Histopatologisk diagnostik

Histopatologisk diagnostik
Crohns sjukdom i munhålan
Linda Bokander
Klara Nilsson
Handledare: Anna Ljunggren
Examensarbete (15 hp)
Tandläkarprogrammet
Januari, 2011
Malmö högskola
Odontologiska fakulteten
205 06 Malmö
Vi vill framföra ett stort tack
till vår handledare
Anna Ljunggren
och till hjälpsam personal på avdelningen för oral patologi
på Malmö Tandvårdshögskola,
Ulf Mattsson för lån av kliniska bilder
samt Klas Sjöberg, läkare på Södra universitetssjukhuset.
2
ABSTRACT
Bokander, L. Nilsson, K.
Histopatologisk diagnostik. Crohns sjukdom i munhålan.
Examensarbete 15 poäng.
Malmö högskola: Odontologiska fakulteten, 2011.
Crohns sjukdom (CS) är en svårdiagnosticerad tarmsjukdom som kan medföra
risk för näringsbrist, smärtsamma åkommor och allmänt nedsatt livskvalité för
patienten. CS kan visa extraintestinala manifestationer till exempel i munhålan
som är lättillgänglig för biopsitagning vid behov samt visuell undersökning, som
rutinmässigt utförs av tandvårdspersonal. Studien avser att besvara hur Crohns
sjukdom yttras histopatologiskt i orala biopsier och dess eventuella betydelse för
fastställning av diagnos. Syftet är att med hjälp av monoklonala antikroppar mot
CD68 granska den histopatologiska inflammationsbilden av Crohns sjukdom i
munhålan hos 17 patienter som anknutits till den patologanatomiska diagnosen
epiteloidcellig granulomatos (ECG). Detta i försök att förtydliga den specifika
inflammationsbilden och för att indikera orala manifestationers och biopsiers möjliga användning för att underlätta diagnostiken av Crohns sjukdom.
Resultatet visade att den för CS representativa inflammationsbilden förekommer i munhålan, vilken förtydligades av den immunohistokemiska infärgningstekniken. Hur sjukdomen yttrar sig makroskopiskt och framförallt histopatologiskt
samt betydelsen av och kunskapen om dessa symtom har belysts.
Diagnos av CS kan inte enbart ställas utifrån den orala inflammationsbilden.
Däremot skulle tandläkares och oralpatologers kunskap om dess orala manifestationer och histopatologiska sjukdomsbild kunna bistå läkare för fastställning av
diagnos. Detta skulle därmed kunna medföra tidigare insatt behandling och möjlighet till lindrat lidande för patienten.
Nyckelord: CD68, Crohns sjukdom, epiteloidcellig granulomatos, histopatologisk
diagnostik, immunohistokemi, orala manifestationer, tvåstegs polymerteknik.
3
Innehållsförteckning
ABSTRACT
3
Innehållsförteckning
4
FÖRKLARINGAR
5
FÖRKORTNINGAR
6
INTRODUKTION
7
Prevalens och incidens i Sverige.
Patologi
Autoimmunitet
NOD2/CARD15
Ärftlighet
Miljöbetingade faktorer
Orala manifestationer
Oral makroskopisk symtombild
Oral histopatologisk symtombild
Granulombildning.
Differentialdiagnoser för histopatologisk sjukdomsbild.
Diagnostik
Behandling
Systemisk behandling
Läkemedelsbehandling.
Diet.
Kirurgisk behandling.
Lokal behandling
Syfte och frågeställning
MATERIAL OCH METOD
7
7
7
7
8
8
8
8
9
10
10
10
11
11
11
11
11
11
12
12
Material
Patienter och positiv kontroll
Infärgningsmaterial
Metod
Antikroppar
Epitop/determinant
Immunohistokemi
12
12
13
13
13
13
14
RESULTAT
15
Makrofagansamlingar
Jätteceller.
Epiteloidcelliga granulom.
16
16
16
DISKUSSION
17
KONKLUSION
19
REFERENSER
20
Bilaga 1
23
4
FÖRKLARINGAR
Följande definitioner har använts:
Ansamling: en ansamling makrofager som visas i högre koncentration inom ett
område i vävnaden (CD68 – brunt pigment) utan tydlig avgränsning mot omkringliggande vävnad och utan specifik form.
Granulom: en samling makrofager (i högre koncentration än omkringliggande
vävnad), där vissa hunnit modifieras till epiteloidceller, med en synbar avgränsning mot närliggande vävnad. Gärna i cirkulär form, med vall av lymfocyter och
närvaro av jätteceller.
Jätteceller: en ansamling makrofager utan storleksordning med sammansmält
cytoplasma. Cellkärnorna är anordnade perifert i hästskoliknande form (gällande
Langhanska jätteceller) eller – ovanligt för denna inflammation – centralt arrangerade (central jättecell).
Sjukdomar:
Catscratch disease: feber och lymfkörtelsjukdom pga infektion av Bartonella
henselae till följd av bit- eller rivsår av katt. [32]
Främmandekroppsreaktion: främmande kroppar bäddas in i vävnaden och orsakar en ansamling av makrofager och granulomatös vävnadsinflammation [18].
Sarkoidos: en systemisk granulomatös sjukdom som drabbar flera organsystem,
oftast lungorna [32].
Tuberkulos: bakteriell granulomatös infektionssjukdom som drabbar lungorna,
främst orsakad av Mycobacterium tuberculosis [33].
