Tarmlaboration –
in vitro undersökning av farmaka som påverkar glatt muskulatur
Målet med laborationen är att
1. demonstrera en klassisk farmakologisk försöksuppställning.
2. visa konstruktion av en spädningsserie.
3. visa konstruktionen av dos-respons kurvor, samt hur antagonister förskjuter
agonistens dos-responskurva.
4. demonstrera olika läkemedelseffekter (kolinerga och adrenerga agonister och
antagonister, morfin, kalciumantagonister) på tarmmotilitet och annan glatt
muskulatur.
5. visa en funktionell metod att karaktärisera ett receptoruttryck.
Frågor att besvara efter laborationen:
Dessa frågor skall besvaras skriftligen i grupper om 3 studenter och inlämnas till
labbansvarig inom 7 dagar från laborationstillfället.
Svaren på dessa frågor kommer till viss del ges under laborationens gång. Det
som inte tas upp vid laborationstillfället får ni själva läsa er till i kurslitteraturen.
1. Vad syftar Krebslösningen till?
2. Vad har gasningen med karbogen för betydelse?
3. Vilka är de funktionella klassiska receptorerna som medierar kontraktion i
tarmen och urinblåsan? Vad ger de för effekt (kontraktion/relaxation)?
4. Vad har tarmen för speciell fysiologi vad gäller spontanaktivitet,
sträckningseffekt samt funktionellt syncytium?
5. Redogör för verkningsmekanismen för de olika droger som används.
6. Konstruera koncentrations-responskurvor för de karbakolsvar (-/+
atropin) ni finner längst bak i kompendiet – du kan rita in samtliga kurvor
för ett organ i samma graf. Uppskatta EC50 för karbakol i frånvaro och
närvaro av antagonisten atropin i samtliga grafer. Ange avslutningsvis din
tolkning av graferna du får fram – hur binder karbakol och atropin till
sin(a) receptor(er)?
Inledning
Tarmen innerveras av parasympatiska och sympatiska nerver, vilka terminerar på
körtelceller, på glatta muskelceller och i ganglier i tarmen. Tillsammans bildar
tarmens innervation det så kallade enteriska nervsystemet i vilket flera olika
transmittorsubstanser medierar excitatoriska och inhibitoriska signaler. Vid sidan
av de klassiska autonoma transmittorerna påverkar ett flertal peptider
tarmmotoriken. Många läkemedel påverkar de receptorer som medierar dessa
1
signaler eller den glatta muskelcellens intracellulära signalöverföring. Exempel är
läkemedel med antikolinerga effekter. Morfin är ett annat läkemedelsexempel
med uttalade tarmeffekter.
För den aktuella laborationen har tarmpreparat, urinblåsa och delar av aorta
utdissekerats från råttor. Ett isolerat preparat behåller sin viabilitet om det
förvaras i näringslösning på lämpligt sätt. I preparatet som dissekerats ut
förekommer inte bara de glatta muskelcellerna utan också mer eller mindre
viabla nervfibrer. I laborationen kan farmaka påverka den glatta muskeln dels
direkt, dels indirekt via nervfibrerna i preparatet.
Utrustning
Utrustning:
Petriskål, sax, pincett, 1 ml spruta, kanyl
Lösningar:
Karbakol
Atropin
Adrenalin
Propranolol
Morfin
Papaverin
Filmen visar hur organbadet fylls med Krebs bikarbonatbuffert upp till
markeringen på badet, tempereringen sätts till 38° C, samt att lösningen gasas
med karbogen (5 % CO2 i syrgas). Ett aortastrip, detrusorstrip och två
tarmpreparat friprepareras (ungefär 2-4 mm). En kort tråd fästs i ena änden;
denna kan gärna bilda en mycket liten ögla. I andra änden fästs en ca 20 cm lång
tråd; öglan hakas på kroken och sänks ned nästan till botten i organbadet. Andra
änden fästs till kraftgivaren. Tråden sträcks med ”hissen”. Registreringen startas.
Preparatet sträcks ånyo; dvs. till maximalt utslag. Gasningen med karbogengas
(5 % CO2 i syrgas) görs försiktigt så att bubblingen inte ger utslag. Preparatet får
kalibrera 50-60 min innan försöket startas.
Utförande
Alla lösningar tillsätts till badet i volymen 0.1 ml.
1. Karbakol tillsättes till de fyra preparaten i stigande koncentration, från 10-8 M
till 10-4 M (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4). När svaret från en koncentration
når en platå tillsättes nästa. Detta kallas kumulativ administrering. Efter
tillsats av högsta koncentrationen sköljs badet så att karbakol försvinner.
Atropin 10-8 M tillsätts. Därefter upprepas försöket.
2. Samma protokoll utförs efter tillsats av atropin 10-7 och atropin 10-6 M.
3. Efter sköljning tillsätts adrenalin (10-8, 10-7, 10-6, 10-5 M) i stigande
koncentration på samma sätt som för karbakol. Protokollet upprepas efter
tillsats av propranolol 10-6 M.
4. Sköljning
5. Isoprenalin tillsätts kumulativt (10-8, 10-7, 10-6 och 10-5 M. Protokollet
upprepas efter tillsats av propranolol 10-6 M.
6. Sköljning
7. Morfin 1 mg/ml tillsättes till tarmpreparaten.
8. Sköljning
9. Papaverin (30 mg/ml) tillsättes tarmpreparaten.
10. Karbakol (10-4 M) tillsätts tarmpreparat och detrusor.
3
Dataset Tarmlabb
Karbakol - Blåsa
Respons (mN)
2,17
8,37
14,57
15,04
15,50
Karbakol - Tarm
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
Karbakol + Atropin 10-8 M (Blåsa)
Respons (mN)
0,31
2,17
8,37
14,57
15,19
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
Karbakol + Atropin 10-7 M (Blåsa)
Respons (mN)
0,16
1,24
6,05
12,25
15,50
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
Karbakol + Atropin 10-6 M (Blåsa)
Respons (mN)
0,16
0,31
0,31
8,53
14,73
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
Respons (mN)
0,97
3,75
6,53
6,74
6,95
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
Karbakol + Atropin 10-8 M (Tarm)
Respons (mN)
0,14
0,97
3,75
6,53
6,81
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
Karbakol + Atropin 10-7 M (Tarm)
Respons (mN)
0,07
0,56
2,71
5,49
6,95
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
Karbakol + Atropin 10-6 M (Tarm)
Respons (mN)
0,07
0,14
0,14
3,82
6,60
log konc.
-8
-7
-6
-5
-4
