned spetsen i lösningen med detektionsreagens 1.
Frigör kolven sakta och låt lösningen fylla spetsarna.
Dispensera 75 µl lösning till mikrotiterplattbrunnarna genom att trycka kolven till det första
stoppläget. Frigör inte kolven förrän pipettspetsarna åter har sänkts ned i lösningen med
detektionsreagens 1.
Fyll spetsarna igen och upprepa tills alla brunnar är fyllda. Fyll mikrotiterplattans brunnar från
vänster till höger. Verifiera att alla brunnar har fyllts genom att observera den violetta färgens
intensitet. Alla brunnar ska ha liknande intensitet.
2. Täck plattorna med plattlock eller ren plastfilm (eller liknande) och inkubera vid 20-25 °C under 30-45
minuter.
TVÄTTNING
Tvätta den fångande plattan med en av de två metoderna nedan.
Metod med automatiserad tvättapparat för plattor I
OBS: Automatiserad tvättapparat för plattor I ska alltid vara påslagen. Se till att sköljbehållaren är fylld
och avfallsbehållaren är tom. Den automatiserade tvättapparaten för plattor I kommer
rutinmässigt att skölja systemet för rengöring. Se handboken Drift och underhåll för
automatiserad tvättapparat för plattor I för ytterligare instruktioner när så behövs.
FÖRE VARJE ANVÄNDNING:
• Verifiera att tvättbehållaren är fylld med minst 1 liter tvättbuffertlösning. Om så inte är fallet, bered
tvättbuffertlösningen. Se avsnittet Reagenstillverkning och förvaring.
• Verifiera att sköljbehållaren är fylld med avjoniserat eller destillerat vatten.
• Verifiera att avfallsbehållaren är tom och att locket är ordentligt påskruvat.
• Automatiserad tvättapparat för plattor I fylls automatiskt före varje tvätt och utför en
underhållssköljning efter varje tvätt.
1. Tag bort plattlocket och lägg plattan på plattformen på automatiserad tvättapparat för plattor I.
2. Verifiera att strömförsörjningen är påslagen och att displayen visar “Digene Wash Ready.”
OBS: Om endast en del av infångningsbrunnar används måste tomma mikrotiterplattbrunnar
placeras på den fångande plattan för att komplettera kolumnen innan tvättning sker.
3. Ange antalet strips som ska tvättas genom att trycka på knappen “Rows” och därefter på “+” eller
“-” för att justera. Tryck på knappen “Rows” för att återgå till “Digene Wash Ready.”
4. Tryck på “Start/Stop” för att börja.
5. Tvättapparaten utför sex påfyllnings- och aspirationssteg vilket tar ungefär tio minuter. Det är en
kort paus under programmets gång så var noga med att inte ta ut plattorna för tidigt. När den
automatiserade tvättapparaten för plattor I har avslutat tvätten så visas “Digene Wash Ready.”
6. Tag bort mikrotiterplattan från tvättapparaten när programmet avslutats. Plattan ska vara vit och
inga rester av rosa vätska ska finnas kvar i mikroplattbrunnarna.
Metod för manuell tvättning
1. Tag bort detektionsreagens 1 från brunnarna genom att placera rena Kimtowels torkdukar eller
likvärdiga luddfria pappershanddukar på plattans översida och vänd den försiktigt upp och ned.
Innan den vänds, se till att pappret har kontakt med plattans hela överyta. Låt plattan rinna av i
1-2 minuter. Läska ordentligt på rena Kimtowels torkdukar eller likvärdiga luddfria
22
pappershanddukar. Tag försiktigt bort och kassera använda pappershanddukar för att undvika
kontamination med alkaliskt fosfatas i senare steg.
2. Handtvätta plattan sex gånger med hjälp av tvättapparaten. Varje brunn ska tvättas så att den
svämmar över för att ta bort detektionsreagens 1 från brunnarnas översida. Tvättningen börjar
med brunn A1 och fortsätter på ett slingrande sätt till höger och nedåt. Efter alla brunnar fyllts så
ska vätskan hällas ned i slasken med en kraftig nedåtriktad rörelse. Den andra tvätten börjar med
brunn H12 och rör sig med en slingrande rörelse till vänster och uppåt. Sekvensen för dessa två
tvättar upprepas ytterligare två gånger så att varje brunn får totalt sex tvättar.
3. Efter tvättningen torkas plattan av genom att vända den upp och ned på en ren Kimtowels torkduk
eller likvärdig luddfri pappershandduk och knackas bestämt 3-4 gånger. Byt ut
pappershanddukarna och torka av igen. Låt plattan ligga upp och ned och låt den rinna av i fem
minuter. Torka av plattan en gång till.
4. Plattan ska vara vit och inga rester av rosa vätska ska finnas kvar i mikroplattbrunnarna.
SIGNALFÖRSTÄRKNING
OBS:
•
•
•
•
Använd ett nytt par handskar för hantering av detektionsreagens 2.
Alikvotera endast den mängd reagens som behövs för att utföra analysen till
reagensbehållaren för engångsbruk så att kontaminering undviks med detektionsreagens 2. Se
avsnittet om reagenstillverkning. Häll inte tillbaka detektionsreagens 2 till originalflaskan.
Kassera oanvänt materiel efter användning.
Tillsättning av detektionsreagens 2 ska göras utan avbrott. Inkuberingstiden för alla brunnar
måste vara så lika som möjligt.
Iakttag försiktighet så att mikroplattbrunnarnas sidor inte vidrörs eller att reagens stänker
tillbaka upp på spetsarna då detta kan orsaka korskontamination av proverna. (Se diagram 1).
1. Pipettera försiktigt 75 µl detektionsreagens 2 till varje brunn på fångande mikrotiterplatta med en
8-kanalspipett såsom tidigare beskrivits. Alla mikroplattbrunnarna ska bli gula. Verifiera att alla
brunnar har fyllts genom att observera färgens intensitet. Alla brunnar ska ha liknande intensitet.
2. Täck mikrotiterplattorna med plattlock eller ren plastfilm (eller liknande) och inkubera vid 20-25 °C
under 15 minuter. Undvik direkt solljus.
3. Läs av mikrotiterplattan med Digene Microplate Luminometer 2000 (DML 2000™) efter 15
minuters inkubation (och inte senare än 30 minuter efter inkubation).
4. DML 2000-instrumentets analysspecifika programvaruprotokoll tillåter inmatning av relevant
analysinformation direkt i programvaran.
5. Om en full mikrotiterplatta inte användes så ska använda mikroplattbrunnar tas bort från
mikrotiterplattans hållare, skölj hållaren noggrant med destillerat eller avjoniserat vatten, torka och
spara för nästa analys.
KRITERIER FÖR VERIFIKATION AV ANALYSKALIBRERING
Verifikation av analyskalibrering utförs för att tillförsäkra att reagenserna och medföljande kalibrator- och
kvalitetskontrollmateriel fungerar riktigt, vilket tillåter en noggrann bestämning av analysens cutoff-värde.
hc2 högrisk HPV DNA Test behöver kalibreras för varje analys och därför är det nödvändigt att verifiera
varje analys enligt de följande kriterierna. Denna verifikationsprocedur är inte avsedd som en ersättning
för test av den interna kvalitetskontrollen. Programvaran DHCS v.2 och Digene kvalitativ programvara
med version 4.01 eller senare DML 2000 analysprotokoll för HPV verifierar automatiskt nedanstående
kriterier.
1.
Negativ kalibrator
Negativ kalibrator måste testas trefaldigt vid varje analys. Den negativa kalibratorns medelvärde
måste vara ≥ 10 och ≤ 250 RLU för att kunna fortsätta. Resultaten för den negativa kalibratorn
ska visa en variationskoefficient (%CV) på ≤ 25 %. Om %CV är > 25 % så ska värdet med det
23
RLU-värde som avviker mest från medelvärdet tas bort och de två kvarvarande värdena
användas för att beräkna medelvärdet. Om skillnaden mellan medelvärdet och vart och ett av de
två värdena är ≤ 25 %, fortsätt till steg 2. I övriga fall är verifikationen av analyskalibreringen
ogiltig och analysen måste upprepas för alla patientprover. Följaktligen ska resultaten från
patientproverna inte rapporteras.
2.
Kalibrator
Högrisk HPV-kalibratorn (HRK) måste testas trefaldigt vid varje analys. Kalibratorresultaten ska
visa en variationskoefficient (%CV) på ≤ 15 %. Om %CV är > 15 % så ska kalibratorvärdet med
det RLU-värde som avviker mest från medelvärdet tas bort och de två kvarvarande
kalibratorvärdena användas för att beräkna medelvärdet. Om skillnaden mellan medelvärdet och
vart och ett av de två värdena är ≤ 15 %, fortsätt till steg 3. I övriga fall är verifikationen av
analyskalibreringen ogiltig och analysen måste upprepas för alla patientprover. Följaktligen ska
resultaten från patientproverna inte rapporteras.
Verifikationen av analyskalibreringen som beskrivits ovan för kalibratorer görs automatiskt av
DHCS v.2 och Digene kvalitativ programvara och skrivs ut i rapporten för dataanalys.
Programvaran DHCS v.2 och Digene kvalitativ programvara med version 4.01 eller senare
av DML 2000 analysprotokoll för HPV verifierar automatiskt att kalibratorns %CV för
högrisk HPV är ≤ 15 %. Digene kvalitativ programvara (v1.0.2 och v1.0.3) visar emellertid INTE
analysen som ogiltig såvida inte kalibratorernas %CV är > 25 %. Användaren måste därför
manuellt verifiera att det %CV som beräknats av programvaran Luminometer DML 2000 är
≤ 15 % och gå tillväga såsom beskrivs för situation 1 i tabellen nedan. Om %CV för
kalibratorreplikaten ligger mellan 15 och 25 %, se instruktionerna för situation 2 eller 3 i tabellen
nedan och vidta åtgärderna som beskrivs under “Användaråtgärder.”
Situation
1
Rapporterat %CV för
HRK-replikaten
≤ 15 %
Digene kvalitativ
programvara visar
Användaråtgärder
Analysen rapporteras
som “Giltig”
Resultaten kan rapporteras; ingen ytterligare åtgärd
behövs.
2
Mellan 15 % och 25
%
Inga avvikande värden
borttagna och analysen
rapporteras som “Giltig”
Tag bort det RLU-värde för kalibratorerna som
avviker mest från medelvärdet. Beräkna kalibratorns
%CV igen med de två kvarvarande värdena. Om
%CV för de två kvarvarande RLU-värdena är > 15 %
så är analysen ogiltig. Resultaten får inte
rapporteras. Om %CV för de två kvarvarande RLUvärdena är ≤ 15 % så ska analysens cutoff
omräknas och därefter omräknas RLU/cutoff-kvoten
för varje prov med detta cutoff-värde. Dessa
omräknade värden kan rapporteras.
3
Mellan 15 % och 25
%
Ett avvikande värde
borttaget och analysen
rapporteras som “Giltig”
Analysen är ogiltig. Resultaten får inte rapporteras.
Analys måste upprepas.
4
> 25 %
Ett avvikande värde
borttaget och analysen
rapporteras som “Ogiltig”
Analysen är ogiltig. Resultaten får inte rapporteras.
Analys måste upprepas.
För att manuellt beräkna %CV såsom anges i situation 2 ovan ska användaren dividera
standardavvikelsen (n-1) för de kvarvarande replikatens RLU-värden med medelvärdet av de
kvarvarande replikatens RLU-värden (HRK) och multiplicera detta resultat med 100.
För att beräkna %CV med hjälp av Microsoft® Excel (som följer med Digene kvalitativ
programvara) så kan användaren beräkna standardavvikelsen för kalibratorreplikaten med hjälp
av formeln STDEV och bestämma kalibratorns medelvärde för RLU med formeln AVERAGE. När
dessa två värden har erhållits, dividera STDEV med AVERAGE och multiplicera resultatet med
100 för att erhålla %CV.
(STDEV/AVERAGE) * 100 = %CV
Om du har några frågor relaterade till beräkning av %CV, omräkning av analysens cutoff
eller omräkning av RLU/cutoff för proverna, vänligen kontakta din lokala QIAGEN
representant.
24
För att bestämma kalibratorns reproducerbarhet och bestämma frekvensen av de manuella
omräkningar som kan vara nödvändiga har resultaten från tre kliniska utvärderingar med totalt
152 analyser som utförts med hc2 högrisk HPV DNA Test sammanställts. Resultaten visade att
medelvärdet av %CV för dessa 152 analyser var 8,1. Med hänsyn till alla tre kalibratorreplikat per
testanalys så observerades en reproducerbarhet på > 15 %CV för kalibratorn i endast 17 av 152
analyser (11,2 %) varav 10 av dessa 17 testanalyser resulterade i ett %CV mellan 15-25
(situation 2). För de 17 testanalyser som gav en %CV >15 så togs ett avvikande värde bort och
%CV omräknades. Efter vidtagna användaråtgärder enligt situation 2 så förblev endast ett av
testanalysens %CV >15 vilket gjorde testanalysen ogiltig. Vid beräkning av %CV för de
kvarvarande 151 testanalyserna gav detta ett medelvärde för %CV på 6,0.
3.