Wegeners sjukdom: en systemisk autoimmun sjukdom med granulomatösa lesioner i övre eller nedre luftvägarna, granulomatösa lesioner i njurarna och arteriell samt venös vaskulit. [1]
5
FÖRKORTNINGAR
CARD15:
CD:
CS:
DAB:
ECG:
HTX:
HTX-eo:
Ig:
ITS:
MDP:
MRS:
NOD2:
OFG:
OCS:
PAD:
PRR:
SUS:
UK:
caspasaktiverings rekryterande domän 15
clusters of differentiation
crohns sjukdom
diaminobesidin (kromogen)
epiteloidcellig granulomatos
hematoxylin
hematoxylineosin
immunoglobuliner
inflammatorisk tarmsjukdom
engelskans IBD: inflammatory bowel disease
muramyldipeptid
melkersson-rosenthal syndrom
nukleotidbindande oligomeriserande domän 2
orofacial granulomatos
oral crohns sjukdom
patologanatomisk diagnostik
pattern-recognition receptors
södra universitetssjukhuset
ulcerös kolit
6
INTRODUKTION
Crohns sjukdom (CS) beskrevs för första gången år 1932 av Burrill Bernhard
Crohn med kollegor [1] som en idiopatisk [2], kronisk och transmural inflammation i magtarmkanalens olika segment [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]. Beroende på inflammationens lokalisering klassificeras sjukdomen som: ileit, kolit eller ileocecal. CS har visats följa olika utvecklingsmönster såsom förträngning av tarmlumen eller bildning av fistlar mellan magtarmkanalen och olika organ. Insjuknade
personer kan drabbas av nedsatt näringsupptag (eftersom främst tunntarmen är
involverad) [7] med efterföljande åkommor såsom gallsten, njursten, anemi och
osteoporos på grund av stört upptag av kalcium, vitamin B12 och järn [9]. Andra
vanliga symtom är bukkramper, diarréer, rektala blödningar, uppkastningar, nedsatt aptit, fatigue och viktnedgång. [2, 6, 7]
CS tillhör gruppen inflammatoriska tarmsjukdomar (ITS), vars prevalens i
västvärlden har ökat under det senaste århundradets sista tredjedel [11]; CS och
ulcerativ kolit (UK) utgör de vanligaste sjukdomarna i gruppen [12]. Orsaken till
den ökande sjukdomsprevalensen är fortfarande okänd [13].
Prevalens och incidens i Sverige.
I Sverige har enbart två prevalensstudier gällande ITS utförts, i vilka man granskade Örebro (1991) och Stockholm (2006). Prevalensen av CS i Örebro och
Stockholm visades vara 146 per 100 000 invånare (31 december 1987) respektive
213 per 100 000 invånare (1 januari 2002) [13].
På 60-talet och början av 70-talet kunde man se en ökning av incidensen i Sverige, med en avplaning under 80-talet med variationer inom landet. Exempelvis
rapporterades en incidens på 4,6 och 4,9 nya fall per 100 000 invånare i Stockholm respektive Norrland, samt 6,6 och 6,1 för Örebro respektive Uppsala. Incidensen ökade sedan ytterligare under 1990-talet. [13]
På södra universitetssjukhuset (SUS) i Malmö har man fastställt diagnosen CS
på 764 patienter (22-06-2010) [Bjelkenkrans K. personlig kommunikation].
Man förväntar sig en ökande CS diagnostik med ökad användning av förbättrade undersökningsmetoder, till exempel kapselendoskopi som underlättar diagnos
av CS i tunntarmen [14].
Patologi
ITS anses ha multifaktoriella orsaker som inkluderar både nedärvda, miljöbetingade [7], immunologiska och inflammatoriska faktorer, men dess precisa etiologi är
fortfarande oklar [15]. Den immunologiskt medierade tarmskadan som ses vid CS
med återkommande kronisk inflammation och systemiska manifestationer har på
senare tid tolkats som en autoimmun sjukdomsbild med ett genetiskt samband där
miljöbetingade faktorer kan påverka sjukdomsförloppet men inte anses orsaka
detta [7, 9].
Autoimmunitet
Antiinflammatorisk och immunosupprimerande behandling har förbättrat tillståndet hos patienter med CS och UK, vilket kan tyda på att ITS är följden av en dysreglering av immunförsvaret [9]. CS har ansetts vara en ”T-cellssjukdom” [9, 16]
vilket stöds av den histologiska bilden från tarmens mucosa hos CS patienter som
visar en överdriven aktivering av T-celler [17].
NOD2/CARD15. Intracellulära ”pattern-recognition receptors” (PRRs) är en
grupp receptorer till vilken NOD2/CARD15 tillhör. PRR känner igen mikrobiella
7
beståndsdelar såsom muramyldipeptid (MDP) [11,16] och spelar en viktig roll för
immunförsvaret [16]. MDP är en degraderingsprodukt av peptidoglykan från
gramnegativa och grampositiva bakteriers cellvägg. Paneths celler som finns i
tarmens epitel, visar ett speciellt högt uttryck av NOD2/CARD15 genen [11], liksom tarmens makrofager [16].
Hos friska patienter inducerar mikrobiella ligander normalt en aktivering av
NFκB (ett intracellulärt proteinkomplex som kontrollerar DNA transkriptionen)
via NOD2/CARD15. Detta leder till aktivering av det medfödda immunförsvaret
med utsöndring av α- och β-defensiner, vilket utgör det första försvaret i mucosabarriären. Vidare utsöndras också proinflammatoriska cytokiner som TNF-α, IL1β och IL-8. Reaktionen anses vara väsentlig för upprätthållande av tarmbarriärens funktion. Mutationer på NOD2/CARD15 genen har diskuterats orsaka en
ökad T-cells koncentration som ett sekundärt svar på den insufficienta försvarsmekanismen. Enligt denna hypotes anses inte CS vara en typisk autoimmun sjukdom eftersom T-cellerna inte är riktade mot kroppsegna antigener, utan istället
följer felaktiga signaler från det medfödda immunförsvaret [16].
Ärftlighet
ITS drabbade patienter har visats ha sjukdomshistoria i familjen [9], vilket visats
vara vanligare för CS patienter än UK patienter. Tvillingstudier har kunnat påvisa
ett genetiskt upphov till CS [7, 10, 11 ]. Ärftligheten har kopplats till bland annat
kromosom 16 [10, 11], på vilken man genom kartläggning fann genen
NOD2/CARD15. Av de genetiskt mest betydande faktorerna till nedärvd CS har
variation av NOD2/CARD15 genen visats vara den mest avgörande faktorn [11]
och verkar vara specifik för CS patienter [12].
Miljöbetingade faktorer
Det har visats att de miljöbetingade faktorerna i sig inte framkallar sjukdom, vilket stöds av att sjukdomen sällan drabbar flera människor trots att de har levt ihop
i samma miljö. Däremot har rökning visats ha en förvärrande effekt på Crohns
sjukdomsförlopp [7, 10], uppkomst och främjande av recidiv [9].
Orala manifestationer
CS kan förutom de systemiska yttringarna även orsaka orala manifestationer, vilka inte alltid förekommer i samband med tarmsymtomen, utan kan om de uppkommer även föregå dessa med flera år [3, 7, 18]. De kan också uppstå parallellt
med eller efter ett skov av CS i magtarmkanalen [3, 5]. Oral Crohns sjukdom
(OCS) hos CS patienter har rapporterats förekomma i varierande grad, allt från 0,5
% - 80 % [7]. OCS har visats förekomma mer frekvent hos barn än vuxna [19, 20]
och har rapporterats vara vanligare bland män än kvinnor av författare såsom Dupuy och Bradley et al. [3, 17, 20].
Oral makroskopisk symtombild
De vanligaste orala makroskopiska symtomen är e.g. svullna läppar (makrocheilit)
och kinder, angulär cheilit, aftösa ulcerationer, kullerstensliknande uttryck i gingivan, djupa linjära ulcerationer (vanligast förekommande i omslagsvecket), slemhinnegingivit [19], hyperplastiska slemhinneveck och slemhinneutskott (bild 1).
Av dessa har hyperplastiska slemhinneveck visats vara patognomoniska för CS
[21], liksom makrocheilit, kullerstensliknande uttryck, linjära ulcerationer och
slemhinneutskott. [7]
De aftösa ulcerationerna nämns ofta i samband med CS. Afte har tidigare
kopplats till ett tidigt sjukdomsstadium [22] men kan som markör vara missvisan8
de på grund av dess höga prevalens hos patienter med UK och hos befolkningen i
helhet [19].
Bild 1. (A) Svullen läpp. (B) Kullerstensliknande uttryck. (C) Linjär vestibulär ulceration. (D) Slemhinnegingivit. (E) Hyperplastiska slemhinneveck. (F) Aftösa ulcerationer.
Oral histopatologisk symtombild
Den orala histopatologiska inflammationsbilden kännetecknar sig som infiltrat av
lymfocyter samt epiteloidcelliga makrofager med eller utan jätteceller av Langhanstyp och förekomst av granulom (bild 2), som ibland omringas av lymfocyter i
en tätare ansamling [18, Warfvinge G. personlig kommunikation]. Multinukleära
jätteceller har nämnts vara talande för CS [23]. Inflammationsbilder med förekomst av neutrofiler, eosinofiler samt plasmaceller har också beskrivits [1].
9
Epiteloidcelliga granulom anses vara en histopatologisk markör för CS [8,17],
men avsaknad av dessa kan inte användas som sjukdomsexkluderande faktor [7],
detta eftersom de inte alltid förekommer hos patienter drabbade av CS [8, 9].
Bild 2 (A) Langhanska jätteceller med perifert anordnade cellkärnor i anslutning till ett epiteloidcelligt
granulom (se pilar). (B) Två epiteloidcelliga granulom (se pilar) samt infiltrat av lymfocyter i bindväven.
Granulombildning. Det är främst makrofager och lymfocyter som är involverade
i granulombildning, som är ett skyddande svar på e.g. infektioner och närvaro av
kroppsfrämmande material. Efter att en mängd för makrofagerna icke nedbrytbara
ämnen har ansamlats förlorar makrofagerna sin motilitet och börjar ansamlas.
Därefter påbörjas modifiering till epiteloida celler, vilka kommer att utgöra granulomen [10].
De epiteloida granulomen som ses vid CS är såkallade ”non caseating granuloma” [4, 17], alltså inte ostiga granulom, och förknippas därmed inte med vävnadsnekros. Sammansmältning av makrofagers cytoplasma kan också leda till
bildning av jätteceller, vilka ses som stora multinuklerära celler [10] (bild 2A).
Granulomen ses i ECG som också yttras i andra sjukdomars histopatologiska bild.
Differentialdiagnoser för histopatologisk sjukdomsbild. Andra granulomatösa
sjukdomar med liknande orala histopatologiska symtombilder innefattar Melkersson-Rosenthal syndrom (MRS) och Meischer chelitis (chelitis granulomatosa).
Dessa är de huvudsakliga differentialdiagnoserna vid frånvaro av magtarmsymtom [17, 24] tillika sarkoidos [24]. Patienten får då den ospecifika diagnosen orofacial granulomatos (OFG) [18,19], som även innefattar CS, MRS och sarkoidos.
[17, 18, 21]. Granulomatösa inflammationer kan för övrigt också förekomma vid
svampinfektioner, catscratch disease, tuberkulos, främmandekroppsreaktion samt
vid Wegeners sjukdom [1] (se förklaringar sid 3), varför diagnos inte kan ställas
enbart utifrån den histopatologiska sjukdomsbilden.
Diagnostik
Crohns sjukdom har i stor utsträckning samma symtom som andra inflammatoriska tarmsjukdomar (ITS), e.g. ulcerös kolit (UK). CS uppträder i skov och kan visa
flera olika symtom, vilket gör att sjukdomen är svårdiagnosticerad [7]. Detta medför att flera år kan förlöpa innan diagnos fastställs [9].
Biopsier från tarmvävnaden tas i diagnostiskt syfte i vilka man efterlyser den
specifika inflammationsbilden. Ibland kan åtkomsten för biopsitagning i tunntarmen vara problematisk på grund av förträngning av lumen, då man istället kan
försöka ställa diagnos på colon [Bjelkenkrans K. personlig kommunikation]. Av
störst vikt för definitiv diagnos är endoskopi och en eventuell röntgenundersökning som kan påvisa sårbildning, ärrbildning och inflammation i tarmvävnaden
10
[2]. Vid frånvaro av lumenförträngning och misstanke om tunntarmsinvolverad
CS kan kapselendoskopi vara lämpligt. Röntgen tas framförallt vid förträngning
av tarmlumen [7].
Om patientens orala biopsi påvisar en symtombild överensstämmande med CS
men saknar symtom från magtarmkanalen sätter oralpatologerna, som tidigare
nämnts, diagnosen idiopatisk OFG tills ytterligare symtom förenliga med Crohns
sjukdom visar sig [18, 19].
Behandling
Behandlingen av inflammatoriska tarmsjukdomar syftar till att höja patientens
livskvalitet och lindra besvär genom att stilla inflammationsprocessen, supprimera
immunförsvaret, korrigera eventuell näringsbrist och förebygga komplikationer
[4,7]. Eftersom ITS är kronisk erhåller patienterna vanligtvis livslång behandling
[15].
De orala symtomen är ibland asymtomatiska och kan ibland självläka [19].
Genom tidigt insatt behandling är det möjligt att undvika ihållande smärta, svullnad och estetiskt otillfredsställande symtom [19].
Systemisk behandling
Den systemiska behandlingen av Crohns sjukdom består av olika läkemedelsalternativ, kostrekommendationer och i sista hand kirurgisk behandling.
Läkemedelsbehandling. Systemisk behandling av CS innefattar immunosuppressiva, antiinflammatoriska läkemedel eventuellt i kombination med steroider [4, 7,
17]. CS patienter kan också finna lindring av symtomen med hjälp av antidiuretiska, laxerande och smärtstillande läkemedel [7].