Resultaten för kalibratorns medelvärde (HRK ) och medelvärdet för negativ kalibrator
(NK ) används för att beräkna HRK /NK -kvoten för varje prob. Dessa kvoter måste
uppfylla de följande kriterierna för att verifiera analysens kalibrering innan provresultaten
kan tolkas:
Verifikation av analyskalibrering, acceptabla intervall
2,0≤ HRK / NK ≤ 15
4.
Beräkna kvoten HRK /NK . Om kvoten är ≥ 2,0 och ≤ 15, fortsätt till nästa steg. Om kvoten är
< 2,0 eller > 15 så är analysen ogiltig och måste upprepas. Upprepa alla patientprover för den
analysen.
OBS:
Acceptabla intervall för den negativa kalibratorn och kalibratorn har endast fastställts för
DML 2000-instrumentet.
CUTOFF-BERÄKNING
När en analys har validerats enligt kriterierna angivna ovan så är cutoff-värdet för bestämningen av
positiva prover HRK .
Exempel på cutoff-beräkning
NK RLU-värden
97
101
91
96
RLU-medelvärde
%CV
4,9
HRK /NK
EJ TILLGÄNGLIG
Således är det positiva cutoff-värdet (HRK )) = 318.
HRK RLU-värden
312
335
307
318
4,7
3,31
RLU-värdena för alla prover ska omvandlas till en kvot med det tillämpliga cutoff-värdet. Till exempel ska
alla analyser uttryckas som prov-RLU/cutoff-värde.
OBS: RLU/CO-värden och positiva/negativa resultat för alla prover rapporteras i DML 2000
dataanalysrapport.
För användning av metoden med RCS-instrument har programvaruprotokollet RCS HPV
programmerats att tillämpa en faktor för justeringskalibrering på 0,8 på RLU-medelvärdet för
giltiga positiva kalibratorreplikat. Denna kalibreringsfaktor behövs för att analysens
prestandaegenskaper ska vara likvärdiga med det manuella testförfarandet. Ändringen gäller
bara analyser som utförs med metoden med RCS-instrument. Det är därför kritiskt att välja rätt
programvaruprotokoll för användning med en viss testmetod för att få noggranna testresultat.
RLU-värdena för alla prover ska omvandlas till en kvot med det tillämpliga cutoff-värdet (COvärdet). Till exempel ska alla analyser uttryckas som prov-RLU/CO-värde.
25
KVALITETSKONTROLL
Prover för kvalitetskontroll medföljer hc2 högrisk HPV DNA Test. För instruktioner om hur man matar in
kvalitetskontrollernas satsnummer och utgångdatum, se användarhandboken för Digene Hybrid Capture
System version 2, interaktiv operatörshandledning för DHCS V.2 programvara version 2 eller
användarhandboken för Digene kvalitativ programvara. Dessa kvalitetskontroller måste inkluderas i varje
analys och RLU/CO för varje kvalitetskontroll måste ligga inom de följande acceptabla intervallen för att
körning ska anses giltig. Om kvalitetskontrollerna inte ligger inom dessa intervall så är analysen
ogiltig och måste upprepas. Således ska inga patientresultat rapporteras för någon körning som är
ogiltig.
Kvalitets
-kontroll
Förväntat resultat
(RLU/CO-värde)
Högrisk HPV-prob
HPV-typ
KK1-LR
Lågrisk (HPV 6)
KK2-HR
Högrisk (HPV 16)
Minimum
Maximum
Medelvärde
%CV
0,001
2
0,999
8
0,5
5,0
25
25
1. Kvalitetskontroller som medföljer satsen är klonade HPV mål-DNA och härstammar inte från ”vild
HPV-typ”. Det är samma typ av materiel som används för kalibratorerna som medföljer hc2
högrisk HPV DNA Test.
2. Det här kvalitetskontrollmaterielet fungerar inte som lämplig kvalitetskontroll vid behandling av
transportmedium för prover, PreservCyt-lösning eller SurePath-konserveringsvätska.
3. Kvalitetskontrollerna som medföljer denna testsats måste användas vid intern kvalitetskontroll.
Ytterligare kvalitetskontroller kan testas enligt riktlinjer eller krav från lokala och/eller nationella
föreskrifter eller ackrediterade organisationer.
TOLKNING AV PROVRESULTAT
OBS: hc2 högrisk HPV DNA Test-cutoff på 1pg/ml är ekvivalent med 100 000 HPV-kopior/ml eller 5 000
HPV-kopior per analys.
1. STM-prover med en kvot på RLU/cutoff-värde som är ≥ 1,0 anses “positiva”.
2. Prover med en kvot på RLU/cutoff-värden som är < 1,0 anses “negativa” eller “inget detekterat”
för de 13 testade HPV-typerna. Högrisk HPV DNA-sekvenser är antingen frånvarande eller så är
HPV DNA-nivåerna under detektionsgränsen för analysen.
3. Om RLU/CO-kvoten är ≥ 1,0 och < 2,5 vid testning av PreservCyt-prover, rekommenderar
QIAGEN att provet måste omtestas. Om det första omtestningsresultatet är positivt (≥ 1,0
RLU/CO) kan provet rapporteras som positivt och då behöver ingen vidare omtestning göras. Om
däremot det första omtestningsresultat är negativt (< 1,0) måste en andra omtestning (för ett
tredje resultat) göras för att ge ett slutligt resultat. Resultatet av den andra omtestningen ska
betraktas som slutligt och rapporteras.
4. Om ett provs RLU/cutoff-kvot är nära men mindre än 1,0 och högrisk HPV-infektion misstänks,
överväg alternativa testmetoder och/eller ny provtagning.
5. Eftersom den här analysen endast detekterar högrisk HPV-typerna 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59 och 68, så ska man vara medveten om att andra lågrisk HPV-typer kan finnas i
proverna. Om test utförs speciellt för att påvisa sexuellt överförd lågrisk HPV så måste hc2 HPV
DNA Test som detekterar låg- och högrisk HPV DNA-typer användas.
26
PRESTANDAEGENSKAPER
KLINISK PRESTANDA VID SCREENING AV PATIENTER MED NORMALA RESULTAT FRÅN PAP
SMEAR SOM EN HJÄLP I RISKBEDÖMNINGEN FÖR PATIENTHANDLÄGGNING
Resultaten från åtta oberoende kliniska studier utförda av prominenta medicinska, akademiska och
offentliga institutioner vid centra i USA och utomlands beskrivs nedan. För studierna användes de
etablerade Pap-metoderna såsom de används i de länder i vilka studierna utfördes. I alla utom två fall
användes Bethesdas graderingssystem för att tolka Pap-resultaten. För motsvarande terminologi i EU för
screening av cervixcancer, se Europeiska riktlinjer för kvalitetssäkring inom screening för cervixcancer42.
Dessutom diagnostiserades höggradig cervixsjukdom genom användning av kolposkopiriktad biopsi i
varje studie. Dessa studier utvärderade den kliniska användbarheten av hc2 högrisk HPV DNA Test
jämfört med Pap smear hos äldre kvinnor (i allmänhet över 30-35 år). I alla utom en studie utfördes också
prospektiv HPV-testning med hc2 högrisk HPV DNA Test.
Dessa studier var screeningstudier av ett tvärsnitt av befolkningen i allmänhet med hc2 högrisk HPV DNA
Test, om inte annat anges nedan. Såsom angetts utfördes två av åtta studier i USA, två i Europa, två i
Latinamerika, en i Afrika och en i Asien.
Prestandan hos hc2 högrisk HPV DNA Test baserat på sex tvärsnittsstudier sammanfattas i tabell 3 och 4
för kvinnor 30 år och äldre som diagnostiserats med histologiskt bekräftad höggradig cervixcancer
(definierad som CIN3 eller svårare).
Tabell 3
Uppskattad prestanda för hc2 högrisk HPV DNA Test
Känslighet och specificitet
Population
n
Känslighet (%)
PAP enbart
Specificitet (%)
HPV enbart
HPV + PAP
PAP enbart
HPV enbart
HPV + PAP
51,6
96,3
7592
Västeuropa 1
(14/27)
(26/27)
95 % KI
32,0-71,3
81,0-99,9
58,4
94,8
Latinamerika 1
(45/77)
(73/77)
6115
95 % KI
46,68-69,6
87,2-98,6
77,9
89,7
Latinamerika 2†
(53/68)
(61/68)
6176
95 % KI
66,2-87,1
79,9-95,8
84,1
89,7
2925
Afrika
(90/107)
(96/107)
95 % KI
75,8-90,5
82,4-94,8
97,6
100
1936
Asien
(41/42)
(42/42)
95 % KI
87,4-99,9
91,6-100,0
50,0
100
1040
USA 1
(1/2)
(2/2)
95 % KI
1,26-98,7
15,8-100,0
†
hc2 data när tillgängligt, annars HCS data; kombinerade data.
100
(27/27)
87,2-100
97,4
(75/77)
90,9-99,7
94,1
(64/68)
85,6-98,4
92,5
(99/107)
85,8-96,7
100
(42/42)
91,6-100,0
100
(2/2)
15,8-100,0
98,5
(7453/7565)
98,2- 98,8
98,7
(5962/6038)
98,4-99,0
94,1
(5745/6108)
93,4-94,6
86,4
(2436/2818)
85,1-87,7
76,3
(1445/1894)
74,3-78,2
97,6
(1013/1038)
96,5-98,4
96,2
(7275/7565)
95,7-96,6
93,9
(5669/6038)
93,3-94,5
94,0
(5742/6108)
93,4-94,6
80,0
(2253/2818)
78,4-81,4
83,0
(1572/1894)
81,2-85,0
96,2
(999/1038)
94,9-97,3
95,1
(7193/7565)
94,6-95,6
93,4
(5637/6038)
92,7-94,0
89,9
(5490/6108)
89,1-90,6
76,4
(2152/2818)
74,8-77,9
68,0
(1287/1894)
65,8-70,1
95,5
(991/1038)
94,0-96,7
27
Tabell 4
Uppskattad prestanda för hc2 högrisk HPV DNA Test
Positivt och negativt förväntat värde
Population
n
Prevalens (%)
Positivt förväntat värde (%)
PAP enbart
0,36
11,1
Västeuropa
7592
(27/7592)
(14/126)
1
95 % KI
0,23-0,52
6,21-17,9
1,26
37,2
Latinamerika
6115
(77/6115)
(45/121)
1
95 % KI
0,99-1,57
28,6-46,4
1,10
12,7
Latinamerika
6176
(68/6176)
(53/416)
2†
95 % KI
0,86-1,39
9,69-16,3
3,66
19,1
2925
(107/2925)
(90/472)
Afrika
95 % KI
3,01-4,40
15,6-22,9
2,17
8,37
1936
(42/1936)
(41/490)
Asien
95 % KI
1,57-2,92
6,07-11,2
0,19
3,85
1040
(2/1040)
(1/26)
USA 1
95 % KI
0,02-0,69
0,10-19,6
†
hc2 data när tillgängligt, annars HCS data; kombinerade data.
CIN 3
HPV enbart
8,23
(26/316)
5,45-11,8
16,5
(73/442)
13,2-20,3
14,3
(61/427)
11,1-18,0
14,5
(96/661)
11,9-17,4
11,5
(42/364)
8,44-15,3
4,88
(2/41)
0,60-16,5
HPV + PAP
6,77
(27/399)
4,51-9,69
15,8
(75/476)
12,6-19,4
9,4
(64/682)
7,30-11,8
12,9
(99/765)
10,6-15,5
6,47
(42/649)
4,70-8,65
4,08
(2/49)
0,50-14,0
Negativt förväntat värde (%)
PAP enbart
99,83
(7453/7466)
99,70-99,91
99,47
(5962/5994)
99,25-99,63
99,74
(5745/5760)
99,57-99,85
99,31
(2436/2453)
98,89-99,60
99,93
(1445/1446)
99,62-100,0
99,90
(1013/1014)
99,45-100,0
HPV enbart
99,99
(7275/7276)
99,92-100,0
99,93
(5669/5673)
99,82-99,98
99,88
(5742/5749)
99,75-99,95
99,51
(2253/2264)
99,13-99,76
100,0
(1572/1572)
99,77-100,0
100,0
(999/999)
99,63-100,0
HPV + PAP
100,0
(7193/7193)
99,95-100,0
99,96
(5637/5639)
99,87-100,0
99,93
(5490/5494)
99,81-99,98
99,63
(2152/2160)
99,27-99,84
100,0
(1287/1287)
99,71-100,0
100,0
(991/991)
99,63-100,0
Generellt i alla studier är det en enhetlig och ofta mycket signifikant förbättring i känslighet av hc2 högrisk
HPV DNA Test jämfört med enbart Pap. Såsom för känslighet överträffar HPV negativt förväntat värde
(NPV) det för enbart Pap i alla fall, nästan till 100 %. Detta NPV visar den höga sannolikheten för frånvaro
av höggradig cervixsjukdom eller cancer hos cytologiskt normala kvinnor som inte har HPV-infektion.
Fastän specificiteten för hc2 högrisk HPV DNA Test är lägre än för enbart Pap så visar en analys av
sannolikhetskvoten att den observerade minskade specificiteten inte är tillräckligt signifikant för att
påverka testets kliniska användbarhet för identifiering av kvinnor som har låg eller ingen risk att ha eller
utveckla cervixsjukdom. Likväl är det viktigt att beslutet att remittera en patient till kolposkopi baseras på
all klinik- och riskinformation och patientanamnes som är tillgänglig för läkaren. Viktiga variabler
inkluderar tidigare HPV-infektion och/eller onormalt Pap smear, ålder för sexuell debut, antal
27,28
sexualpartners och samtidiga sexuellt överförda sjukdomar.