Antikroppar mot TNF-α (tumörnekrotiserande faktor-alfa) är ytterligare en
immunosuppressiv behandlingsmetod, som dessvärre innebär ökad risk för maligniteter [19], syftar till att hämma effekten av den kraftigt proinflammatoriska cytokinen TNF-α. Behandlingen har visats ge goda resultat gällande kontroll av
överaktiva inflammationer hos patienter med inflammatoriska tarmsjukdomar [7,
10]. Den positiva behandlingseffekten ses framförallt hos patienter med CS.
Dessvärre har effekten visats minska efter mindre än ett års tid [9].
Diet. Regression av sjukdom hos patienter med CS har visats kunna uppnås genom kontroll av det orala födointaget eller genom att ge födoersättning intravenöst, vilket skulle kunna förklaras av den då minskade och förändrade sammansättningen av tarmfloran [9]. Symtomen associerade med CS har visats minska
genom ett kvantitativt begränsat födointag och den därav reducerade tarmaktiviteten [7].
Kirurgisk behandling. Kirurgi är indicerat om sjukdomen ej är mottaglig för
medicinsk behandling och i de fall komplikationer såsom abscessbildning [7] obstruktion av tarmlumen, blödning och perforation (exempelvis filstelbildning till
hud eller andra organ) har utvecklats [4]. Kirurgisk borttagning av drabbade tarmsegment botar till skillnad från UK inte CS, eftersom recidiv av CS kan uppkomma i tidigare friska tarmsegment [9].
Lokal behandling
Lokal behandling kan bestå av injektion av steroider i de orala lesionerna alternativt topisk behandling med exempelvis steroidpasta [7, 17, 19, 21, 25]. Av vikt är
också att förbättra den orala hygienen [21].
11
Syfte och frågeställning
Syftet med studien är att med hjälp av monoklonal infärgning granska den histopatologiska bilden av Crohns sjukdom i munhålan hos 17 patienter som med
patologanatomisk diagnostik (PAD) knutits till diagnosen epiteloidcellig granulomatos (ECG). Detta med hopp om att förtydliga den specifika inflammationsbilden, med hänsyn till av makrofager bildade granulom, och för att eventuellt
indikera att orala manifestationer och biopsier skulle kunna underlätta diagnostiken av Crohns sjukdom.
De orala kliniska symtomen skulle kunna observera tandläkaren på eventuellt
misstanke om Crohns sjukdom och remittera patienten till en gastroenterolog,
vilket vidare kan leda till tidigare diagnos och behandling.
Studiens frågeställning har inriktats på hur sjukdomen yttrar sig histopatologiskt i orala biopsier samt dess eventuella betydelse som bidrag till diagnosen
Crohns sjukdom.
MATERIAL OCH METOD
I studien har orala vävnadssnitt färgats in med polymerbaserad immunohistokemisk teknik. Metodvalet baseras på den specifika infärgningen som erbjuds av
monoklonala infärgningsmetoder, dess minimala bakgrundsinfärgning samt visualiseringssystemets amplifierande infärgning (se metod).
Material
Patienter och positiv kontroll
Den immunohistokemiska laborativa studien som utgör basen i arbetet har inkluderat orala biopsier tillhörandes 17 patienter med PAD -diagnosen epiteloidcellig
granulomatos. Det vill säga samtliga vävnadssnitt som var tillgängliga med denna
diagnos förvarade i biobanken på avdelningen för oral patologi på Malmö Tandvårdshögskola. Från patienturvalet erhölls 23 biopsier (12 av patienterna hade ett
vävnadsprov, fyra patienter hade två och en patient hade tre vävnadsprov).
De formalinfixerade vävnadsbiopsierna var inbäddade i paraffin och snittades
till en tjocklek av tre mikrometer. Från varje vävnadsbiopsi snittades tre exemplar
för möjlighet till utprovning av optimal antikroppskoncentration och pilotstudie
för infärgning.
Slutligen inkluderades endast 23 vävnadssnitt immunohistokemiskt infärgade
med antikroppskoncentrationen 1:1000.
Det exkluderade materialet bestod av 31 reservsnitt som förblev utan infärgning, åtta snitt som färgades in med antikroppskoncentration 1:2000, fem snitt
som inte blev acceptabelt infärgade med antikroppskoncentration 1:1000 och två
snitt som ingick i en pilotstudie med avvikande antigen återskaffande metod (proteinkinas A i kombination med mikrovågor).
Patienternas remisser samlades in samt tillhörande tidigare hematoxylineosin
(HTX-eo) infärgade vävnadssnitt från respektive biopsi, vilka användes som referens vid mikroskopering.
Som positiv kontroll vid den immunohistokemiska infärgningen användes vävnadssnitt från lymfatisk vävnad i form av tonsiller, för att kunna säkerställa korrekt prestanda för använda reagenser.
12
Infärgningsmaterial
Värmeinducerad epitopåtervinning i TEG-buffertlösning erhölls med hjälp av
mikrovågor (MicroMED T/T Mega).
Till den primära antikroppsinfärgningen användes Monoklonal Mouse AntiHuman CD68, klon KP1 från DakoCytomation (Glostrup, DK). Endogent peroxidas blockerades med Dako REAL™ Peroxidase-Blocking Solution kod S2023.
För visualisering användes ett kit från Dako REAL™ EnVision™ Detection
System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse. Detektionsreagensen (ENV) utgörs av
en dextranryggrad varpå ett stort antal peroxidasmolekyler (upp till 100 HRP) och
sekundära antikroppar (upp till 20 antikroppsmolekyler) har kopplats. Substratsystemet består av kromogenet diaminobensidinlösning (DAB) som ger brun färg
och substratbuffert (väteperoxid) för spädning. [26]
Som motfärgning användes hematoxylininfärgning för att visualisera cellkärnorna, vilka då färgades blå. Xylen och etanol för dehydrering. Montering med
xylenbaserat monteringsmedel för ljusmikroskopi (Mountex - HistoLab).
Nikon Elipse 80i (ljusmikroskop) för mikroskopering och visualisering.
Metod
Antikroppar
Antikroppar tillhör gruppen immunoglobuliner (Ig). Dessa proteiner som finns i
blodet utsöndras av plasmaceller aktiverade av antigener [27].
Ig består av två olika par identiska kedjor varav två är lätta och två är tunga
(figur 1). Kedjorna binds ihop och stabiliseras av kovalenta disulfidbryggor. De
tunga kedjorna bestämmer molekylklass genom att uppvisa olika strukturella antigena egenskaper. De lätta kedjorna kan antingen vara av lambdatyp eller kappatyp. Fördelningen av dessa typer skiljer sig mellan olika djurarter och inom de
fem Ig-klasserna (IgG, IgA, IgM, IgD och IgE). [28].
Ig har till uppgift att igenkänna, neutralisera smittsamheten av- och märka invaderande mikrober för eliminering via olika effektormekanismer [29]. De verkar
e.g. genom opsonisering, vilket medför ökad möjlighet till fagocytos och aktivering av komplementsystemet via den klassiska vägen [27].
Figur 1 (A) Disulfidbindningar, (B) Lätt kedja,
konstant region, (C) Lätt kedja, variabel region,
(D) Tung kedja, variabel region, (E) Tung kedja,
konstant region, (F) Antigen-inbindningsställe.
Epitop/determinant
De molekyler som förekommer i kroppen är i sin helhet ofta för stora för Ig att
binda till, varför de enbart igenkänner ett litet fragment på molekylen som benämns epitop eller determinant. Makromolekyler såsom polysackarider, proteiner
13
och nukleinsyror kan inneha flera epitoper, varav alla kan utgöra inbindningsställe
för Ig [29].
CD68. Clusters of differentiation (CD) molekyler uttrycks på olika celler i immunförsvaret och har i denna studie använts som antigen till de primära antikropparna. Receptorfamiljen ”scavenger receptor” till vilken CD68 tillhör är också en
undergrupp till PRR, som beskrivits tidigare. Scavenger receptorerna utgör en stor
grupp molekyler med olika strukturer och funktioner. Gemensamt innehar de
funktionen att mediera upptaget av oxiderade lipoproteiner vid endocytos men
innefattas också mediera fagocytos av olika mikrober [29].
DakoCytomations immunohistokemiska teknik med monoklonala antikroppar
mot CD68 märker makrofager och andra celler med mononukleär fagocythärkomst. Cytoplasmiska granuler visar ett starkt uttryck av receptorn CD68, som
också uttrycks svagt på ytan till makrofager, monocyter, neutrofiler, basofiler och
NK-celler [30].
Immunohistokemi
I denna studie har immunohistokemisk teknik i form av EnVisionTM+ med monoklonala antikroppar använts. Denna infärgningsteknik utgör inte rutin vid diagnostik av ECG. Framställning av dessa sker genom en injektion av det önskade
antigenet i ett djur, vanligtvis möss på grund av ekonomiska aspekter [28]. Detta
orsakar en specifik immunoreaktion då lymfocyter igenkänner den specifika epitopen, börjar profiliera och bilda kloner. Därefter utvinns B lymfocyter från djurets mjälte [31] eller lymfknutor och sammansmälts med myelomceller, vilka då
kallas hybridom [28]. Hybridom besitter B-cellens antikroppsbildande kapacitet
och tumörcellens odödlighet. Dessa kan vidare klonas och ge antikroppsproduktion i stort sett obegränsade kvantiteter [28, 31]. EnVision TM+ som har använts i
denna studie är en indirekt immunohistokemisk metod som bygger på användandet av monoklonala primära antikroppar vilka binder till och märker önskad epitop, i detta fall receptor CD68. Till de primära antikropparna fäster de sekundära
antikanin eller antimus antikropparna, vilka är sammankopplade med en dextranpolymer på vilken horseradish peroxidas (HRP) är fästa (figur 2). HRP är ett enzym som klyver ett kromogensubstrat (pigment) efter applicering varpå makrofager färgas. För en utförlig metodförklaring hänvisas till bilaga 1.
Figur 2. Tvåstegs polymermetod – EnVision TM+ [28]. Figuren
visar antigenet till vilken den primära antikroppen fäster, och
vidare hur dextranpolymeren med flertalet enzymer och sekundära antikroppar fäster till den primära antikroppen.
14
De infärgade vävnadssnitten har granskats under ljusmikroskop av två observatörer. Faktorer såsom infärgningsteknikens genomslag, användbarhet och den epiteloidcelliga inflammationsbilden (med främsta hänseende till förekomst av makrofagansamlingar, epiteloidcelliga granulom och jätteceller) har noterats och vidare jämförts.
RESULTAT
Resultatet av den immunohistokemiska infärgningstekniken med monoklonala
antikroppar mot CD68 visade en specifik infärgning och tydliggjorde den typiska
inflammationsbilden med e.g. makrofagansamlingar, jätteceller och epiteloidcelliga granulom (bild 3) i jämförelse med motsvarande rutininfärgade snitt (HTX-eo).
Bild 3 (A) Hematoxylineosin infärgning (HTX-eo). (B) Immunohistokemisk infärgning med monoklonala antikroppar mot
CD68; (x) makrofagansamling (y) epiteloidcelligt granulom
(z) jättecell.
15
Makrofagansamlingar. I de immunohistokemiskt infärgade snitten visades makrofagansamlingarna tydligt i form av högre kromogen-koncentration i förhållande
till omkringliggande vävnad (vilket åskådliggörs i bild 3B och 4A).
I detta hänseende är de CD68 infärgade snitten fördelaktiga i jämförelse med
de HTX-eo infärgade snitten, i vilka makrofagansamlingar är svårare att urskilja.
(I 20 av 23 snitt förekom ansamlingar.)
Jätteceller. CD68 infärgningen ansågs åskådliggöra jätteceller likvärdigt med
HTX-eo infärgningen (bild 2 A, 3 och 5) i de snitt där jätteceller förekom.
(I 13 av 23 snitt förekom jätteceller.)
Epiteloidcelliga granulom. Granulomen är synliga med HTX-eo infärgning (bild
2) och visades i studien markeras tydligt med CD68 infärgning (bild 4 B), vilken
också bedömdes underlätta registrering av mindre granulom.
I 14 av 23 snitt sågs tydliga epiteloidcelliga granulom. I 12 av 23 snitt kunde
man med hjälp CD68 infärgningen urskilja koncentrationer av makrofager i ett
stadie som skulle kunna vara påbörjan till granulombildning. Makrofagerna förekom i en mer organiserad form än i ansamlingarna och celler med större cytoplasma kunde ses (bild 4 A).
Bild 4 (A) Makrofagansamlingar i bindväv, infärgade med anti CD68
(se pil). (B) Granulom i bindväv infärgade med anti CD68 (se pilar).
16
Bild 5 (A) Granulom med tre jätteceller (se pilar) infärgade med anti CD68. (B) Granulom med central jättecell infärgade med anti CD68.