Även om prevalensen av höggradig sjukdom inte signifikant varierar mellan de studier från vilka
prestandan beräknades så kan prevalensen av HPV-infektion i en population påverka prestandan och
varierar vanligtvis med patientpopulationen. Dessutom har det visats att prevalensen av HPV-infektion
28-37
Positiva förväntade värden minskar vid test av populationer med låg
minskar dramatiskt med åldern.
prevalens eller individer med låg risk för infektion.
Longitudinella analyser utfördes med resultaten från två studier; en utfördes i USA av National Cancer
Institute (NCI) i Portland, Oregon, och den andra utfördes i Frankrike av Laboratoire Pol Bouin C.H.U. de
Reims. Dessa longitudinella analyser gjordes för att visa att Pap-negativa/HPV-negativa patienter har en
lägre risk att ha en cervixsjukdom jämfört med traditionellt definierade lågrisk-kvinnor vars HPV-status är
okänd och jämfört med Pap-negativa/HPV-positiva patienter. Resultaten av dessa longitudinella analyser
visas i tabell 5 och 6 nedan.
28
Tabell 5
Resultatsammandrag: Studier från NCI och Frankrike
Relativ risk för höggradig sjukdom
Ålder
Frekvens (per
100 patientår)
Relativ risk
(95 % KI)
12 054
Antal fall
med CIN
3+
28
0,043
9 429
19
0,048
0,897
(0,596, 1,348)
1,000
17 594
48
0,056
13 392
44
0,082
1 690
3
0,084
2 026
4
0,099
2 180
3
0,066
2 650
7
0,136
Lågriskklassificering
n
Studie
Pap normal, HPV
negativ
Efterföljande normala
Pap
NCI
Pap normal, HPV
negativ
Alla
Efterföljande normala
Pap
Pap normal, HPV
negativ
30 och över
Efterföljande normala
Pap**
Frankrike
Pap normal, HPV
negativ
Alla
Efterföljande normala
Pap**
*Tre normala Pap-tester under cirka två år.
**Två normala Pap-tester under cirka två år.
30 och över
0,678
(0,514, 0,894)
1,000
0,849
(0,307, 2,35)
1,000
0,491
(0,221, 1,09)
1,000
Tabell 6
Resultatsammandrag: Studier från NCI och Frankrike
Sjukdomsfrekvenser uppdelade enligt HPV-status på baslinjen
Ålder
Frekvens (per
100 patientår)
Relativ risk
(95 % KI)
1 078
Antal fall
med CIN
3+
24
0,451
12 054
28
0,043
10,50
(6,13, 18,0)
1,00
2 561
63
0,096
17 594
48
0,056
419
14
2,346
1696
3
0,084
619
22
2,520
2180
3
0,066
Baslinjestatus
n
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
Pap normal,
HPV positiv
Pap normal,
HPV negativ
Studie
30 och över
NCI
Alla
30 och över
Frankrike
Alla
10,64
(7,33 – 15,5)
1,00
27,3
(8,41, 88,3)
1,00
37,0
(11,8, 116)
1,00
Den kliniska användbarheten av HPV-testresultat visas vidare av den ökade risken för cervixsjukdom hos
HPV-positiva kvinnor jämfört med HPV-negativa kvinnor.
KLINISK PRESTANDA NÄR PATIENTER MED ASC-US PAP SMEAR-RESULTAT UNDERSÖKS FÖR
ATT BESTÄMMA BEHOVET FÖR REMISS TILL KOLPOSKOPI
En studie med titeln “Utility of HPV DNA Testing for Triage of Women with Borderline Pap Smears”
utfördes i USA 1996 under ledning av Kaiser Foundation Research Institute och Kaiser Permanente
Medical Group. Cervixprover för rutinmässig Pap smear och för hc2 högrisk HPV DNA-testning erhölls
från kvinnor som besökte åtskilliga Kaiser-kliniker. Initial Pap smear utvärderades enligt Bethesda
klassificeringen. För motsvarande terminologi i EU för screening av cervixcancer se Europeiska riktlinjer
för kvalitetssäkring inom screening för cervixcancer.42 På kvinnor (15 år eller äldre) med Pap smear
ASC-US resultat (atypiska celler av obestämd signifikans) utfördes kolposkopi och biopsi vid återbesök.
Med hjälp av kolposkopi erhölls histologiska prover som utvärderades av patolog och en initial diagnos
gjordes. Varje histologiskt prov granskades också av en oberoende patolog och skillnader mellan den
initiala bedömningen och den oberoende bedömningen avgjordes av en tredje patolog.
29
hc2 HPV DNA-testning utfördes på de initiala proven och endast högrisk HPV-proben användes. HPV
DNA-testning utfördes med en prototyp av hc2 högrisk HPV DNA Test som innehöll prober för 11 av de
13 HPV-typerna inkluderade i högrisk HPV-proben, men innehöll inte några prober för HPV-typerna 59
och 68. Denna skillnad förväntas inte resultera i en signifikant skillnad i kvalitetsprofil för de två
analyserna.
Högrisk HPV-testresultat och histologisk diagnos erhölls från 885 kvinnor med ASC-US Pap smear. För
majoriteten av patienterna utfördes tester med prov som tagits med både transportmedium för prover och
PreservCyt-lösning (PC). Eftersom likheterna mellan hc2 högrisk HPV DNA Test-prestandaegenskaper
för transportmedium för prover och PC-medium, så presenteras analysprestandan endast för PreservCytlösning.
Tabell 7 visar att bland dem som har fått remiss baserad på ASC-US från Pap smear är det negativa
förväntade värdet för hc2 högrisk HPV DNA Test 99 % för HSIL eller mer höggradig sjukdom vid
kolposkopi.
Tabell 7
Jämförelse av hc2 högrisk HPV DNA Test kontra samstämmig histologi
ASC-US remitterad Pap-population
Kaiser-studie, prover i PreservCyt-lösning
hc2 högrisk HPV
+
Totalt
HSIL eller högre vid tidpunkten för kolposkopi
+
66
317
5
497
71
814
Totalt
383
502
885
Känslighet [TP/(TP+FN)] = 93,0 % (66/71)
95 % KI = 84,3 till 97,7
Specificitet [TN/(TN+FP)] = 61,1 % (497/814)
95 % KI = 57,7 till 64,4
Prevalens av sjukdom = 8,0 % (71/885)
Analysens positivt förväntat värde = 17,2 % (66/383)
Analysens negativt förväntat värde = 99,0 % (497/502)
Tabell 8 visar teoretiskt positiva och negativa förväntade värden baserade på olika prevalenser för en
initial ASC-US som visats vara HSIL eller högre baserad på hc2 högrisk HPV-probresultat.
Tabell 8
Teoretiskt positiva och negativa förväntade värden
hc2 högrisk HPV-prob
ASC-US Pap Smear-resultat
Teoretisk prevalens
för HSIL
5
10
15
20
25
30
Initiala ASC-US Pap Smear-resultat
Analysens positivt förväntat värde
Analysens negativt förväntat
värde
11,2
99,4
21,0
98,7
29,7
98,0
37,4
97,2
44,3
96,3
50,6
95,3
30
Tabell 9 illustrerar variationen mellan olika åldersgrupper som ingick i denna studie:
Tabell 9
Kaiser-studiedata
hc2 högrisk HPV DNA Test-prestanda kontra samstämmig histologi
Resultat (HSIL)
Åldersspecifika egenskaper
N
Prevalens av sjukdom (%)
Känslighet (%)
95 % konfidensintervall
Specificitet (%)
95 % konfidensintervall
Negativt förväntat värde (%)
Positivt förväntat värde (%)
Ålder <30
287
12,2
100,00
(35/35)
90,0-100
31,4
(79/252)
25,7-37,5
100
(79/79)
16,83
(35/208)
Ålder 30-39
233
11,2
88,46
(23/26)
69,9-97,6
66,2
(137/207)
59,3-72,6
97,86
(137/140)
24,73
(23/93)
Ålder >39
365
2,7
80,00
(8/10)
44,4-97,5
79,15
(281/355)
74,6-83,3
99,29
(281/283)
9,76
(8/82)
KLINISK KÄNSLIGHET OCH SPECIFICITET FÖR BESTÄMNING AV RISKEN FÖR HÖGGRADIG
SJUKDOM HOS KVINNOR MED LSIL ELLER HSIL PAP SMEAR
En klinisk multicenterstudie med hc2 högrisk HPV DNA Test utfördes med prover som tagits från flera
större sjukhus med hög prevalens av cervixsjukdom och HPV och kolposkopikliniker på medicinska
centra (tre centra) i västra och södra USA. HPV-testning utfördes på tre kliniker som inte var anknutna till
kolposkopiklinikerna från vilka proverna erhölls. Populationen för denna kliniska studie bestod av kvinnor
diagnostiserade med antingen LSIL eller HSIL baserade på nyligen tagna Pap smear och remitterade för
uppföljning med kolposkopi. Av 702 patienter ingående i studien så hade 327 Pap smear-resultat som var
högre än ASC-US och hade tillräcklig information tillgänglig, av dessa så hade 96 slutgiltig diagnos för
HSIL eller högre. Prover med exfolierade cervixceller togs antigen med QIAGEN cervixborste som
placerades i transportmedium för prover eller med en kvastanordning och sköljda i PreservCyt-lösning.
Prover togs vid tidpunkten för kolposkopi. Prover testades med hc2 högrisk HPV DNA Test och resultaten
jämfördes med den etablerade sjukdomsstatusen för varje patient. Sjukdomsstatus baserades på
resultaten av den histologiska utvärderingen, men om histologin var negativ eller i frånvaro av
histologiska resultat bestämdes sjukdomsstatus medelst cytologi vid tidpunkten för
kolposkopiundersökningen (se tabell 10). hc2 högrisk HPV DNA Test utfördes vid tre stora, i städer
belägna, medicinska centra som inte var anknutna till klinikerna där proverna insamlades vid kolposkopi.
Cytologin utfördes av ett referenslaboratorium för patologi och histologin utfördes vid de institutioner som
utförde kolposkopin. Testresultaten jämfördes med sjukdomsstatus för att fastställa testets känslighet,
specificitet och negativa och positiva förväntade värden för detektering av höggradig cervixcancer. Pga.
likheterna mellan hc2 högrisk HPV DNA Test-prestandaegenskaper för transportmedium för prover och
PC-media så presenteras analysprestandan endast för PC.
Ingen skillnad observerades i testresultaten för högrisk HPV-prob med prover i transportmedium för
prover och PreservCyt-lösningen. Tabell 11 visar resultaten för hc2 högrisk HPV-proben i denna
population:
31
Tabell 10
Algoritm för patienters sjukdomsstatus
Cytologiresultat
NEG
LSIL
HSIL
Cancer
NEG
LSIL
LSIL
HSIL
Cancer
NEG
LSIL
HSIL
HSIL
Cancer
NEG
LSIL
HSIL
Cancer
Cancer
Histologiresultat
NEG eller Ej Utfört*
NEG
NEG
NEG
LSIL
Ej Utfört*
LSIL
LSIL
LSIL
HSIL
HSIL
HSIL
Ej Utfört*
HSIL
Cancer
Cancer
Cancer
Ej Utfört*
Cancer
Sjukdomsstatus
NEG
LSIL
HSIL
HSIL+
LSIL
LSIL
LSIL
LSIL
LSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL
HSIL+
HSIL+
HSIL+
HSIL+
HSIL+
*Biopsi och/eller endocervixkyrettage (ECC) har inte utförts pga. att inga
abnormiteter observerades vid kolposkopi eller att histologiresultat inte fanns
tillgängliga.
Tabell 11 och 12 representerar hc2 HPV DNA Test-prestandaegenskaper baserade på 327 PC-prover av
vilka 96 togs från kvinnor diagnostiserade med höggradig cervixsjukdom. Jämförelserna baserades på
alla i studien ingående patienter med onormala Pap smear-resultat. Jämförelser visas för PC-prover
testade med högrisk HPV-prob.
Tabell 12 visar att HPV-test med högrisk HPV-prob uppvisade en total känslighet på cirka 93 % för
identifikation av kvinnor med höggradig neoplasi i en population remitterad till kolposkopi baserad på Pap
smear-diagnosen LSIL, HSIL eller liknande. Testet visade också ett negativt förväntat värde på nära 95 %
i denna population.