Epiteloidcellig granulomatos. CS specifika inflammationsbild yttrar sig som
epiteloidcellig granulomatos. Denna har i studiens orala biopsier uppvisats med en
representativ bild av lymfocytinfiltrat, makrofager (också förkommande i
ansamlingar), multinukleära jätteceller ofta i anslutning till eller i de epiteloidcelliga granulomen.
I 7 av snitten tog infärgningen ojämnt över vävnaden. Detta visades framförallt
som svag infärgnig eller avsaknad av infärgning i periferin. I 17 av snitten kunde
svagt ljusbruna artefakter urskiljas. 15 av snitten uppvisade dessa i epitelet.
DISKUSSION
Den immunohistologiska infärgningen som användes i denna studie utgör inte
rutin vid diagnostik av ECG. Användandet av monoklonala antikroppar är en dyr
men tillförlitlig infärgningsteknik.
I de snitt som erhöll en acceptabel infärgning underlättade infärgningstekniken
lokalisering av granulom, jätteceller samt makrofagansamlingar (bild 4 och 5).
Detta kan tänkas vara till stor hjälp i snitt vars histopatologiska inflammationsbild
är svårtydd i en rutininfärgning (HTX-eo) samt underlätta diagnosticering; exempelvis då misstanke om OCS föreligger med orala makroskopiska symtom. Detta
genom att tydligare åskådliggöra ansamlingar av makrofager, mindre granulom
och påbörjan till granulom. Därmed skulle oralpatologen kunna ställa diagnosen
ECG och utesluta andra sjukdomstillstånd.
Både multinukleära jätteceller och epiteloidcelliga granulom kan tydligt urskiljas i båda infärgningarna (bild 2 och 5). Däremot visades CD68 infärgningen ge
en tydligare bild av makrofagansamlingar än HTX-eo infärgningen, vari ansamlingarna kan vara svåra att urskilja. Därtill försäkras observatören om att granulomen består av modifierade makrofager.
Infärgningstekniken utfördes manuellt på laboratorium, vilket innebär risk för
metodavvikelser till följd av den mänskliga faktorn. Resultatet av infärgningen
visades vara ojämn trots noga utförande. Avsaknaden av infärgning, framförallt
förekommande i vävnadssnittens periferi, kan tänkas bero på att snittet hunnit
torka under förbehandlingsprocessen och därmed inte kunnat vätas av infärgningsvätskorna. Detta är ett av fabrikören DakoCytomation känt problem (även
vid maskinell infärgning) och metoder för att komma underfund med problemet är
under utredning. De svagt ljusbruna artefakter, som framförallt förekom i epitelet,
förklaras av molekylstorleken på dextranpolymeren (se dextranbackbone, figur 1)
och dess hydrofoba natur. Storleken och hydrofobiciteten gör att molekylen tenderar att bli ”klibbig”. Problemet skulle kunna åtgärdas genom att lägga till flera
17
sköljningar efter appliceringen av den sekundära antikroppen (bilaga 1 steg 12),
tillsätta Tween (detergent) för att minska glasets ytspänning eller öka tiden för
sköljning efter detta steg [mailkorrespondens Kiiveri P. Malmö tandvårdshögskolas kontaktperson på DakoCytomation]. Den felaktiga infärgningen saknar emellertid relevans för studiens resultat, eftersom artefakterna kan urskiljas från den
specifika infärgningen av CD68. Detta genom utbredningen, den avvikande svagare nyansen och den vanliga placeringen i epitelet var de epiteloidcelliga granulomen inte förekommer.
Infärgning med monoklonala antikroppar är en tillförlitlig metod som genom
EnVisionTM+ systemets indirekta infärgningsteknik möjliggör selektiv infärgning
av CD68. EnVisionsTM+ systemets dextran polymerer möjliggör högre färgkoncentration på markerade områden, eftersom fler enzym kan verka på dessa. Ytterligare en positiv egenskap utgörs av det faktum att systemet använder sig av sekundära antikroppar (mot kanin- eller musantikroppar) [28], vilket medför att ett
stort urvals spektra av primära antikroppar från olika fabrikörer är att tillgå. Alltså
är inte användaren lika begränsad av fabrikörernas utbud av primära antikroppar,
som vid användning av den direkta polymerbaserade immunohistokemiska infärgningstekniken.
I studien jämfördes, som tidigare nämnts, de immunohistokemiskt infärgade
vävnadssnitten med tidigare hematoxylininfärgade vävnadssnitt (bilder ovan) för
att kunna bedöma resultatet av CD68 infärgningen. Strukturerna i snitten är inte
helt jämförbara då snittens djup i biopsin varierade. Detta antas bero på att avverkning av biopsin vid varje snittningstillfälle, i syfte att åstadkomma en jämn
snittyta, har medfört att de HTX-eo infärgade snitten och snitten använda i denna
studie togs från olika djup i vävnaden. Detta innebär alltså att samma inflammationsbild inte alltid är entydig i snitt kommande från samma patient.
Om patognomoniska fynd ses vid den orala undersökningen är biopsi indicerad
[7]. Den granulomatösa inflammationsbilden har beskrivits vara den samma i
munnen som i resten av magtarmkanalen [4,5,15].
Makrofagansamlingar har noterats i snitt från den CS inflammerade tarmvävnaden, vilket då har associerats med ett tidigt sjukdomsstadium [22]. Ansamlingar
av makrofager har även visats i de flesta CD68 infärgade orala snitten i denna
studie. Ansamlingarna skulle med tanke på granulombildningen kunna observera
oralpatologerna på en påbörjad utveckling av ECG och misstanke om CS. Detta
kan vidare leda till tidigare ställd CS diagnos av gastroenterologerna [19], genom
att patienten erhåller tidigare remiss vid förekomst av gastrointestinala symtom.
Vidare skulle ett samarbete mellan tandläkare och gastroenterolog kunna upprättas [1] för att erbjuda patienten en fullgod heltäckande behandling [5, 19]. Även
med tanke på att identifieringen av de orala symtomen kan tänkas vara svår för
vårdpersonal utan specifik kunskap om munhålan, e.g. allmänläkare [19].
De orala symtomens betydelse för CS diagnostiken styrks e.g. av rapporter som
visar att patienter med en oral granulomatös inflammationsbild, men utan tarmsymtom, diagnosticerats med CS genom ileokolonoskopi och röntgendiagnostik
till följd av att orala symtom upptäckts [19]. I enlighet med detta kan upptäckten
av OCS tyckas vara av extra betydelse för dem vars orala symtom föregår de gastrointestinala symtomen, vilket visats kunna förekomma i flera studier [1, 3, 7,18]
varför symtomens betydelse för tidig diagnos [1] bör uppmärksammas.