32
Tabell 11
Resultat för hc2 högrisk HPV-prob
Remitterade på Pap smear-resultat
Högrisk HPV-resultat
LSIL
HSIL
Totalt
Slutgiltig sjukdomsstatus
HSIL
LSIL
Negativ
POS NEG POS NEG POS NEG
44
4
78
33
28
37
45
3
29
14
5
7
89
7
107
47
33
44
96
154
77
Totalt
224
103
327
Tabell 12
Prestandaegenskaper
hc2 högrisk HPV DNA Test av patienter som fått remiss
Pap smear med LSIL eller högre och med HSIL som slutgiltig sjukdomsstatus
Högrisk
HPVprobresultat
+
Totalt
Remitterade LSIL eller HSIL → HSIL-sjukdom
+
89
140
7
91
96
231
Totalt
229
98
327
Känslighet [TP/(TP+FN)] = 92,7 % (89/96)
95 % KI = 85,6 till 97,0
Specificitet [TN/(TN+FP)] = 39,4 % (91/231)
95 % KI = 33,1 till 46,0
Sjukdomsprevalens för remitterad LSIL till slutgiltig HSIL = 21,4 %
Sjukdomsprevalens för remitterad HSIL till slutgiltig HSIL = 46,6 %
Totalt positivt förväntat värde = 38,9 % (89/229)
Totalt negativt förväntat värde = 92,8 % (91/98)
Medan specificiteten för hc2 högrisk HPV DNA Test synes vara lite låg så kan man inte förvänta sig en
strikt korrelation mellan frånvaro av neoplasi och ett negativt HPV-resultat. HPV DNA kan vara
närvarande hos kvinnor som inte har utvecklat en högre grad av sjukdom. I själva verket när testet HPV
Polymerase Chain Reaction (PCR) (en analys som enbart används inom forskning) utfördes på prover
med positiva hc2 högrisk HPV DNA Test-resultat och vilkas motsvarande sjukdomsstatus var lägre än
låggradig neoplasi så var nästan 75 % positiva.
Tabell 13 indikerar teoretiskt positiva och negativa förväntade värden med högrisk HPV-proben när
initiala LSIL eller HSIL befanns vara HSIL eller svårare sjukdom vid kolposkopi.
Tabell 13
Teoretiskt positiva och negativa förväntade värden
Högrisk HPV-prob
Initiala LSIL eller HSIL Pap smear-resultat
Teoretisk prevalens för HSIL
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Initiala LSIL eller HSIL Pap smear-resultat
Analysens positivt förväntat
Analysens negativt förväntat
värde
värde
7,4
14,5
21,2
27,6
33,7
39,6
45,1
50,4
55,5
60,4
33
99,0
97,9
96,8
95,5
94,1
92,6
90,9
89,0
86,8
84,3
ANALYTISK KÄNSLIGHET
En icke-klinisk panel av klonade HPV DNA-plasmider testades för att fastställa om var och en av de 13
HPV-typerna kan detekteras med hc2 högrisk HPV DNA Test och att fastställa analysens analytiska
känslighet för var och en av HPV-typerna. Varje koncentration av mål-HPV (100 pg/ml, 10 pg/ml, 2,5
pg/ml, 1 pg/ml, 0,5 pg/ml och 0,2 pg/ml) för var och en av de 13 HPV DNA-typerna (16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 och 68) kördes trefaldigt. Signalens medelvärde (i relativa ljusenheter, RLU) för
varje koncentration och för varje HPV-typ beräknades och jämfördes med den positiva högriskkalibratorn.
Detektionsgränsen för varje HPV-typ i transportmedium för prover visas i tabell 14. Detektionsgränserna
varierade från 0,62 pg/ml till 1,39 pg/ml beroende på den testade HPV-typen. Medelvärdet för
detektionsgränsen för alla 13 HPV DNA-typerna var 1,08 pg/ml med en standardavvikelse på 0,05.
Tabell 14
Sammanfattning av hc2 högrisk HPV DNA Test-detektionsgränser för känsligheten av varje HPV
DNA-typ
i transportmedium för prover
HPV DNA-typ
16
18
31
33
35
39
45
51
52
56
58
59
68
Medelvärde
(alla typer)
Detekterbar HPV DNA
Koncentration (pg/ml)
1,09
1,05
1,01
1,35
1,11
1,39
1,14
0,78
1,37
0,62
0,82
1,10
1,19
1,08
Standardavvikelse
0,06
0,05
0,05
0,02
0,05
0,09
0,04
0,10
0,06
0,04
0,04
0,06
0,04
0,05
95 %
konfidensintervall
0,94-1,29
0,88-1,29
0,91-1,15
1,26-1,45
0,95-1,31
1,16-1,71
0,99-1,35
0,70-0,88
1,21-1,58
0,58-0,67
0,73-0,94
1,00-1,21
1,03-1,39
0,95-1,25
EKVIVALENS MELLAN PROVER I TRANSPORTMEDIUM (STM) OCH PROVER I PRESERVCYTLÖSNING (PC)
Ekvivalensen mellan prover i transportmedium för prover och PreservCyt-lösning undersöktes för lika
utbytesgrad av HPV 18 DNA från ungefär 106 positiva HeLa-celler som innehöll integrerade HPV 18genom tillsatta till transportmedium för prover och till en negativ cellpool i PreservCyt-lösning. Varje
provtyp bereddes enligt deras respektive berednings/denatureringsprocedurer som beskrivs i denna
bipacksedel och testades med hc2 högrisk HPV DNA Test med högrisk HPV-prob. Resultatet visar att
utbytet av HPV 18 DNA från humana karcinomceller är ekvivalent för de två medierna och att
beredningsproceduren med PreservCyt-lösningen inte påverkar den analytiska känsligheten för hc2
högrisk HPV DNA Test.
KORRELATION MELLAN SUREPATH-PROVRESULTAT OCH QIAGEN STM-PROVER I EN KLINISK
POPULATION
En klinisk tvåfasutvärdering utfördes med sex provtagningscentra och tre testcentra i USA. Patienter vid
en STD-klinik, obstetrik/gynekologisk klinik, kolposkopiklinik, sjukhus eller familjeplaneringscentrum
avsågs för deltagande enligt förbestämda inkluderande och exkluderande kriterier.
Förundersökningsfasen, avsedd att bestämma en lämplig hc2 högrisk HPV DNA-analyscutoff för
användning med SurePath-prover, inbegrep cirka 400 patienter. Den kliniska valideringsfasen, som
inbegrep cirka 1500 patienter för att validera det valda analyscutoff-värdet, började efter en interim analys
av lämpligheten. Analysen uppvisade att ett analyscutoff-värde på 1,0 RLU/CO med SurePath-prover gav
acceptabel överensstämmelse med QIAGEN STM-provresultat.
34
I båda utvärderingsfaserna erhölls parade SurePath- och STM-cervixprover från varje detagande kvinna.
SurePath-provet skickades sedan till ett cytologilaboratorium för objektglasberedning. Efter cytologisk
beredning testades återstående SurePath-prov och motsvarande STM-prov med hc2 högrisk HPV DNA
Test med en analyscutoff på 1,0 RLU/CO.
Tabell 15 ger korrelationen mellan SurePath-resultat och parade STM-prov som observeras i slutliga
resultat som passar för dataanalys från den totala deltagande populationen.
Tabell 15
SurePath-resultatöverensstämmelse med QIAGEN STM
(alla åldrar och cytologisk klassifikation)
(n = 1490)
Positiv överensstämmelse %
95 % CI
(n/N)
Hög positiv
underuppAlla positiva
sättning
(RLU/CO ≥ 2,5)
93,5
96,4
90,7, 95,6
94,1, 98,0
(401/429)
(378/392)
Negativ överensstämmelse %
95 % CI
(n/N)
Låg negativ
underuppAlla negativa
sättning
RLU/CO (< 0,80)
95,3
96,0
93,8, 96,5
94,6, 97,1
(1011/1061)
(1002/1044)
Dessa resultat antar att den relativa analyskänsligheten och -specificiteten med SurePath-prover kommer
att korrelera i hög grad med det som erhållits med STM-provtypen, vilket visas med den lägre gränsen av
95 % konfidensintervall för både positiv och negativ överensstämmelse.
REPRODUCERBARHET
En multicenterstudie av reproducerbarhet utfördes för att fastställa reproducerbarheten mellan olika
dagar, olika centra och totalt för hc2 högrisk HPV DNA Test med en panel av HPV mål-DNA och HPVpositiva och HPV-negativa kliniska prover som tagits med transportmedium för prover.
Tre externa laboratorier utförde testerna med hc2 högrisk HPV DNA Test-satser från samma satsnummer
under tre olika dagar med en identisk reproducerbarhetspanel. Reproducerbarhetspanelen inkluderade
följande prover: 12 pooler med denaturerade, kliniska prover i transportmedium för prover; tre pooler med
odenaturerade kliniska prover i PreservCyt-lösning, negativ kalibrator och positiv högrisk HPVkalibrator
med koncentrationer på 1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 5 pg/ml och 10 pg/ml. Alla panelprover testades
varje dag trefaldigt med både högrisk HPV-prob- och CPC-metoder. Resultaten visas i tabell 16.
Tabell 16
Sammandrag av total statistik för multicenterstudie av
reproducerbarhet för hc2 högrisk HPV DNA Test
Statistiskt mått
Antal förväntade positiva med ett
observerat positivt resultat
Antal förväntade negativa med ett
observerat negativt resultat
Överensstämmelse
Högrisk HPV-prob
100 %
(99,0-100,0)*
99,0 %
(97,49-99,73)*
99,5 %
(98,70-99,86)*
0,990
Kappa
*Nummer inom parentes indikerar 95 % konfidensintervall. Totala data är en kombination av alla
körningar vid alla centra.
Detta indikerar att reproducerbarhet för hc2 högrisk HPV DNA Test med kliniska prover tagna i STM är
mycket god.
35
KORSREAKTIVITET
KORSREAKTIVITETSPANEL
Ett batteri med bakterier, virus och plasmider som vanligen återfinns i kvinnors anogenitala trakt, såväl
som en samling av kutanotropiska HPV-typer för vilka kloner var tillgängliga, testades för att fastställa om
korsreaktivitet kunde inträffa med de använda HPV-proberna i hc2 högrisk HPV DNA Test. Alla
5
7
mikroorganismer testades med koncentrationer på 1x10 och 1x10 organismer per ml. Renat virus- och
plasmid-DNA testades med en koncentration på 4 ng/ml.
De bakterier som testades anges nedan. Alla bakterier i hc2 högrisk HPV DNA Test gav negativa svar.
Acinetobacter anitratus
Acinetobacter lwoffi (ATCC 17908)
Bacteroides fragilis (ATCC 25285)
Bacteroides melaninogenicus
Candida albicans (ATCC 14053 or 10231)
Chlamydia trachomatis
Enterobacter cloacae
Escherichia coli (HB101)*
Escherichia coli
Fusobacterium nucleatum
Gardnerella vaginalis
Haemophilus ducreyi
Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus acidophilus
Mobiluncus curtisii
Mobiluncus mulieris
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinis
Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
Neisseria lactamica (NRL 2118)
Neisseria meningitidis (ATCC 13077)
Neisseria sicca (ATCC 29256)
Peptostreptococcus anaerobius
Proteus vulgaris (ATCC 21117, 8427, 33420)
Serratia marcescens
Staphylococcus aureus (Cowan stam)
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus faecalis (ATCC 14508)
Streptococcus pyogenes (ATCC27762)
Treponema pallidum
Trichomonas vaginalis
Ureaplasma urealyticum
* Både E. coli-stammen som användes för att odla plasmider (HB101) och ett kliniskt isolat av E. coli
testades.
Nedan anges de virus- eller plasmid-DNA eller humansera som testades:
Adenovirus 2
Cytomegalovirus
Epstein-Barrvirus
Hepatit B-ytantigen-positivt serum
Herpes simplex I
Herpes simplex II
Humant immunbristvirus (HIV, RT DNA)
Simian-virus typ 40 (SV40)
Humant papillomvirus typ 1
Humant papillomvirus typ 2
Humant papillomvirus typ 3
Humant papillomvirus typ 4
Humant papillomvirus typ 5
Humant papillomvirus typ 8
Humant papillomvirus typ 13
Humant papillomvirus typ 30
pBR322
Den enda plasmid som uppvisade korsreaktivitet i hc2 högrisk HPV DNA Test var pBR322. Korsreaktivitet
mellan pBR322 och hc2 högrisk HPV DNA Test-prob är inte oväntad eftersom det är svårt att ta bort allt
vektor pBR322 DNA när HPV-delen isoleras. Närvaro av pBR322 homologa sekvenser har rapporterats i
humangenitala prover och falskt positiva resultat kan inträffa vid närvaro av bakteriella plasmider i höga
koncentrationer. Av 298 kliniska prover som hade positivt resultat med hc2 högrisk HPV DNA Test visade
emellertid att inga positiva resultat berodde på pBR322 när de testades med en pBR322-prob. Således
synes sannolikheten av falskt positiva resultat med hc2 högrisk HPV DNA Test, orsakade av homologa
pBR322-sekvenser i kliniska prover, vara låg.
36
KORSHYBRIDISERING
Arton olika HPV-typer (hög- och lågrisk) testades med hc2 högrisk HPV DNA Test med HPV DNAkoncentrationer på 4 ng/ml. Alla av högrisk HPV-målen var positiva med högrisk HPV-prob. Den här
studien visade att korshybridisering sker i liten utsträckning mellan HPV-typerna 6 och 42 och högrisk
HPV-proben. Patientprover med höga koncentrationer (4 ng/ml eller högre) av HPV 6 eller HPV 42 DNA
kan vara falskt positiva med hc2 högrisk HPV DNA Test. Den kliniska betydelsen av detta är att patienter
med 4 ng/ml eller högre av HPV 6 eller HPV 42 DNA kanske onödigtvis remitteras till kolposkopi.
hc2 högrisk HPV DNA Test har också visats korsreagera med HPV-typerna 40, 53 och 66. Dessa typer är
sällsynta och bevisen är otillräckliga för att fastställa den exakta korrelationen mellan infektion med dessa
38
typer och utvecklingen av höggradig sjukdom . Det har också rapporterats i litteraturen att komplexa
prober liknande de som används i detta test kan ge upphov till falskt positiva resultat pga.
39
korshybridisering med HPV-typerna 11, 53, 54, 55, 66, MM4, MM7, MM8 eller MM9. Även om åtskilliga
av dessa HPV-typer är sällsynta eller nya typer, som inte påträffas ofta vid höggradig sjukdom, så kan
patienter vars prover innehåller höga koncentrationer av dessa HPV DNA-typer felaktigt remitteras till
kolposkopi.
EFFEKTEN AV BLOD OCH ANDRA SUBSTANSER PÅ PROVER I TRANSPORTMEDIUM FÖR
PROVER
Effekten av blod eller andra potentiellt störande, definierade eller odefinierade substanser utvärderades i
hc2 högrisk HPV DNA Test. Helblod, sköljvätska, svampdödande kräm och preventivmedelskräm (ämnen
som vanligen påträffas i cervixprover) tillsattes negativa och positiva prover i transportmedium för prover
(kliniska provpooler och icke-kliniska prover) i koncentrationer som kan finnas i cervixprover. Inga falskt
positiva resultat observerades med något av de fyra substanserna oavsett koncentration. Emellertid kan
falskt negativa resultat rapporteras för kliniska prover med HPV DNA-koncentrationer nära analysens
positiva cutoff (1 pg/ml) om höga koncentrationer av svampdödande kräm eller preventivmedelskräm är
närvarande. Det är emellertid osannolikt att ett kliniskt prov består nästan helt och hållet av en av dessa
substanser eftersom cervix rengörs rutinmässigt innan provtagning för Pap smear och HPV-testning görs.
EFFEKTEN AV BLOD OCH ANDRA SUBSTANSER PÅ PROVER I PRESERVCYT-LÖSNING
Effekten av blod eller andra potentiellt störande, definierade eller odefinierade substanser potentiellt
närvarande i kliniska prover i PreservCyt-lösning utvärderades i hc2 högrisk HPV DNA Test. Helblod,
sköljvätska, svampdödande kräm och preventivmedelskräm (ämnen som vanligen påträffas i
cervixprover) tillsattes negativa och positiva kliniska provpooler i PreservCyt-lösning i koncentrationer
som kan finnas i cervixprover. Inga falskt positiva eller negativa resultat observerades med något av de
fyra substanserna oavsett koncentration. Dessutom inhiberar inte substanser som naturligt ingår i vissa
kliniska prover detekteringen av HPV DNA med hc2 högrisk HPV DNA Test.
REPRODUCERBARHETEN AV hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST MED KLINISKA PROVER TAGNA I
TRANSPORTMEDIUM FÖR PROVER
Reproducerbarheten för hc2 högrisk HPV DNA Test med kliniska prover tagna i transportmedium för
prover fastställdes i en studie med 20 kliniska pooler (tio positiva och tio negativa) som bereddes genom
att kombinera tidigare denaturerade och testade prover tagna med transportmedium för prover. Proverna
testades med fyra replikat dagligen i fem dagar med totalt 20 replikat per prov. Testning utfördes med
användning av en kombinerad prob som bestod av hc2 högrisk HPV DNA Test-prob och prober med
lågrisk HPV-typer. Medelvärden, standardavvikelser och 95 % konfidensintervaller runt medelvärdet (KI)
beräknades för varje prov per dag under fem dagar och visas i tabell 17. Analysens reproducerbarhet
förväntades inte att visa någon skillnad om endast högrisktypen av HPV-proben i denna sats användes.
37
Tabell 17
Medelvärde RLU/CO med konfidensintervall och procent positiva
(medelvärde RLU/CO i fallande ordning)
Prov-ID
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
10
20
11
12
15
13
16
17
14
18
19
7
4
9
1
2
8
3
6
5
Medelvärde
RLU/CO
3,18
1,43
1,25
1,21
1,20
1,07
1,06
1,04
0,98
0,92
0,72
0,40
0,38
0,37
0,35
0,35
0,32
0,30
0,27
0,26
KI
3,02-3,35
1,36-1,50
1,20-1,28
1,15-1,27
1,14-1,25
1,01-1,11
1,01-1,09
1,00-1,06
0,92-1,02
0,87-0,96
0,68-0,75
0,33-0,46
0,35-0,39
0,32-0,41
0,32-0,36
0,31-0,37
0,29-0,34
0,27-0,31
0,24-0,30
0,23-0,28
% positiva
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
80 (16/20)
75 (15/20)
80 (16/20)
45 (9/20)
20 (4/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
För de fem prover med ett medelvärde RLU/CO på 20 % eller mer över cutoff (nr.1-5) så var 100 av 100
replikat (100,0 %) positiva. För de fem prover med ett medelvärde RLU/CO inom 20 % över eller under
analysens cutoff (nr. 6-10) så var 60 av 100 (60 %) replikat positiva och 40 av 100 (40 %) var negativa.
För de tio prover som hade ett medelvärde RLU/CO på mer än 20 % under analysens cutoff så var 200
av 200 replikat (100 %) negativa.
Således var prover med ett medelvärde RLU/CO på 20 % eller mer över cutoff positiva 100 % av tiden
medan prover med ett medelvärde RLU/CO på 20 % eller mer under cutoff var negativa 100 % av tiden.
Detta indikerar att prover med ett medelvärde på 20 % eller mer från cutoff kan förväntas att ge
konsekventa resultat. Prover nära cutoff gav ungefär lika antal positiva och negativa resultat. Dessa data
visar att prover i transportmedium för prover ger reproducerbara resultat med hc2 högrisk HPV DNA Test.
REPRODUCERBARHETEN AV hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST MED KLINISKA PROVER TAGNA I
PRESERVCYT-LÖSNING
Reproducerbarheten av hc2 HÖGRISK HPV DNA Test med kliniska prover tagna i PreservCyt-lösning
fastställdes i en studie med 24 falska prover med en rad olika koncentrationer av HPV DNA. Proverna
bestod av PreservCyt-lösning och vita blodceller, med eller utan HPV 16 plasmidinnehållande bakterier.
Proverna testades med fyra replikat dagligen i fem dagar med totalt 20 replikat per prov. Varje dag under
studiens fem dagar bereddes och testades en 8 ml alikvot från varje prov, enligt instruktionerna i
bipacksedeln för hc2 Sample Conversion Kit. Medelvärden, standardavvikelser och 95 %
konfidensintervall (KI) beräknades för varje prov per dag och under fem dagar och replikat. Medelvärdet
RLU/CO, konfidensintervallet runt medelvärdet och procent positiva replikat visas i tabell 18 för varje prov
i fallande ordning baserat på medelvärdet RLU/CO.
38
Tabell 18
Medelvärde RLU/CO med konfidensintervall och procent positiva
(medelvärde RLU/CO i fallande ordning)
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Provnr.
21
12
13
17
18
15
23
16
20
19
22
11
14
24
3
1
7
2
5
4
9
8
10
6
Medelvärde
RLU/CO
3,51
1,58
1,42
1,38
1,36
1,32
1,17
1,14
1,10
1,06
1,05
1,04
0,94
0,77
0,28
0,27
0,27
0,27
0,26
0,24
0,23
0,22
0,22
0,19
KI
3,19-3,83
1,48-1,69
1,32-1,52
1,23-1,53
1,23-1,48
1,16-1,49
1,06-1,27
1,07-1,20
0,96-1,21
0,95-1,17
0,99-1,10
0,96-1,11
0,86-1,01
0,73-0,81
0,25-0,30
0,24-0,30
0,25-0,30
0,25-0,28
0,24-0,28
0,22-0,25
0,21-0,25
0,18-0,27
0,20-0,25
0,17-0,21
% positiva
100 (20/20)
100 (20/20)
100 (20/20)
90 (18/20)
95 (19/20)
85 (17/20)
75 (15/20)
75 (15/20)
85 (17/20)
45 (9/19)
70 (14/20)
65 (13/20)
25 (5/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
0 (0/20)
För de sex prover med ett medelvärde RLU/CO på 20 % eller mer över cutoff (nr.1-6) så var 114 av 120
replikat (95,0 %) positiva. För de sju prover med ett medelvärde RLU/CO mindre än 20 % över eller under
analysens cutoff (nr. 7-13) så var 88 av 139 replikat (63,3 %) positiva och 51 av 139 (36,7 %) negativa.
För de fyra prover med ett medelvärde RLU/CO mindre än 10 % över eller under cutoff (nr.10-13) så var
41 av 79 replikat (51,9 %) positiva och 38 (48,1 %) negativa. För de 11 prover med ett medelvärde
RLU/CO på mer än 20 % under analysens cutoff, så var 220 av 220 replikat (100 %) negativa.
Således var prover med ett medelvärde RLU/CO på 20 % eller mer över cutoff positiva, mer än 95 % av
tiden, medan prover med ett medelvärde RLU/CO på 20 % eller mer under cutoff var negativa 100 % av
tiden. Detta indikerar att prover med ett medelvärde på 20 % eller mer från cutoff kan förväntas att ge
konsekventa resultat. Prover nära cutoff gav ungefär lika antal positiva och negativa resultat. Dessa data
visar att prover i PreservCyt-lösning ger reproducerbara resultat med hc2 högrisk HPV DNA Test.
REPRODUCERBARHETEN FÖR hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST MED PROVER TAGNA I
SUREPATH-KONSERVERINGSVÄTSKA
Utvärderingar av reproducerbarheten utfördes för att undersöka möjligheten för tre olika laboratorier att
erhålla ett liknande diagnostiskt resultat under olika dagar och i olika körningar med en identisk
uppsättning av prover med känd positiv/negativ HPV-status vid användning av en analyscutoff på 1,0
RLU/CO. Provpanelen för reproducerbarhet bestod av fem HPV-positiva prover, två prover med HPV
DNA-koncentrationer nära analyscutoff och fem negativa HPV-prover.
Panelmedlemmar bereddes genom att kombinera unika SurePath-patientprover med känd negativ och
positiv HPV-status för att erhålla de önskade RLU/CO-värdena. Varje panelmedlem testades dubbelt, två
gånger varje dag under en period av fem dagar vid varje deltagande laboratorium.
39
Tabell 19
Reproducerbarhetsstudie: SurePath-prover
Kvalitativa resultat efter panelmedlem
Panelmedlem
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Medelvärde
RLU/CO
0,20
0,21
0,22
0,28
0,36
0,83
1,17
19,47
25,65
81,52
154,18
765,29
Förväntat
värde
negativt
negativt
negativt
negativt
negativt
negativt
positivt
positivt
positivt
positivt
positivt
positivt
HPV-positivt
n (%)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
2 (3,3)
2 (3,3)
13 (21,7)
26 (43,3)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
HPV-negativt
n (%)
60 (100)
60 (100)
60 (100)
58 (96,7)
58 (96,7)
47 (78,3)
34 (56,7)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
REPRODUCERBARHETEN FÖR SUREPATH-RESULTAT VID ANVÄNDNING AV
HALVAUTOMATISERAT QIAGEN RAPID CAPTURE-SYSTEM FÖR ANALYSBEHANDLING
Reproducerbarheten för SurePath-provresultat vid användning av QIAGEN Rapid Capture-system för
analysbehandling jämfört med resultat som erhölls vid användning av manuell analysbehandling. Två
jämförande tester utfördes på separata alikvoter av samma behandlade prov.
Tabell 20
SurePath-resultatöverensstämmelse med RCS (inom prov)
(RCS kontra manuell analys)
Positiv överensstämmelse %
95 % CI
(n/N)
Hög positiv
underuppAlla positiva
sättning
(RLU/CO ≥ 2,5)
99,0
100
417/421
375/375
97,6, 99,7
99,0, 100
Negativ överensstämmelse %
95% CI
(n/N)
Låg negativ
underuppAlla negativa
sättning
RLU/CO (< 0,80)
97,7
98,7
1057/1079
1050/1064
96,9, 98,7
97,8, 99,28
40
BEGRÄNSNINGAR I TESTFÖRFARANDET
För in vitro-diagnostisk användning
Se användarhandboken till Rapid Capture-systemet för ytterligare begränsningar hos förfarandet
som är specifikt för användning av systemet för högkapacitetstestning.
•
hc2 högrisk HPV DNA Test för humant papillomvirus typ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,
59 och 68 rekommenderas inte för utvärdering av misstänkta fall av sexuellt övergrepp.
•
Prevalensen av HPV-infektioner i en population kan påverka prestandan. Positiva förväntade
värden minskar vid test av populationer med låg prevalens eller för individer som inte har någon
risk för infektion.
•
Ett negativt resultat utesluter inte möjligheten av en HPV-infektion då en mycket låg
infektionsnivå eller provtagningsfel kan ge falskt negativa resultat. Förutom detta så detekterar
det här testet inte DNA av HPV-lågrisktyper (6, 11, 42, 43, och 44).