Fördelarna med inklusion av OCS i CS diagnostiken utgörs utöver det som
redan nämnts av att munhålan är lättåtkomlig för biopsitagning [19, 25], visuell
undersökning [19], till skillnad från tarmen, samt de vanligtvis rutinmässiga tandläkarbesöken. Dock inkluderar CS diagnostiken varken orala manifestationer eller
biopsier i Sverige idag.
18
Denna studie uppmärksammar OCS och dess relation till CS i övrigt samt ger
en indikation på att samarbetet mellan gastroenterologer och tandläkare skulle
kunna vara av betydelse för diagnostiken. Detta framförallt då det har framkommit att läkare inte alltid känner till att tandläkare skulle kunna erbjuda hjälp i diagnostiken av Crohns sjukdom [5].
Fortsatt metodutveckling för att övervinna de brister som dextranpolymeren
ger upphov till samt den ännu oförklarade avsaknaden av infärgning som visats i
vissa vävnadssnitt skulle vara önskvärt. Nästa steg skulle kunna vara studier med
fokus på fördelarna av ett upprättat samarbete mellan tandläkare och gastroenterologer för att underlätta diagnosticering och möjliggöra tidigare diagnos. Ytterligare intressanta frågeställningar berör eventuell koppling mellan förekomst av OCS
och samtidigt skov av CS, eller ett möjligt samband mellan OCS och lokalisering
av CS-skov i tarmkanalen.
KONKLUSION
I Sverige lider ca 0,2 % av befolkningen av Crohns sjukdom, som är en ännu inte
etiologiskt klarlagd multifaktoriell sjukdom med autoimmuna, ärftliga och miljöbetingade påverkande faktorer. Sjukdomen kan orsaka orala makroskopiska manifestationer ofta associerade med CS och orala biopsier kan uppvisa en histopatologisk bild av epiteloidcellig granulomatos med lymfocytinfiltration, makrofagansamlingar, jätteceller och epiteloidcelliga granulom, vilka har ansetts typiska för
CS.
Diagnos av CS fastställs genom endoskopi, röntgenundersökning eller biopsi
från tarmvävnad vari man eftersöker den specifika inflammationsbilden. Trots att
diagnos inte enbart kan fastställas från orala biopsier, skulle dessa kunna bidra till
tidigare diagnos. Studien visar att den representativa inflammationsbilden även
kan ses i munhålan, vilket indikerar att vävnadsrepresentation från biopsier med
orala manifestationer kan signalera misstanke om Crohns sjukdom. Inflammationsbilden har i studien förtydligats med hjälp av immunohistokemisk makrofaginfärgning. Då munhålan med sin lättillgänglighet möjliggör okomplicerad visuell undersökning och biopsitagning samt då besök hos tandläkare utförs rutinmässig, kan detta bistå med klinisk information samt histopatologiska kännetecken för
att leda diagnosticeringen framåt och minska patienternas lidande genom tidigare
insatt behandling, varför ett samband mellan tandläkare och läkare förespråkats.
19
REFERENSER
1. Ojha J., Cohen D. M., Islam N. M., Stewart C. M., Katz J., Bhattacharyya I.
Gingival involvement in Crohn disease. J.Am.Dent.Assoc. 2007
Dec;138(12):1574-81; quiz 1614-5.
2. Danielsson Åke. Invärtesmedicin. 8 red. Lund: Hedner Pavo Lars; 2004.
3. Dupuy Alain, Cosnes Jacques, Revuz Jean, Delchier Jean-Charles, Gendre
Jean P., Cosnes Anne. Oral Crohn Disease: Clinical Characteristics and Longterm Follow-up of 9 Cases. Arch.Dermatol. 1999 April 1;135(4):439-442.
4. Ganesh R., Suresh N., Ezhilarasi S., Rajajee S., Sathiyasekaran M. Crohn's
disease presenting as palatal ulcer. Indian J.Pediatr. 2006 Mar;73(3):229-231.
5. Katz J., Shenkman A., Stavropoulos F., Melzer E. Oral signs and symptoms in
relation to disease activity and site of involvement in patients with inflammatory bowel disease. Oral Dis. 2003 Jan;9(1):34-40.
6. Lourenco S. V., Hussein T. P., Bologna S. B., Sipahi A. M., Nico M. M. Oral
manifestations of inflammatory bowel disease: a review based on the observation of six cases. J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol. 2010 Feb;24(2):204-207.
7. Fatahzadeh M. Inflammatory bowel disease. Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.Oral Radiol.Endod. 2009 Nov;108(5):e1-10.
8. Freeman H. J. Granuloma-positive Crohn's disease. Can.J.Gastroenterol. 2007
Sep;21(9):583-587.
9. Shoenfeld Yehuda, Rose Noel R. Infection and autoimmunity. Amsterdam:
Elsevier; 2004.
10. Rubin Raphael, Strayer S., David. Rubin's Pathology: clinicopathologic foundations of medicine. 5 red. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins;
2008.
11. Van Limbergen J., Wilson D. C., Satsangi J. The genetics of Crohn's disease.
Annu.Rev.Genomics Hum.Genet. 2009;10:89-116.
12. Masters S. L., Simon A., Aksentijevich I., Kastner D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammatory disease (*). Annu.Rev.Immunol. 2009;27:621-668.
13. Lapidus A. IBD ökar starkt - ännu oklart varför. 2009;106(45):2980-2982.
14. Lapidus A. Crohn's disease in Stockholm County during 1990-2001: an epidemiological update. World J.Gastroenterol. 2006 Jan 7;12(1):75-81.
15. Glaudemans A. W., Maccioni F., Mansi L., Dierckx R. A., Signore A. Imaging of cell trafficking in Crohn's disease. J.Cell.Physiol. 2010 Jun;223(3):562571.
20
16. Vavricka S. R., Rogler G. New insights into the pathogenesis of Crohn's disease: are they relevant for therapeutic options? Swiss Med.Wkly. 2009 Sep
19;139(37-38):527-534.
17. Bradley P. J., Ferlito A., Devaney K. O., Rinaldo A. Crohn's disease manifesting in the head and neck. Acta Otolaryngol. 2004 Apr;1243):237-241.
18. Odell E. W., Morgan P. R. BIOPSY PATHOLOGY OF THE ORAL TISSUES. 1 red. London: Chapman & Hall; 1998.
19. Rowland M., Fleming P., Bourke B. Looking in the mouth for Crohn's disease.
Inflamm.Bowel Dis. 2010 Feb;16(2):332-337.