•
hc2 högrisk HPV DNA Test kan endast användas med cervixprover tagna med DNAPap eller HC
Cervical Sampler eller biopsier tagna med transportmedium för prover eller cervixprover tagna
med provtagningsanordning av borsttyp eller borste/spatel-kombination och placerade i
PreservCyt-lösning eller cervixprover insamlade i SurePath-konserveringsvätska. Biopsiprover
kan endast testas om de omedelbart placeras i transportmedium för prover och förvaras i -20 °C
tills analysen körs.
•
DNAPap eller HC Cervical Sampler ska inte användas för provtagning på gravida kvinnor.
•
Infektion med HPV är inte en definitiv indikator på närvaro av höggradig cervixsjukdom, inte heller
innebär det att alla fall utvecklar höggradig sjukdom eller cancer.
•
Korshybridisering mellan HPV-typ 6, 11, 40, 42, 53, 54, 55, 66, MM4, MM7, MM8 och MM9 och
högrisk HPV-prob förekommer i liten utsträckning. Patienter med prover som innehåller höga
koncentrationer av dessa HPV-typer kan felaktigt remitteras till kolposkopi.38-39
•
hc2 högrisk HPV DNA Test har konstruerats för att detektera högrisk HPV-typer och inkluderar
39, 58, 59 och 68. Analytiska studier, utförda av QIAGEN, med klonat plasmid-DNA från HPV
visar att denna analys detekterar dessa typer vid koncentrationer mellan 0,62 pg/ml till 1,39
pg/ml. Detta är ekvivalent med detektionsegenskaper för andra HPV-typer som hc2 högrisk HPV
DNA Test testar för. QIAGEN kunde bara validera detekteringen av dessa typer för ett begränsat
antal kliniska prover. På grund av den låga prevalensen för dessa typer i befolkningen i allmänhet
(såsom visats av Bosch et. al.35.), så har hc2 högrisk HPV DNA Test-prestandaegenskaper för
detektering av HPV-typerna 39, 58, 59 och 68 inte bekräftats statistiskt.
•
Om höga koncentrationer av svampdödande kräm, preventivmedelskräm eller sköljvätska är
närvarande när provtagning för HPV-testning sker och proverna innehåller HPV DNAkoncentrationer som ger RLU/CO-värden nära analysens cutoff, så kan sannolikt falskt negativa
resultat erhållas.
•
Korsreaktivitet mellan hc2 högrisk HPV DNA Test-proben och plasmiden pBR322 är möjlig.
Närvaro av pBR322 homologa sekvenser har rapporterats i humangenitala prover och falskt
positiva resultat kan inträffa vid närvaro av bakteriella plasmider i höga koncentrationer.
41
REFERENSER
1. Broker, T. R.; Botchan, M. Papillomaviruses: retrospectives and prospectives. In: DNA Tumor
Viruses. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1986: 17-36. From the
1985 Cancer Cells Conference at Cold Spring Harbor.
2. Lorincz, A. T.; Reid, R. Association of human papillomavirus with gynecologic cancer. Current
Opinion in Oncology 1:123-132; 1989.
3. Jenson, A. B.; Kurman, R. J.; Lancaster, W. D. Human papillomaviruses. In: Belshe, R. B.
Textbook of Human Virology. Littleton, MA: PSG-Wright; 1984: 951-968.
4. Becker, T. M.; Stone, K. M.; Alexander, E. R. Genital human papillomavirus infection: a growing
concern. Obstet Gynecol Clin North Am 14(2):389-396; 1987.
5. McCance, D. J.; Walker, P. G.; Dyson, J. L.; Coleman, D. V.; Singer, A. Presence of human
papillomavirus DNA sequences in cervical intraepithelial neoplasia. Br Med J 287:784-788; 1983.
6. Naghashfar, Z.; Sawada, E.; Kutcher, M. J.; Swancar, J.; Gupta, J.; Daniel, R.; Kashima, H.;
Woodruff, J. D.; Shah, K. Identification of genital tract papillomaviruses HPV-6 and HPV-16 in
warts of the oral cavity. J Med Virol 17:313-324; 1985.
7. Gissmann, L.; Wolnik, L.; Ikenberg, H.; Koldovsky, U.; Schnurch, H. G.; zur Hausen, H. Human
papillomavirus types 6 and 11 DNA sequences in genital and laryngeal papillomas and in some
cervical cancers. PNAS USA 80:560-563; 1983.
8. Munoz, N.; Bosch, F. X.; Shah, K. V.; Meheus, A., Eds. The Epidemiology of Cervical Cancer and
Human Papillomavirus. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 1992. IARC
Scientific Publication No. 119.
9. Reid, R.; Greenberg, M.; Jenson, A. B.; Husain, M.; Willett, J.; Daoud, Y.; Temple, G.; Stanhope,
C. R.; Sherman, A. I.; Phibbs, G. D.; Lorincz, A. T. Sexually transmitted papillomaviral infections.
I. The anatomic distribution and pathologic grade of neoplastic lesions associated with different
viral types. Am J Obstet Gynecol 156(1):212-222; 1987.
10. Fuchs, P. G.; Girardi, F.; Pfister, H. Human papillomavirus DNA in normal, metaplastic,
preneoplastic and neoplastic epithelia of the cervix uteri. Int J Cancer 41:41-45; 1988.
11. Lorincz, A. T.; Temple, G. F.; Kurman, R. J.; Jenson, A. B.; Lancaster, W. D. Oncogenic
association of specific human papillomavirus types with cervical neoplasia. JNCI 79(4):671-677;
1987.
12. Lorincz, A. T.; Lancaster, W. D.; Temple, G. F. Cloning and characterization of the DNA of a new
human papillomavirus from a woman with dysplasia of the uterine cervix. J Virol 58(1):225-229;
1986.
13. Beaudenon, S.; Kremsdorf, D.; Croissant, O.; Jablonska, S.; Wain-Hobson, S.; Orth, G. A novel
type of human papillomavirus associated with genital neoplasias. Nature 321:246-249; 1986.
14. Lorincz, A. T.; Quinn, A. P.; Lancaster, W. D.; Temple, G. F. A new type of papillomavirus
associated with cancer of the uterine cervix. Virology 159:187-190; 1987.
15. Naghashfar, Z. S.; Rosenshein, N. B.; Lorincz, A. T.; Buscema, J.; Shah, K. V. Characterization of
human papillomavirus type 45, a new type 18-related virus of the genital tract. J gen Virol
68:3073-3079; 1987.
16. Nuovo, G. J.; Crum, C. P.; de Villiers, E. M.; Levine, R. U.; Silverstein, S. J. Isolation of a novel
human papillomavirus (type 51) from a cervical condyloma. J Virol 62(4):1452-1455; 1988.
17. Shimoda, K.; Lorincz, A. T.; Temple, G. F.; Lancaster, W. D. Human papillomavirus type 52: a
new virus associated with cervical neoplasia. J gen Virol 69:2925-2928; 1988.
18. Lorincz, A. T.; Quinn, A. P.; Goldsborough, M. D.; McAllister, P.; Temple, G. F. Human
papillomavirus type 56: a new virus detected in cervical cancers. J gen Virol 70:3099-3104; 1989.
19. Lorincz, A. T.; Quinn, A. P.; Goldsborough, M. D.; Schmidt, B. J.; Temple, G. F. Cloning and
partial DNA sequencing of two new human papillomavirus types associated with condylomas and
low-grade cervical neoplasia. J Virol 63(6):2829-2834; 1989.
42
20. Beaudenon, S.; Kremsdorf, D.; Obalek, S.; Jablonska, S.; Pehau-Arnaudet, G.; Croissant, O.;
Orth, G. Plurality of genital human papillomaviruses: characterization of two new types with
distinct biological properties. Virology 161:374-384; 1987.
21. Lorincz, A. T.; Reid, R.; Jenson, A. B.; Greenberg, M. D.; Lancaster, W.; Kurman, R. J. Human
papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogenital types.
Obstet Gynecol 79:328-337; 1992.
22. Koutsky, L. A.; Holmes, K. K.; Critchlow, C. W.; Stevens, C. E.; Paavonen, J.; Beckmann, A. M.;
DeRouen, T. A.; Galloway, D. A.; Vernon, D.; Kiviat, N. B. A cohort study of the risk of cervical
intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 in relation to papillomavirus infection. N Engl J Med
327:1272-1278; 1992.
23. Nieminen, P.; Aho, M.; Vesterinen, E.; Stellato, G.; Vaheri, A.; Soares, V. R. X.; Paavonen, J.
Natural history of HPV infection: preliminary results of a cohort study [abstract]. In: 1991
Papillomavirus Workshop. Seattle, WA: 1991: 77.
24. Sehulster, L. M.; Hollinger, F. B.; Dreesman, G. R.; Melnick, J. L. Immunological and biophysical
alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl Envir Microbiol
42(5):762-767; 1981.
25. Spire, B.; Barré-Sinoussi, F.; Montagnier, L.; Chermann, J. C. Inactivation of lymphadenopathy
associated virus by chemical disinfectants. Lancet; 1984 October 20: pp. 899-901.
26. Martin, L. S.; McDougal, J. S.; Loskoski, S. L. Disinfection and inactivation of the human T
lymphotropic virus type III/lymphadenopathy-associated virus. J Infect Dis 152(2):400-403; 1985.
27. Lorincz, A. T.; Schiffman, M. H.; Jaffurs, W. J.; Marlow, J.; Quinn, A. P.; Temple, G. F. Temporal
associations of human papillomavirus infection with cervical cytologic abnormalities. Am J Obstet
Gynecol 162(3):645-651; 1990.
28. Morrison, E. A. B.; Ho, G. Y. F.; Vermund, S. H.; Goldberg, G. L.; Kadish, A. S.; Kelley, K. F.;
Burk, R. D. Human papillomavirus infection and other risk factors for cervical neoplasia: a
case-control study. Int J Cancer 49:6-13; 1991.
29. Kahn, T.; Schwarz, E.; zur Hausen, H. Molecular cloning and characterization of the DNA of a
new human papillomavirus (HPV 30) from a laryngeal carcinoma. Int J Cancer 51:61-65; 1986.
30. Schiffman, M. Latest HPV findings: some clinical implications. Cont. OB/GYN 38(10):27-40; 1993.
31. Volpers, C.; Streeck, R. E. Genome organization and nucleotide sequence of human
papillomavirus type 39. Virology 181:419-423; 1991.
32. Matsukura, T.; Sugase, M. Molecular cloning of a novel human papillomavirus (type 58) from an
invasive cervical carcinoma. Virology 177:833-836; 1990.
33. Rho, J.; Roy-Burman, A.; Kim, H.; de Villiers, E.M.; Matsukura, T.; Choe, J. Nucleotide sequence
and phylogenetic classification of human papillomavirus type 59. Virology 203:158-161; 1994.
34. Longuet, M.; Beaudenon, S.; Orth, G. Two novel genital human papillomavirus (HPV) types,
HPV68 and HPV70, related to the potentially oncogenic HPV39. J Clin Microbiol 34(3):738-744;
1996.
35. Bosch, F.X.; Manos, M.M.; Munoz, N.; Sherman, M.; Jansen, A.M.; Peto, J.;Schiffman, M.H.;
Moreno,V.; Kurman,R.; Shah, K.V.; International Biological Study on Cervical Cancer (IBSCC)
Study Group. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective.
JNCI 87(11):796-802; 1995.
36. Wheeler, C.M.; Stewart, A.M.; Gravitt, P.E.; Cheng, S. Generation of entire human papillomavirus
genomes by long PCR: frequency of errors produced during amplification. Genome Research
5(1):79-88; 1995.
37. RD Burke, P Kelly, J Feldman, et. al., Declining Prevalence of Cervicovaginal Human
Papillomavirus Infection With Age Is Independent of Other Risk Factors, Sexually Transmitted
Diseases, July-August, 1996:333-341).
38. Meyer, T., et. al., Association of Rare Human Papillomavirus Types with Genital Premalignant
and Malignant Lesions, J. Infectious Diseases, 178:252-255 (1998).
43
39. Vernon, S. D.; Unger, E. R.;and Williams, D.; Comparison of Human Papillomavirus Detection
and Typing by Cycle Sequencing, Line Blotting, and Hybrid Capture, JCM, Feb. 2000, p. 651-655.
40. CDC. Recommendations for Prevention of HIV Transmission in Health-Care Settings. MMWR
1987;36(2S):3S-18S.
41. Sehulster L.M., Hollinger F.B., Dreesman G.R., et al. Immunological and Biophysical Alteration of
Hepatitis B Virus Antigens by Sodium Hypochlorite Disinfection. Appl Envir Microbiol
1981;42(5):762-7.
42. European Guidelines for the Quality Assurance in Cervical Screening. The European Journal of
Cancer, ISSN 0944-1947, 29.A supp. 4; 1993
44
GUIDE FÖR PROBLEMLÖSNING – hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST
Observation
Felaktig eller ingen
färgförändring vid
denaturering
Kvalitetskontrollerna
ger felaktiga resultat
Troliga orsaker
Reagens för denaturering inte tillverkad
korrekt.
Lösningar
Verifiera att reagens för denaturering innehåller indikatorfärgen och har
en mörkviolett färg.
Reagens för denaturering inte tillsatt,
Verifiera att reagens för denaturering tillsattes provet genom att mäta
provvolymen (bör vara 1,5 ml). Om volymen indikerar att reagens för
denaturering inte tillsatts, tillsätt lämplig volym, blanda och fortsätt med
analysen om korrekt färgförändring iakttas.
Prov innehåller blod eller annat materiel som
maskerar färgförändringen.
Den exakta färgförändringen som beskrivits kan inte förväntas på dessa
typer av prov, men testresultaten för hc2 högrisk HPV DNA Test ska
inte påverkas negativt.
Provets pH kan vara ovanligt surt.
Om ingen av de andra orsakerna är tillämpliga kan proverna vara
ovanligt sura och den förväntade färgförändring kommer inte att ske. Tag
ett nytt prov innan ättiksyra appliceras till cervix eftersom inkorrekt pH på
provet kommer att påverka testresultaten negativt.
Om programvaruprotokollet är fel för det test som utförs ska plattan
läsas igen, inom 30 minuter efter tillsättning av detektionsreagens 2,
med korrekt protokoll.
Felaktigt val av programvaruprotokoll för
testet.
Omvänd placering av KK1-LR och KK2-HR
Testa proverna igen.
Omvänd placering av HRK och KK2-HR.
Felaktig
färgförändring under
hybridisering
Testa proverna igen.
Skaka hybridiseringsmikrotiterplatta eller provrörsställ med mikrorör i
ytterligare två minuter. Om det finns rör eller brunnar som fortfarande är
violetta, tillsätt ytterligare 25 µl av passande probblandning och blanda
väl. Om korrekt färgförändring inte sker när probblandning tillsatts och
omblandats och provet inte innehöll blod eller annat materiel ska provet
omtestas.
Otillräcklig blandning av probblandning med
denaturerade kalibratorer, kvalitetskontroller
och/eller prover; eller probblandning inte
tillsatt; eller felaktig reagensvolym tillsatt.
Prov innehåller blod eller annat materiel som
maskerar färgförändringen.
Den exakta färgförändringen som beskrivits kan inte förväntas på dessa
typer av prov, men testresultaten för hc2 högrisk HPV DNA Test ska
inte påverkas negativt.
Provet hade < 1000 µl transportmedium för
prover.
Kontrollera provets ursprungliga volym. Volymen ska vara 1425 µl ± 20 µl
(efter det att 75 µl alikvot har tagits bort för testning). Om volymen är
<1425 µl så innehöll det ursprungliga provet < 1000 µl av
transportmedium för prover. Skaffa ett nytt prov.
Analysen klarar inte
kriterier för
validering. Ingen
signal observeras i
positiva kalibratorer,
kvalitetskontroller
eller i prover
Ingen prob tillsatt till spädningsvätska för prob.
Tillverka probblandning såsom beskrivs i bipacksedeln. Märk rören ordentligt.
Proben kontaminerad med RNas under
beredning.
Använd pipettspetsar med aerosolfilter för att pipettera prob och använd
handskar. Späd ut proben i en steril behållare. Använd endast rena, nya
reagensbehållare för engångsbruk.
Otillräcklig blandning av prob och
spädningsvätska för prob.
Efter tillsats av prob till spädningsvätska för prob, blanda ordentligt
genom att blanda med hög hastighet under minst fem sekunder. En
synlig virvel måste bildas.
Otillräcklig blandning av spädd prob och
denaturerade prover.
Efter tillsats av probblandning och prov till varje hybridiseringsmikrotiterplattbrunn eller hybridiseringsmikrorör, skaka med roterande
skak I med 1100 ± 100 v/min under 3 ± 2 minuter. Kontrollera
färgförändringen från violett till gult i varje brunn eller rör.
Felaktig tid eller temperatur under
hybridiseringssteget.
Hybridisera under 60 ± 5 minuter vid 65 ± 2 °C. Kontrollera
temperaturen på värmeblock för mikrotiterplatta I eller
hybridiseringsvattenbadet. Kontrollera temperaturen på värmeblock för
mikrotiterplatta I. Försäkra dig om att värmeblocket för mikrotiterplatta I
har inställts för uppvärmning av proverna till korrekt temperatur och har
förvärmts under 60 minuter före användning. Försäkra dig om att
vattennivån är tillräcklig för att värma proverna till korrekt temperatur.
Vattenbad ska kalibreras regelbundet.
Otillräcklig blandning under
infångningssteget.
Skaka med roterande skak I under 60 ± 5 minuter vid 20-25 °C såsom
beskrivs i bipacksedeln. Verifiera hastigheten på roterande skak I
genom kalibrering.
Pipettera 75 µl av detektionsreagens 1 i varje brunn med en
8-kanalspipett. Inkubera vid 20-25 °C under 30-45 minuter.
Korrekt mängd av detektionsreagens 1 har
inte tillsatts eller felaktig inkuberingstid.
Pipettera 75 µl av detektionsreagens 2 i varje brunn med en
8-kanalspipett. Inkubera vid 20-25 °C under 15 till 30 minuter.
Korrekt mängd av detektionsreagens 2 har
inte tillsatts eller felaktig inkuberingstid.
För ytterligare instruktioner, se användarhandböckerna för DML 2000
instrumentet och programvara version 2 (avsnittet Underhåll och
problemlösning) och Digene Hybrid Capture System (DHCS V.2)
interaktiva operatörshandledning version 2 eller Digene kvalitativ
programvara eller kontakta din lokala QIAGEN representant.
Felaktig luminometer eller programmering.
45
Observation
Förhöjda RLU-värden
i kalibratorer,
kvalitetskontroller
och/eller prover
(≥ 200 RLU i flera eller
alla brunnar).
Analysen klarar inte
kriterier för
validering.
Låga PK/NK-kvoter
eller stort antal av
lågt positiva prover
med kvoter på < 2,0
(> 20 %). Analysen
klarar inte kriterier för
validering
Troliga orsaker
Reagens för denaturering har inte tillsatts,
eller felaktig reagensvolym tillsatt; eller
otillräcklig blandning av reagens för
denaturering med prover eller kalibratorer.
Lösningar
Verifiera att den repeterande pipetten dispenserar noggrant innan
reagens för denaturering tillsätts. Det är väsentligt att pipetter är
kalibrerade. Tillsätt en halv volym av reagens för denaturering till varje
rör och blanda väl. För att undvika falskt positiva resultat se till att
vätskan sköljer rörets hela inneryta. Kalibratorer och prover ska bli
violetta efter tillsättning av reagens för denaturering.
Ljusläckage i luminometern.
Dörren inte förseglad.
Förseglingen runt dörren bruten.
Kontrollera luminometerns backgrundssignal genom att läsa av en tom
mikrotiterplatta. En avläsning större än 50 RLU indikerar ljusläckage.
För ytterligare instruktioner, se användarhandböckerna för DML 2000
instrumentet och programvara version 2 (avsnittet Underhåll och
problemlösning) och Digene Hybrid Capture System (DHCS V.2)
interaktiva operatörshandledning version 2 eller Digene kvalitativ
programvara eller kontakta din lokala QIAGEN representant.
Kontaminering av detektionsreagens 2 eller
brunnar på fångande mikrotiterplatta med
detektionsreagens 1 eller exogent alkaliskt
fosfatas.
Se kontamineringskontroll i detta problemlösningsavsnitt.
Kontaminerad tvättbuffert.
Se kontamineringskontroll i detta problemlösningsavsnitt.
Kontaminerad automatiserad tvättapparat för
plattor I.
Se kontamineringskontroll i detta problemlösningsavsnitt.
Otillräcklig tvättning av brunnar på fångande
mikrotiterplatta efter inkubering med
detektionsreagens I.
Tvätta mikroplattbrunnarna ordentligt med tvättbuffert sex gånger
genom att varje gång fylla brunnarna så att de rinner över. För
instruktioner om test för kontamination eller funktionsfel, se drift- och
underhållshandbok för automatiserad tvättapparat för plattor I.
Kontamination av mikroplattbrunnar med
detektionsreagens I.
Se till att alla arbetsytor är rena och torra. Var försiktig när
detektionsreagens 1 används. Undvik aerosoler.
Avtorkning av hybridiseringslösning i samma
område på Kimtowels torkdukar eller
liknande luddfria pappershanddukar.
Torka inte av igen på samma område av Kimtowels torkdukar eller
liknande luddfria pappershanddukar som använts tidigare.
Använt felaktiga torkdukar.
För avtorkning använd Kimtowels torkdukar eller liknande luddfria
pappershanddukar.
Otillräcklig beredning av prover.
Tillsätt lämplig volym av reagens för denaturering och blanda ordentligt.
För att undvika falskt positiva resultat se till att vätskan sköljer rörets
hela inneryta med både den manuella metoden och MST Vortexer Imetoden (med den manuella Vortexer-metoden ska röret vändas upp
och ned en gång). En distinkt färgförändring från klar till mörkviolett ska
ses. Inkubera under 45 ± 5 minuter vid 65 ± 2 °C.
Probblandning inte blandad ordentligt eller
otillräckligt med probblandning tillsatt till
analyser.
Bered probblandning såsom beskrivits. Blanda ordentligt och se till att
en synlig virvel bildas. Probblandning måste tillsättas rören med en
positiv ersättningspipett för att tillsäkra noggrann dispensering.
Otillräcklig volym av spädd prob tillsatt till
varje hybridiseringsmikrorör.
Verifiera att 8-kanalspipetten dispenserar noggrant innan probblandning
tillsätts hybridiseringsmikrotiterplatta eller hybridiseringsmikrorör. Tillsätt
25 µl probblandning till varje mikrotiterplattbrunn eller mikrorör som
innehåller denaturerad kalibrator, kvalitetskontroll och kliniska prover.
Kontrollera att 8-kanalspipetten dispenserar noggrant innan
probblandning tillsätts brunnarna på hybridiseringsmikrotiterplattan.
Färgen ska ändras från mörkviolett till gult när probblandningen tillsätts
och blandas ordentligt. Prover i PreservCyt-lösning bli rosa istället för
gula.
Detektionsreagens 1 har förlorat sin aktivitet.
Detektionsreagens 1 ska förvaras vid 2-8 °C. Använd före det
utgångsdatum som anges på satsens ytterkartong.
Otillräcklig infångning.
Infångningssteget ska utföras med roterande skak I inställd på 1100 ±
100 v/min. Validera hastigheten på roterande skak I genom kalibrering.
Otillräcklig tvätt.
Tvätta mikroplattbrunnarna ordentligt med tvättbuffert sex gånger och
fyll brunnarna varje gång så att de rinner över eller använd
automatiserad tvättapparat för plattor I.
Kontaminerad tvättbuffert.
Se kontamineringskontroll i detta problemlösningsavsnitt.
46
Observation
En rad positiva
prover med
ungefärligen samma
RLU-värden
Stor spridning mellan
replikatens %CV.
Falskt positiva
resultat från kända
negativa prover.
Troliga orsaker
Kontaminering av brunnar på fångande
mikrotiterplatta under analysens utförande.
Lösningar
Täck alltid fångande mikrotiterplatta vid inkubation. Undvik att utsätta rör
för aerosolkontaminering när analysen utförs. Använd puderfria
handskar vid hantering.
Kontaminering av detektionsreagens 2
Var försiktig så att reagenset inte kontamineras vid pipettering av
detektionsreagens 2 i brunnar på mikrotiterplatta. Undvik kontaminering
av detektionsreagens 2 med aerosoler från detektionsreagens 1 eller
med laboratoriedamm, osv.
Funktionsfel på automatiserad tvättapparat
för plattor I.
Se kontamineringskontroll i detta problemlösningsavsnitt eller
handboken för Drift och underhåll av tvättapparat för plattor I för
instruktioner om test för kontamination eller funktionsfel.
Kontrollera pipetten för att tillförsäkra att reproducerbara volymer
dispenseras. Kalibrera pipetter rutinmässigt.
Pipettering inte korrekt.
Otillräcklig blandning.
Blanda ordentligt i alla moment. Blanda före och efter
denatureringsinkubation och efter tillsats av probblandning. Se till att en
synlig virvel bildas.
Ofullständig överföring av vätska från
hybridiseringsmikrorör till brunnar på
fångande mikrotiterplatta.
Var noggrann under överföringen från hybridiseringsmikrotiterplattan
eller hybridiseringsmikrorören till brunnarna på fångande
mikrotiterplattan för att säkerställa att reproducerbara volymer överförs.
Felaktiga tvättförhållanden.
Tvätta mikroplattbrunnarna ordentligt med tvättbuffert sex gånger och
fyll brunnarna varje gång så att de rinner över eller använd
automatiserad tvättapparat för plattor I och passande protokoll för
automatiserad tvättapparat för plattor I.
Kontamination av mikroplattbrunnar med
detektionsreagens I.
Detektionsreagens 2 kontaminerat.
Se till att alla arbetsytor är rena och torra. Var försiktig när
detektionsreagens 1 används. Undvik aerosoler.
Var försiktig så att du inte korskontaminerar prover när du alikvoterar
detektionsreagens 2 mellan prover. Om endast del av satsen används
så ska den erforderliga volymen för testet alikvoteras till en ren
reagensbehållare för engångsbruk innan pipetten fylls.
Kontamination av mikroplattbrunnar med
detektionsreagens I.
Tvätta mikroplattbrunnarna ordentligt med tvättbuffert sex gånger och
fyll brunnarna varje gång så att de rinner över eller använd
automatiserad tvättapparat för plattor I. Det ska inte finnas någon synlig
rosa vätska kvar i brunnarna på mikroplattan efter tvätten.