20. Knuuttila M., Tervonen T., Pernu H. Allmänsjukdomar som predisponerande
faktorer vid parodontala förändringar. 2004(Tandläkartidningen årg 96 nr
2):36-44.
21. Lindhe Jan, Lang P., Niklaus, Karring Thorkild. Clinical Periodontology and
Implant Dentistry. 5 red. Oxford: Blackwell Munksgaard; 2008.
22. Sankey E. A., Dhillon A. P., Anthony A., Wakefield A. J., Sim R., More L., et
al. Early mucosal changes in Crohn's disease. Gut 1993 Mar;34(3):375-381.
23. Gargiulo A. V., Ladone J. A., Toto P. D., Logiudice J. Crohn's disease: early
detection by gingival biopsy. Periodontal Case Rep. 1989;11(1):20-22.
24. William T., Marsch W. C., Schmidt F., Kreft B. Early oral presentation of
Crohn's disease. J.Dtsch.Dermatol.Ges. 2007 Aug;5(8):678-679.
25. Daley T. D., Armstrong J. E. Oral manifestations of gastrointestinal diseases.
Can.J.Gastroenterol. 2007 Apr;21(4):241-244.
26. DAKOCytomation. Metodförklaring: Dako REAL™ EnVision™ Detection
System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse K5007. 201205 (Third edition).
27. Widmaier Eric P., Raff Hershel, Strang Kevin T., Vander Arthur J. Vander's
Human Physiology :the mechanisms of body function. 11 red. Boston:
McGraw-Hill Education; 2008.
28. Atwood Karen, Bisgaard Kirsten, Bloom J. K., etc. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. 4 red. California: DAKO; 2006.
29. Abbas Abul K., Lichtman Andrew H., Pillai Shiv. Cellular and molecular immunology. 6 red. Philadelphia: Saunders/Elsevier; 2007.
30. DAKOCytomation. Produktblad: Monoclonal Mouse Anti-Human CD68.
2003 20-01-03.
31. Carson Freida L. Histotechnology :a self-instructional text. 2 red. Chicago:
ASCP Press; 1997.
21
32. Collin P. H. Medicineengelsk-svensk-engelsk. Stockholm: Norstedt; 1992.
33. Regezi Joseph A., Sciubba James J., Jordan Richard C. K. Oral pathology:
clinical pathologic correlations. 5 red. Philadelphia, Pa.; Edinburgh: Elsevier
Saunders; 2008.
22
Bilaga 1
Immunohistokemi CD68 - metodbeskrivning
1. Förberedelser:
Paraffinblocken innehållandes vävnadsbiopsierna snittas till 3 µm.
Vätskorna (se nedan) rumstempereras.
2. Avparaffinering av snitt:
a. 2 x 10 min i xylenbad (under tiden förbereds 750 ml TEG buffert för senare användning, se antigenretrieval)
b. 2 x 5 min i absolut alkohol (99% alkohol)
c. 2 x 3 min i 96% alkohol
d. 5 min i destillerat vatten
3. Antigen retrieval:
Sätt glasen i TEG buffertlösning i en buffertbehållare, placera i mikrovågsugn. Program val: antigen retrieval (98C-S3m 40s- 700 ml) i 25 min
4. Svalna
Ta ut bägaren från mikrovågsugnen och låt svalna i 20 min.
Antikroppslösning - spädning
Undertiden utförs spädning av antikroppslösningen 1:1000 med antibodydiluent enligt följande:
1 ml (1:500) CD68 antikroppslösning + 1 ml spädningsvätska (antibody
diluent DAKO) = 2 ml 1:1000 CD68 antikroppslösning.
5. Inkubering – TRIS
Inkubera glasen i destillerat vatten i 5 min.
Överför glasen till TRIS i 5 min.
- Förbered under tiden fuktkammare
6. Paraffinring - BSA/TRIS – fuktkammare
Torka glasen runt vävnaden, rita en ring kring vävnaden mha paraffinpenna. Se till så att paraffinet lägger sig utanför snittets infärgningsyta i ett
jämntjockt lager utan avbrott.
Tillsätt BSA/TRIS – 100µl per vävnadssnitt . Inkubera 5 min i fuktkammare.
7. Inkubering - TRIS
Skölj bort BSA/TRIS med TRIS-lösning, inkubera 2 x 3 min i separata
TRIS kyvetter.
8. Antikropp – CD68
Torka av glasen och lägg dem därefter i fuktkammare.
Tillsätt 100 µl primär-antikropps-lösning med CD68 monoklonal mouse
antihuman spädning 1:1000 (med antibodydiluent) per snitt.
Låt stå i 25 min.
9. Inkubera i TRIS
Skölj av glasen och inkubera 2 x 3 min i TRIS.
Bilaga 1
10. HPBK – Väteperoxidas blocking solution
Torka av glasen. Lägg i fuktkammare. Tillsätt 150µl HPBK per vävnadssnitt. Låt stå 5 min.
11. Inkubera i TRIS
Skölj glasen med TRIS-lösning och inkubera därefter 2 x 3 minuter i
TRIS-lösning.
12. ENVISION – sekundär antikropp märkt med HRP
Torka av glasen. Lägg i fuktkammare.
Tillsätt 4 droppar lösning med sekundärantikropp (ENV) och inkubera i 20
min.
Förbered spädning av DAB (kromogen) lösning (1:50) ca 7 minuter innan
gången inkuberingstid för ENV.
Ex för 16 glas:
48µl DAB (diaminbenzidin) + 2400 µl substratbuffert (väteperoxidas).
13. Inkubera - TRIS
Skölj av glasen och inkubera 2 x 3 min i TRIS-lösning.
14. Tillför DAB lösning
Torka glasen runt snittet, lägg dem i fuktkammare och tillsätt 100 µl kromogen per vävnadssnitt (DAB + substratbuffert). Inkubera i 15 min.
15. Inkubera - TRIS
Skölj med destillerat vatten, inkubera i TRIS-lösning i 5 min.
16. Hematoxylin
Torka av glasen och lägg dem i fuktkammare. Tillsätt 150 µl hematoxylin
per vävnadssnitt. Låt stå i 2 minuter.
17. Dehydrering & Montering
Skölj glasen med destillerat vatten. Inkubera i destillerat vatten i 3 min.
a. Dehydrera i alkohol 96 % i 3 min
b. Dehydrera i absolut alkohol 99 % i 2 min.
Montering med xylenbaserat monteringsmedel för ljusmikroskopi (Mountex –
HistoLab).