Avtorkning på samma område, över flera
rader, på Kimtowels torkdukar eller liknande
luddfria pappershanddukar.
Torka inte av på samma område som använts förut.
Tillsätt lämplig volym av reagens för denaturering och blanda ordentligt.
För att undvika falskt positiva resultat se till att vätskan sköljer rörets
hela inneryta både med den manuella metoden och MST Vortexermetoden (med den manuella Vortexer-metoden ska röret vändas upp
och ned en gång). För prover i PreservCyt-lösning se till att ordentlig
blandning och återsuspendering av cellpelleten har slutförts före
denatureringsinkubation. Se bipacksedeln för hc2 Sample Conversion
Kit angående detaljer i protokollet. En distinkt färgförändring från klar till
mörkviolett ska ses. Inkubera under 45 ± 5 minuter vid 65 ± 2 °C. För
SurePath-prover, se till att prover inkuberas under 90 ± 5 minuter vid
65 ± 2 °C.
Tvätta mikroplattbrunnarna ordentligt med tvättbuffert sex gånger och
fyll brunnarna varje gång så att de rinner över eller använd
automatiserad tvättapparat för plattor I och passande protokoll för
automatiserad tvättapparat för plattor I.
Otillräcklig beredning av prover.
Felaktiga tvättförhållanden.
Denatureringsmomentet i provbehandlingsproceduren måste utföras i
enlighet med denna bipacksedel. Om provet inte blandas ordentligt eller
röret inte vänds eller skakas på rätt sätt kan det hända att
denatureringen av ospecifika RNA:DNA-hybrider i cervixproverna inte
denatureras tillräckligt. Vid användning av prover i PreservCyt-lösning
eller SurePath-konserveringsvätska är det troligt att det finns sådana
hybrider på insidan av denatureringsröret. För att förebygga risken för
kontaminering av sådant odenaturerat cellmateriel får
mikropipettspetsen inte vidröra sidorna av denatureringsröret när det
denaturerade provet överförs till mikroröret eller mikrotiterplattbrunnen
som används för hybridisering av HPV-proben.
Kontamination av pipettspetsen med
odenaturerat material vid överföring av
denaturerat prov till mikrorör eller brunn på
mikrotiterplatta som används för
hybridisering av HPV-proben.
47
Observation
Förhöjda RLU-värden
för negativ kalibrator
(> 200 RLU). Resten
av analysen fungerar
som den ska.
Analys uppfyller inte
valideringskriterier.
Förhöjd PK/NK-kvot
Troliga orsaker
Detektionsreagens 2 inkuberades vid en
högre temperatur än 20-25 °C.
Lösningar
Kör testet igen och se till att infångnings- och detekteringsstegen
inkuberas vid 20-25 °C.
Detektionsreagens 2 inkuberades längre än
30 minuter.
Läs av plattan 15 minuter efter inkubation vid 20-25 °C (och inte senare
än 30 minuter efter inkubationen).
Detektionsreagens 2 eller tvättbuffert var
kontaminerad med alkaliskt fosfatas eller
detektionsreagens 1.
Se kontamineringskontroll i detta problemlösningsavsnitt.
Testa prover igen.Läs etiketterna på flaskorna för kalibrator och
kvalitetskontroll noggrant för att förhindra att blanda ihop dessa
reagenser.
Omvänd placering av HRK och KK2-HR
48
KONTAMINERINGSKONTROLL
Utvärderat
Kontamineringskontrollförfarande
Tolkning av resultat
reagens
Obs: Var försiktig när detektionsreagens 2 pipetteras för att undvika kontamination. Använd handskar och undvik att vidröra
arbetsytor med pipettspetsar.
Detektionsreagens
• Detektionsreagenskontroll 2 bör vara
• Pipettera 75 µl alikvoterat, resterande och/eller
2
< 50 RLU.
ursprungligt detektionsreagens 2 från flaskan till en
tom brunn på fångande mikrotiterplatta.
• Om värden för detektionsreagens 2 är
< 50 RLU, kan detektionsreagens 2
• Inkubera 20-25 °C i 15 minuter. Undvik direkt solljus.
användas för att upprepa analysen.
• Avläs mikroplattbrunnarna i luminometer.
• Vid kontamination, (> 50 RLU), erhåll
en ny sats och upprepa analysen.
Obs: Test av detektionsreagens 2 i replikat på tre ger
optimal utvärdering av prestanda.
Tvättbuffert• Pipettera 75 µl detektionsreagens 2 till fyra separata
• Detektionsreagenskontroll 2 (brunn 1)
apparat och/eller
brunnar på fångande mikrotiterplatta.
bör vara < 50 RLU.
vattenkälla
• Märk brunnar 1-4.
• Jämför RLU-värdet från brunn 2, 3
och 4 med detektionsreagenskontroll
• Brunn 1 är detektionsreagenskontroll 2.
2 RLU-värde (brunn 1). De olika RLU• Pipettera 10 µl tvättbuffert från tvättflaskan till brunn 2.
värdena för brunn 2, 3 & 4 bör inte
• Låt tvättbuffert flöda genom tvättslangen.
överstiga 50 RLU för
• Pipettera 10 µl tvättbuffert från slangen till brunn 3.
detektionsreagenskontroll 2 RLU• Erhåll en alikvot vatten som användes för att bereda
värde (brunn 1).
tvättbufferten. Pipettera 10 µl vatten till brunn 4.
• Värden som överstiger 50 RLU för
• Inkubera 20-25 °C i 15 minuter. Undvik direkt solljus.
detektionsreagenskontroll 2 anger
• Avläs mikroplattbrunnarna i luminometer.
kontamination. Se Reagenstillverkning
och förvaring för instruktioner om
rengöring och underhåll av
tvättapparat.
Automatiserad
• Pipettera 75 µl detektionsreagens 2 till fem separata
• Detektionsreagenskontroll 2 (brunn 1)
tvättapparat för
brunnar på fångande mikrotiterplatta.
bör vara < 50 RLU.
plattor
• Märk brunnar 1-5.
• Jämför RLU-värdet från brunn 2, 3, 4
och 5 med detektionsreagenskontroll
• Brunn 1 är detektionsreagenskontroll 2.
2 RLU-värde (brunn 1). De olika RLU• Pipettera 10 µl tvättbuffert från tvättapparatens flaska
värdena för brunn 2, 3, 4 & 5 bör inte
märkt Wash till brunn 2.
överstiga 50 RLU för
• Pipettera 10 µl sköljvätska från tvättapparatens flaska
detektionsreagenskontroll 2 RLUmärkt Rinse till brunn 3.
värde (brunn 1).
• Tryck på påfyllningsknappen på tvättapparaten, vilket
• Värden som överstiger 50 RLU för
gör att tvättbuffert flödar genom slangarna.
detektionsreagenskontroll 2 anger
• Pipettera 10 µl tvättbuffert från tanken till brunn 4.
kontamination av tvättapparaten för
• Tryck på sköljningsknappen på tvättapparaten, vilket
plattor.
gör att sköljvätska flödar genom slangarna.
• Se användarhandboken för
• Pipettera 10 µl sköljvätska från tanken till brunn 5.
automatiserad tvättapparat för plattor
• Täck och inkubera i 15 minuter vid 20-25 °C. Undvik
I, Dekontamineringsförfarande.
direkt solljus.
•
Avläs mikroplattbrunnarna i luminometer.
49
KONTAKTINFORMATION
Använd kontaktinformationsbladet som medföljer denna produkt för att kontakta din lokala QIAGEN
representant.
Hybrid Capture, Digene och Rapid Capture är registrerade varumärken som tillhör QIAGEN Gaithersburg, Inc.
DNAPap, Cervical Sampler, DML 2000, EXPAND-4, Female Swab Specimen Collection Kit, HC, och Specimen
Transport Medium är varumärken som tillhör QIAGEN Gaithersburg, Inc.
Denna produkt och dess användningsmetoder omfattas av ett eller flera av följande patent:
Amerikanska patentnummer för HPV
4,849,331 ● 4,849,332 ● 4,849,334 ● 4,908,306 ● 5,411,857 ● 5,643,715 ● 5,712,092 ● 5,876,922 ● 5,952,487 ●
5,958,674 ● 5,981,173 ● 6,107,086
Utländska patentnummer för HPV
EP 294,659 ● JP 1047383 ● EP 0192001B1 ● EP 0591376B1 ● CA 1,339,729 ● EP 0370625B1 ● JP 3076578 ●
JP 02796332
Amerikanska patentnummer för Hybrid Capture
4,732,847 ● 4,865,980 ● 6,228,578B1
Övriga patent
®
Substratet CDP-Star är skyddat av ett eller flera av amerikanska patentnummer
4,931,569 ● 4,978,614 ● 5,145,772 ● 5,326,882 ● 5,538,847 ● 5,582,980 ● 5,851,771
Registrerade varumärken som tillhör andra företag:
CDP-Star: Tropix, Inc.
Kimtowels Wipers: Kimberly-Clark Corporation
Eppendorf Repeater: Eppendorf-Netheler-Hinz
DuraSeal: Diversified Biotech, Inc
Parafilm: American Can Co.
ThinPrep and PreservCyt: Cytyc Corporation
Windows: Microsoft Corporation
TriPath Imaging and SurePath: TriPath Imaging, Inc., Burlington, North Carolina, USA
Varumärken som tillhör andra företag:
Prepstain: TriPath Imaging, Inc., Burlington, North Carolina, USA
50
ÖVERSIKT ÖVER hc2 HÖGRISK HPV DNA TEST
Viktigt: Det är viktigt att du är helt förtrogen med procedurens detaljer innan du använder denna
sammanfattning.
Procedur
Manuell blandningsmetod
Metod med (MST) Vortexer I (för flera provrör)
Märk hybridiseringsmikrorören
Bered reagens för denaturering
↓
Pipettera reagens för denaturering (volymen är ekvivalent med halva
provvolymen) i kalibratorer, kvalitetskontroller och prover.
Blanda varje prov, kalibrator och kvalitetskontroll individuellt under
fem sekunder vid hög hastighet (se bipacksedeln för detaljer).
Kontrollera att alla rör uppvisar en violett färg.
↓
Inkubera vid 65 ± 2 °C under 45 ± 5 minuter.
↓
Bered HPV-probblandning.
↓
↓
↓
Vattenbadsmetod
Märk hybridiseringsplattan
Bered reagens för denaturering
↓
Pipettera reagens för denaturering (volymen är ekvivalent med halva
provvolymen) i kalibratorer, kvalitetskontroller och prover.
Kontrollera att alla rör uppvisar en violett färg.
↓
Täck stället med film och lock.
↓
Blanda under tio sekunder.
↓
Inkubera vid 65 ± 2 °C under 45 ± 5 minuter.
↓
Bered HPV-probblandning.
↓
Metod med värmeblock för mikrotiterplatta I
Blanda denaturerade prover ordentligt och pipettera 75 µl i rören.
È
Inkubera under tio minuter vid 20-25 °C.
Blanda denaturerade prover ordentligt och pipettera
75 µl i mikrotiterplattans brunnar
È
Inkubera under tio minuter vid 20-25 °C.
↓
Pipettera 25 µl högrisk HPV-probblandning i rören.
↓
↓
Pipettera 25 µl högrisk HPV-probblandning itill mikrotiterplattans
brunnar.
↓
Täck mikrorören med ett lock och skaka med roterande skak I vid
Täck mikrorören med ett lock och skaka med roterande skak I vid
1100 ± 100 v/min under 3 ± 2 minuter.
1100 + 100 v/min under 3 ± 2 minuter.
Kontrollera att alla rör uppvisar en gul färg.
↓
Kontrollera att alla brunnar uppvisar en gul färg.
Inkubera vid 65 ± 2 °C under 60 ± 5 minuter. Bered fångande
↓
mikrotiterplatta.
Inkubera vid 65 ± 2 °C under 60 ± 5 minuter. Bered fångande
↓
mikrotiterplatta.
↓
Överför innehållet från varje brunn på hybridiseringsplattan till motsvarande brunn på den fångande mikrotiterplattan med en 8-kanals pipett.
Täck med ett plattlock eller ett lock.
Skaka med 1100 ±100 v/min vid 20-25 °C under 60 ± 5 minuter. Bered tvättbuffert.
↓
Dekantera och torka av fångande mikrotiterplattan (se bipacksedeln för detaljer).
↓
Pipettera 75 µl av detektionsreagens 1 i varje brunn på fångande mikrotiterplatta.
Täck fångande mikrotiterplatta med plattlock, plastfilm eller liknande.
Inkubera vid 20-25 °C under 30-45 minuter. Tvätta plattan med önskad metod.
↓
Metod med automatiserad tvättapparat för plattor I
Metod för manuell tvättning
Dekantera och torka av fångande mikrotiterplatta (se bipacksedeln
för detaljer).
Placera plattan på tvättapparaten och tryck på “START/STOP” för att
starta.
↓
↓
Tvätta sex gånger.
Fortsätt till nästa steg.
↓
↓
↓
↓
Torka av på luddfria pappershanddukar.
↓
Pipettera 75 µl av detektionsreagens 2 i varje brunn på fångande mikrotiterplatta.
Inkubera vid 20-25 °C under 15-30 minuter.
↓
Läs av fångande mikrotiterplattan med luminometern.
↓
Validera testet och tolka resultatet.
51